葡甘聚糖糖基化的SiO2纳米颗粒及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，涉及葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

巨噬细胞(macrophage)是在各类慢性炎症疾病的发生发展中起到重要作用的免疫细胞,包括动脉粥样硬化，哮喘，炎症性胃肠炎，类风湿性关节炎及组织修复等。活化的巨噬细胞刺激促炎因子的大量分泌，从而促进炎症反应的发生发展。当机体内组织发生炎症时，血液中的单核细胞被招募至炎症部位，并分化成活化的巨噬细胞，浸润粘膜层，分泌促炎细胞因子，从而导致上皮细胞及腺体凋亡、屏障功能丧失、组织坏死、肉芽肿形成和纤维化。例如炎症性肠病(inflammatoryboweldisease)和胃溃疡(gastriculcer)是典型慢性的，易复发的炎症性疾病，其病因和发病机制比较复杂，诊断和治疗也相当棘手，但针对巨噬细胞的治疗是当今热门研究方向之一，通过新型分子治疗策略来抑制巨噬细胞的活化状态，降低炎症因子的表达水平，从而缓解炎症性疾病的发展；创伤愈合(woundhealing)是一个复杂的生物学过程，创伤后愈合的各个阶段均有大量的蛋白分子进行诱导和调控，这些因子在合成和分泌后，通过作用于机体细胞及细胞间质，调控组织愈合的均衡发展。既刺激组织修复，又限制组织的过度增生，以维持愈合的动态平衡。巨噬细胞通过表型转换及相关细胞因子的表达，参与整个组织修复、再生(tissuerepair、regeneration)的过程。

魔芋多糖(konjacglucomannan，以下简称kgm)为中性非离子型线形多糖，是由葡萄糖和甘露糖以β-1，4糖苷键结合而形成的一种高分子化合物，有很高的粘度，胶凝性、持水性、生物相容性等，这些理化性质使之具有很好的应用前景。kgm具有多种生物活性，如抗肿瘤、改善肠道功能、减肥、降血糖作用等，现已被应用于临床、医药等领域，对kgm的进一步研究和深度开发利用已经引起人们的广泛关注。近年来，多糖聚合物的研究进入了一个新的层次，随着对其构效关系的深入研究，发现了部分药理作用的作用机制，为其在医药、食品领域的应用提供了理论依据，加快了天然多糖聚合物的开发利用。多糖的生物活性依赖其与受体相互识别、相互作用的过程中，而天然的聚多糖作为高分子大大限制了对其本身生物活性的探索。白芨多糖(bletillastriatapolysaccharide，以下简称bsp)是一种从传统中药白芨提取而得的甘葡聚糖，由4分子甘露糖和1分子葡萄糖组成的中性非离子型线形甘露聚糖，具有抗炎、促凝血、抗病毒、抗肿瘤，抗氧化等生物学活性。白芨多糖是安全高效的医药原料，具有优良的理化性质，相当具有发展前景的生物材料。

对纳米颗粒表面通过共价结合引入功能分子作为一种制备新型材料的方法得到人们的广泛关注和深入研究，并已在催化、电子以及生物和化学检测等领域取得重要进展，这种修饰过的颗粒可以直接作为一种功能材料加以应用。sio2纳米颗粒由于其优异的物理化学性能，从工业生产到基础研究，在众多领域都有广泛的应用。特别是单分散的sio2胶体粒子，具有单分散性，尺寸在大的范围可调性，以单分散的sio2纳米颗粒为单元构筑的新型纳米材料具有潜在的应用前景。目前，有关甘露多糖在巨噬细胞上的研究局限于靶向药物载体的构建。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒。

本发明的另一目的是提供该葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒的制备方法。

本发明的又一目的是提供该葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒，由葡甘聚糖与sio2通过共价键相互连接得到的粒径为10-1000nm的颗粒。

所述的葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒，优选通过不同sio2尺寸控制葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒的粒径。

所述的葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒优选通过以下方法制备的到：

(1)制备氨基化葡甘聚糖；

(2)cdi法活化sio2表面羟基得到含有咪唑基团的sio2；

(3)将氨基化的葡甘聚糖与含有咪唑基团的sio2反应得到葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒。

所述的葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒进一步优选通过以下方法制备的到：

(1)氨基化葡甘聚糖制备

称取葡甘聚糖于dmso中，加热溶解2～4h，40～60℃，冷却至室温，加入过量的羰基二咪唑(cdi)，室温反应2～4h充分活化，再加入过量的乙二胺，继续搅拌使其充分反应，透析，冻干备用；葡甘聚糖与dmso的摩尔比为1：10⁶～1：10⁸，葡甘聚糖与羰基二咪唑的质量比为1：2～1：10，葡甘聚糖与乙二胺摩尔比为1：10⁵～1：10⁶；

(2)cdi法活化sio2表面羟基

称取sio2颗粒洗涤数次，加入无水丙酮保证无水环境，sio2颗粒与无水丙酮的摩尔比为1：40～1:50，加入cdi反应1～2h，无水丙酮清洗数次，去除多余cdi，晾干；sio2与cdi的摩尔比为1：1～1：5所述的sio2颗粒的直径选择10，30，100，500，1000nm五种；

(3)sio2表面甘露糖化修饰

称取含有咪唑基团sio2与含有氨基化葡甘聚糖的dmso溶液，氨基化葡甘聚糖与咪唑基团sio2的质量比为1：1～1：3，室温涡旋震荡反应2～4h，即得到葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒。

本发明所述的葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒的制备方法包含以下步骤：

(1)制备氨基化葡甘聚糖；

(2)cdi法活化sio2表面羟基得到含有咪唑基团的sio2；

(3)将氨基化的葡甘聚糖与含有咪唑基团的sio2反应得到葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒。

本发明所述的葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒的制备方法进一步优选包含以下步骤：

(1)氨基化葡甘聚糖制备

称取葡甘聚糖于dmso中，加热溶解2～4h，40～60℃，冷却至室温，加入过量的羰基二咪唑(cdi)，室温反应2～4h充分活化，再加入过量的乙二胺，继续搅拌使其充分反应，透析，冻干备用；葡甘聚糖与dmso的摩尔比为1：10⁶～1：10⁸，葡甘聚糖与羰基二咪唑的质量比为1：2～1：10，葡甘聚糖与乙二胺摩尔比为1：10⁵～1：10⁶；

(2)cdi法活化sio2表面羟基

称取sio2颗粒洗涤数次，加入无水丙酮保证无水环境，sio2颗粒与无水丙酮的摩尔比为1：40～1:50，加入cdi反应1～2h，无水丙酮清洗数次，去除多余cdi，晾干；sio2与cdi的摩尔比为1：1～1：5；所述的sio2颗粒的直径选择10，30，100，500，1000nm五种；

(3)sio2表面甘露糖化修饰

称取含有咪唑基团sio2与含有氨基化葡甘聚糖的dmso溶液，氨基化葡甘聚糖与咪唑基团sio2的质量比为1：1～1：3，室温涡旋震荡反应2～4h，即得到葡甘聚糖糖基化的sio2纳米颗粒。

步骤(3)中室温涡旋震荡反应2～4h后还优选包含离心弃上清，再用去离子反复清洗，离心直至无多余的溶剂、试剂，37°烘干，于真空干燥保存。

本发明所述的葡甘聚糖糖基化sio2纳米颗粒在制备治疗炎症性疾病、胃溃疡、创伤愈合的药物中的应用。

所述的炎症性疾病优选包含如结肠炎等炎症性肠病、慢性胃炎、关节炎。

这项发明通过对炎症性肠病疾病，胃溃疡模型以及全层皮肤切除创伤模型进行例证。此处的动物包括但是不限于：小鼠，大鼠，驯养动物包括但是不限于猫，狗，以及其它一些动物例如但是不限于牛，羊，猪，马，灵长类动物例如但是不限于猴子和人。小鼠炎症性肠病疾病模型，的体内检测是被广泛认可和接受的体内药物活性检测的模型，同时也可以为其它生物例如但是不限于人提供参考。

有益效果

本发明提供了一种新的二氧化硅纳米多糖，含有大量甘露糖的魔芋多糖或白芨多糖氨基化后通过与cdi羟基活化的不同尺寸的二氧化硅纳米颗粒形成纳米多糖，可以激活巨噬细胞的表型变化，进而引起新的生物学效应，如分泌大量抑制性因子il-10，改善胃肠道的炎症状态；同时在创伤愈合过程中，通过调控巨噬细胞的表型，形成组织修复型巨噬细胞，通过tgf-β1和vegf来调节并加速组织修复、再生，能够在制备相关炎症性疾病及创伤愈合的药物或外用医疗器械方面应用。本发明为进一步研究葡甘聚糖的生物活性奠定基础；与小分子药物相比，具有极高的原料选择性，成本较低，纳米化产物单一，分离简单，具备一定的工业化前景；与纯多糖比，在治疗效果上突出的是更具有靶向性，药效更佳。

附图说明

图1为不同粒径的sio2以及以此为载体合成的ksinps的透射电镜形貌分析

图2为动态光散射检测不同尺寸的sinps及ksinps的粒径分布图

图3为红外光谱分析检测ksinp30的特异性吸收基团

图4为ksinp30治疗小鼠tnbs炎症性疾病的疗效考核图片

图5为ksinp30对小鼠全层皮肤切除创伤模型的治疗图片

图6为ksinp30对小鼠全层皮肤切除创伤愈合率的曲线图

图7为bsinp30对小鼠全层皮肤切除创伤愈合率的曲线图

图8为不同尺寸的纳米多糖对巨噬细胞细胞上清中il-10水平的影响

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

以下实施例所使用的魔芋多糖来自megazyme(wicklow,ireland)，分子量为200kda,但是不应视为对魔芋多糖使用来源的限制。

实施例1：ksinps溶液的制备

(1)氨基化魔芋多糖制备

称取一定量的魔芋多糖于dmso中，加热溶解3h，45℃，冷却至室温，加入过量的羰基二咪唑(cdi)，室温反应3h充分活化，再加入过量的乙二胺，继续搅拌18h，使其充分反应，透析三天，冻干备用；魔芋多糖与dmso的摩尔比为5：10⁶，魔芋多糖与羰基二咪唑的质量比为1：2，魔芋多糖与乙二胺摩尔比为1：10⁵。

(2)cdi法活化sio2表面羟基

分别称取一定量的sio2(粒径分别为10，30，100，500，1000nm)洗涤数次，加入一定量的无水丙酮保证无水环境，加入过量cdi反应1～2h，无水丙酮清洗数次，去除多余cdi，晾干；sio2与cdi的摩尔比为2：1。

(3)sio2表面甘露糖化修饰

称取一定量的含有咪唑基团sio2与含有氨基化魔芋多糖的dmso溶液，氨基化魔芋多糖与咪唑基团sio2的质量比为1：2，室温涡旋震荡反应4h，即得到糖基化sio2的魔芋多糖纳米颗粒(以下简称ksinps)。

不同尺寸的魔芋多糖纳米颗粒的理化性质及表征，见图1、图2和图3

透射电镜结果如图1，合成的多糖纳米颗粒尺寸基本无明显变化，表面附着多糖，粒径分布也无明显差异。

动态光散射检测修饰前后不同尺寸二氧化硅的粒径分布，结果如图2，修饰后的纳米颗粒尺寸无明显变化，分布也无明显变化。

红外光谱图的结果如图3，sio2在3445.4cm^-1处出现-oh的特征吸收峰，由此可知sio2纳米微粒表面存在大量的羟基，修饰多糖后在3100～3450cm^-1处的羟基峰明显变弱；sio2在1094.7cm^-1有一宽强的不对称吸收峰，这是由si-o-si对称伸缩振动吸收峰。462.6cm^-1处为si-o-si的弯曲振动吸收峰。而在silica-kgm的红外谱图中，除原有的特征峰外，在2876.1cm^-1出现了很强的-c-h，-ch2-的伸缩振动吸收峰，并在1400cm^-1左右出现c-h的面内剪切振动吸收峰。另外在1097.7cm^-1，-1065.8cm^-1内出现多重强吸收峰，这是c-o-c、si-o-c和si-o-si的对称伸缩振动吸收峰，这些均说明sio2与kgm发生了反应，-(och2ch2)n-分子链已经结合到sio2上，kgm包覆在纳米sio2表面上。这一结果表明咪唑基活化的sio2和氨基化魔芋多糖上的羟基发生了反应，合成了我们想要的纳米多糖。

实施例2：bsinps溶液的制备

(1)氨基化白芨多糖制备

称取一定量的白芨多糖于dmso中，加热溶解3h，45℃，冷却至室温，加入过量的羰基二咪唑(cdi)，室温反应3h充分活化，再加入过量的乙二胺，继续搅拌18h，使其充分反应，透析三天，冻干备用；白芨多糖与dmso的摩尔比为5：10⁶，白芨多糖与羰基二咪唑的质量比为1：2，白芨多糖与乙二胺摩尔比为1：10⁵。

(2)cdi法活化sio2表面羟基

称取粒径为30nmsio2洗涤数次，加入一定量的无水丙酮保证无水环境，加入过量cdi反应2h，无水丙酮清洗数次，去除多余cdi，晾干；sio2与cdi的摩尔比为2：1。

(3)sio2表面甘露糖化修饰

称取一定量的含有咪唑基团sio2与含有氨基化白芨多糖的dmso溶液，氨基化白芨多糖与咪唑基团sio2的质量比为1：3，室温涡旋震荡反应4h，即得到糖基化sio2的白芨多糖纳米颗粒(以下简称bsinps)。

通过动态光散射检测修饰前后不同尺寸二氧化硅的粒径分布，结果显示修饰后的纳米颗粒尺寸无明显变化，分布也无明显变化。

实施例3：ksinps/bsinps对小鼠tnbs肠炎的治疗作用

按照文献报道方法建立小鼠tnbs肠炎模型，即取雌性balb/c小鼠50只，体重16-18g，将小鼠随机分为5组，禁食24小时，灌肠给药tnbs溶液，建立tnbs肠炎模型。

balb/c小鼠经3mg/ml的tnbs灌肠前后12小时，分别灌肠给药，分组如下：

空白对照组：模型建立时灌入50％的乙醇溶液，灌肠给药时给入生理盐水；

模型组：模型建立时灌入3mg/ml的tnbs，灌肠给药时给入生理盐水；

魔芋多糖组：模型建立时灌入3mg/ml的tnbs，灌肠给药时给入kgm溶液作为对照；

白芨多糖组：模型建立时灌入3mg/ml的tnbs，灌肠给药时给入bsp溶液作为对照；

sio2组：模型建立时灌入3mg/ml的tnbs，灌肠给药时给入同等剂量的sio2溶液作为对照；

ksinps组：模型建立时灌入3mg/ml的tnbs，灌肠给药时给入ksinp30(实施例1制备，粒径为30nm)(50mg/kg)

bsinps组：模型建立时灌入3mg/ml的tnbs，灌肠给药时给入bsinp30(实施例2制备，粒径为30nm)(50mg/kg)

tnbs模型中均为三次给药，给药体积均为100μl。给药后每天观察小鼠毛发状况，粪便性状，称量小鼠体重，并详细记录，共计三天。dai评分标准如下表。如果观测小鼠体重，小鼠饲养到模型建立第8天。

(1)疾病活动度(dai)评分

给药后每天观察小鼠毛发状况，粪便性状，称量小鼠体重，并详细记录，共计三天。dai评分标准如下表。

表1dai积分计分法

dai评分＝(体重丢失积分+粪便连续积分+隐血肉眼血积分)/3

(2)结肠he病理切片评分

模型建立后3天处死动物，取小鼠结肠，4％甲醛固定12小时，包埋切片，h&e染色，显微镜观察其病理变化，并进行评分。评分标准如下：

表2小鼠结肠he病理切片评分标准：

tnbs灌肠造模后，小鼠出现明显腹泻，体重降低，便血等症状，dai评分可以综合上述指标评价小鼠结肠炎的疾病严重程度。如表3所示，tnbs模型小鼠的dai评分与正常健康小鼠对比显著上升，而魔芋多糖纳米颗粒(ksinp30)和白芨多糖纳米颗粒(bsinp30)治疗可以有效缓解肠炎症状，降低dai评分，此外魔芋多糖、白芨多糖和sio2处理对dai评分没有影响。通过组织学评分我们可以发现治疗组中仅见少量炎症细胞浸润，组织学评分显著低于tnbs模型组；而魔芋多糖、白芨多糖和sio2单独处理对结肠的病理学评分并无影响。由此可见ksinps和bsinps治疗可以有效缓解tnbs诱导的肠道炎症。

表3魔芋多糖纳米颗粒治疗tnbs肠炎模型小鼠疗效

数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过anova检验加以确定。与模型组相比较，*代表p≤0.05

ksinps组治疗结果拍照如图4，对照小鼠结肠长度较长，无红肿现象，无明显其他炎症症状。tnbs组炎症症状明显，有红肿，结肠变短的现象。kgm组的炎症症状存在，但没有tnbs组炎症明显，可能是由于kgm有改善肠道内环境的作用。糖基化sio2的魔芋多糖纳米颗粒组(sio2-kgm组)与正常相似，无明显红肿现象。由此可见糖基化sio2的魔芋多糖纳米颗粒确有缓解炎症的作用。

实施例4：ksinp30对小鼠酒精性胃溃疡模型的治疗作用

按照文献报道方法建立小鼠酒精性胃溃疡模型，即取icr雄性小鼠50只，体重20-22g，将小鼠随机分为5组，基于酒精性胃溃疡模型灌胃给药。

icr小鼠经24小时禁食，分别灌胃给药，分组如下：，

空白对照组：灌胃给药时给入生理盐水；

模型组：灌胃给药时给入生理盐水；

魔芋多糖组：灌胃给药时给入kgm溶液作为对照；

白芨多糖组：灌胃给药时给入bsp溶液作为对照；；

sio2组：灌胃给药时给入同等剂量的sio2溶液作为对照；

ksinps组：灌胃给药给入ksinp30(实施例1制备，粒径为30nm)50mg/kg。

bsinps组：灌胃给药给入bsinp30(实施例2制备，粒径为30nm)50mg/kg。

给药4小时后，除空白对照组外，其余各组0.2ml/只无水乙醇灌胃，观察小鼠状态并记录，随后处死小鼠；处死后结扎贲门，取出全胃，固定1小时，用生理盐水清洗，肉眼观察胃溃疡情况，记录溃疡指数。模型组半数小鼠出现俯卧、震颤、运动失调症状；胃体出有较大点状出血或出血带，少部分出现点状出血，可见腺胃部黏膜深红色，有明显允血症状。ksinps在所用剂量下对小鼠无水乙醇模型有良好的保护作用，与空白对照组比较对溃疡有较好的抑制率，能够减轻乙醇对胃黏膜的损伤作用，溃疡指数明显低于对照组。结果见表4。

表4魔芋多糖纳米颗粒对小鼠酒精性胃溃疡的影响

数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过anova检验加以确定。与模型组相比较，*代表p≤0.05

实施例5：ksinp30对小鼠全层皮肤切除创伤模型的治疗作用

按照文献报道方法建立小鼠皮肤创伤愈合：

a.取c57小鼠，戊巴比妥钠腹腔麻醉，背部去毛，消毒，用特制打孔器在鼠背上打一圆孔，切取直径7mm、面积平均为mm²的皮肤，深至皮下,止血后，拍照记为day1，对照组以一次性无菌敷料贴包扎,单笼喂养。

b.实验组将药物涂抹在伤口处，再用涂上红霉素药膏的纱布包扎，单笼喂养。

c.在创伤后3天、5天、7天、9天以及12天照相，然后使用美国image-pro○rplusversion6(ipp)图像分析软件测量小鼠和的伤口面积。愈合率＝[(原始创面面积-未愈合创面面积)÷原始创面面积]×100％。

取伤口组织，固定，石蜡包埋切片，he染色和天狼猩红染色，观察创面的病理学和细胞学特征。

实验随机分为四组：

对照组：涂抹给药时给入生理盐水；

魔芋多糖组：涂抹给药时给入kgm溶液作为对照；

白芨多糖组：涂抹给药时给入bsp溶液作为对照；

sio2组：涂抹给药时给入同等剂量的sio2溶液作为对照；

ksinps组：涂抹给药时给入ksinps(实施例1制备，粒径为30nm)5mg/ml；

bsinps组：涂抹给药时给入bsinps(实施例1制备，粒径为30nm)5mg/ml。

涂抹给药后，红霉素软膏涂抹伤口，一次性无菌敷料贴包扎，单笼饲养，观察小鼠造模前、后体重，皮毛，运动及进食的变化。通过创面愈合率、创面愈合时间和组织病理学分析作为直接而有效的创面愈合评价指标。创面愈合的结果见图5，可见伤口的愈合速度的对比明显，ksinp组的伤口愈合速率较其他几组明显加快，说明多糖化的纳米颗粒能够加速伤口愈合。

伤口愈合率的统计如图6和7，ksinps组和bsinps组的伤口愈合率在创伤早期有明显提高愈合的效果，说明纳米多糖在伤口愈合有促进的效果。

实施例6细胞因子测定

il-10是重要的抑制炎症因子，能够缓解炎症状态，体现出纳米多糖的生物学效应。

提腹腔巨噬细胞，铺入48孔板中，细胞量为80％以上，加实施例1制备的不同尺寸的ksinps纳米颗粒(100ug/ml)刺激24小时后收样，并设control组，elisa试剂盒检测il-10，tnf-a等炎症相关因子。结果见图8，ksinp30较之对照和其他粒径的ksinps纳米颗粒能显著刺激巨噬细胞分泌大量抑制性因子il-10。

以上实施例3-6中bsinp30、ksinp30和对照sio2颗粒通过先用乙醇：ddwater＝4：1清洗三遍，再用生理盐水配制成一定合适浓度。将ksinp30(实施例1制备，粒径为30nm)或sio2颗粒分散在pbs溶液中，给药前超声分散。魔芋多糖组的kgm和白芨多糖组的bsp则直接用紫外照射后配制溶液给药。

在随后的研究中，发明人也考察了10，100，500，1000nm的ksinps和bsinps对结肠炎、胃溃疡和创伤愈合的疗效，均得到了与ksinp30和bsinp30相接近的结果，当然ksinps和bsinps对结肠炎、胃溃疡和创伤愈合的疗效均显著优越于kgm和bsp对照、也有显著优越于sio2对照。