一种多环内酰胺化合物作为选择性Toll样受体拮抗剂在药物中的用途的制作方法

本发明涉及一种多环内酰胺化合物作为选择性toll样受体拮抗剂在药物中的用途，具体来说是可以抑制tlr1、tlr2、tlr3、tlr6配体诱导的小鼠巨噬细胞炎症因子表达，从而可制备成抗炎和免疫刺激抑制剂药物。

二、技术背景

tlrs的活化启动天然免疫应答以及诱导炎症反应，当病原体入侵机体时，tlrs能够识别危险信号，引发立即的固有免疫应答，清除病原体的感染。除此之外，研究表明tlrs与人体的许多慢性疾病都有密切关系(cancerres.，2005，65(24)：11771-11778)。

tlrs在天然免疫中起着重要作用，可以帮助机体抵抗细菌和病毒入侵。tlr2/tlr6或tlr2/tlr1可以识别分支杆菌、螺旋体、支原体和酵母菌的胞壁成份；tlr4/cd14/md-2形成复合体识别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的胞壁脂多糖成份；tlr5识别细菌的鞭毛蛋白；以上tlrs活化，产生一系列炎性因子介导抗菌免疫应答。tlr4或tlr2可以识别某些病毒的包膜糖蛋白，介导早期的抗病毒作用。因此，当病原体入侵机体是，tlrs即可识别相关病原分子，启动免疫应答(biochem.j.，2009，422(1)：1-10)。

tlr9亚家族包括tlr3、tlr7、tlr8和tlr9，位于细胞内的内涵体，识别病原微生物的核酸成分。由于人和病原体的核酸成份结构非常相似，人的核酸成份活化tlr9亚家族受体，就可能导致自身免疫性疾病的发生。tlrs在其他自身免疫性疾病包括脑脊髓炎、类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病，以及自身免疫性心肌炎的发病中也起着一定的作用。抑制tlr4活化能够减轻实验性关节炎的临床表现。

变态反应性疾病医学上也叫做“过敏”，比较常见的包括过敏性鼻炎、过敏性支气管炎、过敏性哮喘、过敏性皮炎等。众所周知，th1/th2细胞失衡、以th2为主的免疫应答是变态反应性疾病形成的免疫学机制。利用tlrs的配体能够诱导机体的免疫应答偏向th1为主，可以将其用来治疗变态反应性疾病。比如，tlr9的配体cpg治疗哮喘的临床试验已进入ii期；tlr4的配体mpl用于治疗过敏性鼻炎的临床试验也进入了临床ii期。

寄生于肠道内的菌群失调对炎性肠病的形成有一定促进作用，当肠上皮损伤时相当于增加了上皮细胞与细菌及其代谢产物接触的机会，在急性炎症时，tlr4阳性的巨噬细胞会迁移到黏膜，这些炎症细胞同时高表达tlr4的复合受体cd14，提高ibd的肠黏膜对lps的反应性，同时在炎性肠病患者身上可观察到tlrs(包括tlr4)的表达增高，另外肠上皮细胞tlr4信号可能与结肠的癌变过程有关(生理科学进展，2011，(05)：340-346)。

研究显示活动期系统性红斑狼疮(sle)患者tlr4mrna表达水平较健康者和sle稳定期表达水平升高，而sle活动期和稳定期tlr2mrna较健康者降低，说明sle与tlr2和tlr4有一定关系。matthew等发现tlr4基因asp299gly多态性和血管炎症、冠状动脉减弱、糖尿病减少相关，提示下调tlr4表达为治疗糖尿病等疾病提供了另一种策略。中枢神经系统炎症反应在阿尔茨海默病(ad)发病机制中的作用日益受到关注，其中以toll样受体4(toll-likereceptor4，tlr4)为代表的toll样受体被认为参与了ad的炎性反应，在其发病机制和病理生理过程中发挥了重要角色。cao等研究了tlr4在小鼠脑缺血再灌注损伤的作用，结果显示tlr4缺失的小鼠通过减少炎症细胞因子的表达减弱了脑缺血再灌注损伤，tlr4可能成为治疗相关缺血再灌注损伤疾病的一个新的靶点。tlr4在识别革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖(lps)过程中发挥重要作用，lps激活tlr4下游通路是革兰氏阴性败血症的主要病理基础，因此，tlr4成为治疗败血症的一个新型靶标(nature，2005，433(7028)：887-892；nat.rev.immunol.，2006，6(11)：823-835；arthritisrheum.，2007，56(9)：2957-2967)。

现今，tlrs已经成为治疗相关疾病的重要靶点，科学家们研发了许多种类的调控剂，其中部分药物正在进行临床评估(thelancet，2006，368(9538)：855-863；mol.pharmacol.，2006，69(4)：1288-1295；expertopin.invest.drugs，2007，16(7)：935-950；j.biol.chem.，2012，287(20)：16121-31)。

黑三棱系黑三棱科植物黑三棱sparganiumstoloniferumbuch-ham的块茎，其去皮干燥块茎为中药三棱，味辛、苦，性平，具有祛瘀通经、破血消症、行气消积等功效。药理学研究表明ssnb可以抑制lps(tlr4配体)、pam3csk4(tlr1和tlr2配体)、fsl-1(tlr2和tlr6配体)诱导的小鼠巨噬细胞炎症细胞因子的表达，并且可以干扰myd88和tlr2、tlr4相互作用，因此ssnb具有选择性抑制tlrs的活性；进一步在小鼠体内的实验表明，ssnb可以抑制lps诱导的脾细胞炎症，甚至在100μm水平对人体的多种细胞无细胞毒性。同时，liang等发现ssnb能以剂量依赖的方式减弱lps诱导的人脐静脉内皮细胞中白介素-1β和单核细胞趋化蛋白的表达，这一发现表明ssnb可以抑制人内皮细胞的炎症(j.biol.chem.，2011，286(30)：26470-26479；arch.pharmacalres.，2013，36(7)：1-7；cn103483348a，2013)。

在前期研究中，我们成功发展了氧杂蒽类的黑三棱内酯b(sparstoloninb，简称ssnb)的人工合成方法(专利申请号：201310405476.9)，解决了该类化合物的来源问题。在后续研究中，我们以黑三棱内酯b为起始原料，合成了一系列黑三棱内酯b的非天然内酰胺衍生物，并发现该类化合物具有不错的抗肿瘤活性(专利申请号：201510071922.6)，进一步研究表明，该类化合物具有比toll样受体拮抗更好的toll样受体拮抗活性。

三、

技术实现要素：

本发明旨在提供一种多环内酰胺化合物作为选择性toll样受体拮抗剂及可用作制备抗炎和免疫刺激抑制剂的用途。

申请人遴选的化合物为具有如下结构特征的多环酰胺类化合物或其药学上可接受的盐：

其中，r为氢、c1-6烷基、c5-10芳基、c2-8杂环芳基、cnh2nx、or1或nr2r3，其中，n为1-6，x为乙烯基、乙炔基、c5-10芳基、c2-8杂环芳基、羟基、c1-4烷氧基、氨基、n，n-双c1-4烷基氨基、c2-5杂环烷基、羧基、酰胺基、磺酰胺基、c1-4烷基氧羰基、氰基或硝基，r1为氢、c1-4烷基、苄基或甲氧基苄基，r2和r3分别为氢、c1-4烷基、苄基、甲氧基苄基或r2、r3与n原子共同形成4-7元环。

进一步优选方案是n为1-3，x为乙烯基、苯基、羟基、叔丁氧基、氨基、n，n-二甲基氨基、c2-5氮杂环烷基、羧基或酰胺基，r1为氢、甲基、异丙基、叔丁基、苄基，r2和r3分别为氢、甲基或r2、r3与n原子共同形成5或6元环。

更进一步的优选方案是r为氢、甲基、异丙基、叔丁基、环丙基、环戊基、环己基、苯基、吡啶基、烯丙基、苄基、羟基、羟基乙基、叔丁氧基、氰基乙基、氨基、氨基丙基、n，n-双甲基氨基、吡咯啶基、哌啶基。

所述药学上可接受的盐为无机酸盐或有机酸盐；所述无机酸盐选自下述任意一种无机酸形成的盐：盐酸、硫酸和磷酸；所述有机酸盐选自下述任意一种有机酸形成的盐：乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对甲苯磺酸。

本发明所述的多环内酰胺化合物的制备方法可以按专利《黑三棱内酯b衍生物及其制备方法和用途》(专利申请号：201510071922.6)提供的方法进行制备。

四、附图说明

附图1为多环酰胺类化合物结构。

五、具体实施方案

以下实施例描述了本发明的方法和组合，但并不限于此。通常遇到并且对本领域技术人员显而易见的对这些条件和参数的其他适宜修改和改变都在本发明的精神和范围。

本发明所涉及的氧杂蒽酮染料iv可用如下方法合成。首先在氯化铜催化下，苯酚衍生物和对甲基邻硝基苯甲醛反应，制备氧杂蒽酮骨架，然后通过溴代、氧化、witting反应，获得目标化合物。

巨噬细胞的分离培养：向小鼠腹腔注释巯基乙醇酸盐溶液(3ml，3％)，三天后在向小鼠腹腔注释pbs(10ml)收集细胞。收集的细胞在还有10％fbs的deme培养液中培养1小时，然后用不含血清的deme培养液洗脱没有贴壁的细胞，贴壁细胞再用合适培养液培养。当用lps处理细胞时，细胞现在含有fbs(0.25％)的deme培养液中培养6-24小时，然后加入一定浓度的lps和本发明中的代表性多环内酰胺内化合物(如图1)。细胞用dpbs容易洗涤2次后，破壁收集rna或者蛋白。

mtt法测活性测试：多环内酰胺化合物的活性用细胞计数法，根据mtt试剂盒说明书操作程序测定。

定量pcr：根据试剂盒说明书，用trizol(invitrogen，carlsbad，ca))和rneasytmminikit(qiagen，valencia，ca)提取细胞总rna。应用faststartuniversalsybrgreenmaster(rox)(roche，indianapolis，in)试剂盒，在eppendorfrealplex2mastercycler(eppendorf，hamburg，germany)pcr仪上对rna进行定量扩增。所用引物为：mouse18srna(internalcontrol)：5’cgcggttctattttgttggt3’(forward)and5’agtcggcatcgtttatggtc3’(reverse)；mousetnfα：5’cgtcagccgatttgctatct3’(forward)and5’cggactccgcaaagtctaag3’(reverse)；mouseil-6：5’agttgccttcttgggactga3’(forward)and5’tccacgatttcccagagaac3’(reverse)；mouseil-1β：5’gcccatcctctgtgactcat3’(forward)and5’aggccacaggtattttgtcg3’(reverse)；mousetlr4：5’gctttcacctctgccttcac3’(forward)and5’gaaactgccatgtttgagca3’(reverse).扩增方法：95℃10min，然后40个以下循环95℃，10s；60℃，15s；68℃，20s。

数据处理方法：多组数据比较时应用one-wayanova方法。如果数据符合高斯分布，进一步用bonferroni’smultiplecomparisons进行分析，否则应用kruskalwallistest和dann’smultiplecomparison对数据进行处理。当只有一组数据时，应用student’s方法。(p＜0.05)

实验结果发现，代表性多环酰胺类化合物1-18，均可以抑制lps(tlr4配体)、pam3csk4(tlr1和tlr2配体)、fsl-1(tlr2和tlr6配体)诱导的小鼠巨噬细胞炎症细胞因子的表达，并且可以干扰myd88和tlr2、tlr4相互作用，因此可以说，本专利中的多环内酰胺类化合物是一种选择性的tlrs拮抗剂。

更重要的是，这些化合物在小鼠体内可以抑制lps诱导的脾细胞炎症，甚至在100μm水平对人体的多种细胞均无明显的细胞毒性。同时还发现，本专利中的多环内酰胺，能以剂量依赖的方式减弱lps诱导的人脐静脉内皮细胞中白介素-1β和单核细胞趋化蛋白的表达，这一发现表明本专利中的多环内酰胺类化合物，可以抑制人内皮细胞的炎症。