一种提取银杏叶活性成分的两相深共熔溶剂及其制备方法和提取方法与流程

本发明涉及农林生物资源利用，具体涉及一种提取银杏叶活性成分的两相深共熔溶剂及其制备方法和提取方法。
背景技术：
：银杏(学名：ginkgobilobal.)，又名公孙树、白果，属裸子植物，银杏科银杏属，单属单种。银杏叶、果等具有药用开发价值，被誉为浑身是宝的活化石。银杏原产我国，我国银杏资源拥有量占世界总量的70％以上。银杏叶活性成分中主要包括银杏黄酮、萜内酯、原花青素、聚异戊烯醇等。银杏黄酮类物质的含量居于首位，总含量约占2.5～5.9％，银杏叶中已分离出40余种黄酮类物质。银杏叶黄酮类化合物具有抑制血小板凝集、降低血液粘稠度、改善脑循环、抗动脉粥样硬化、抗氧化、促进脂肪细胞脂解、抗肿瘤等作用，它可以有效的应用于治疗冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压等疾病。银杏内酯是银杏叶中另外一类重要的活性成分，属于萜类化合物，又称为银杏萜内酯，主要包括倍半萜内酯和二萜内酯。白果内酯是银杏叶中已分离出的唯一一个倍半萜内酯类化合物。银杏内酯a、b、c、m、j为二萜内酯类化合物。银杏内酯b是特异性血小板活化因子(paf)的强拮抗药。各国科学家对银杏叶萜内酯类化合物进行药理作用研究发现，银杏内酯是目前天然paf受体拮抗药中最具前景的药物，在保护缺血性脑损伤、促进神经干细胞向神经元分化、抑制神经细胞凋亡、治疗中枢神经系统退行性疾病及心血管系统疾病等方面拥有良好的临床应用前景。聚异戊烯醇是一类类脂化合物，结构主要由一系列异戊烯基单元和终端异戊烯醇单元组成。银杏叶所含的聚异戊烯醇属于桦木聚异戊烯醇类，主要以醋酸酯的形式存在于叶片中，少部分以游离醇的形式存在。银杏叶聚异戊烯醇分子中异戊烯基单元数为14-24，主要成分为17-19个异戊烯基单元，占总聚异戊烯醇类化合物含量的80％左右。聚异戊烯醇类化合物具有免疫活性，可抗hiv病毒，也可用于治疗免疫缺陷病症如败血症等，可诱导肿瘤细胞凋亡，同时在抗肝炎病毒及辅助化疗白血病方面也有明显的生物活性，对高血压、高血脂、糖尿病、通风、红斑狼疮等免疫功能疾病有治疗作用。原花青素是一种具有黄烷-3-醇结构的植物多酚类化合物，在银杏叶提取物中约含有4～12％的含量。除众所周知的抗氧化活性外，银杏叶原花青素在心血管系统内，具有抗高血压、内皮依赖性血管舒张活性、抗缺血-再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、抗血小板凝集等功效，对急性肾功能衰竭也具有显著的保护作用。此外，原花青素还有抗癌、免疫活性调节、降低毛细血管通透性、抗菌消炎等功效，对治疗外周静脉功能不全、淋巴水肿等疾病均有很好的疗效。目前关于银杏叶活性成分提取通常都是利用水或者有机溶剂作为提取溶剂，水作为提取溶剂提取效果差，而传统有机溶剂易挥发、易残留，对环境和人体造成危害，成本高。此外，由于银杏黄酮、萜内酯、原花青素具有亲水性，而聚异戊烯醇乙酸酯具有疏水性，因此，以往的银杏叶活性成分提取方法都是将这些成分单独提取或将亲水性成分和疏水性成分分开提取，这样一方面造成生物活性成分浪费，另一方面也增加提取步骤，提高提取成本。因此，寻求一种绿色、安全、高效、同步提取银杏活性成分的方法非常有必要。技术实现要素：发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种两相深共熔溶剂(tpdess)。本发明提供的两相深共熔溶剂作为绿色溶剂，安全无污染，可重复利用，易生物降解，制备工艺简单，成本低，具有蒸汽压低、不可燃、溶解性和导电性优良、电化学窗口稳定等性质；可以绿色安全高效同步提取银杏叶中多种活性成分，包括黄酮、萜内酯、原花青素、聚戊烯醇乙酸酯。本发明还提供该两相深共熔溶剂的制备方法及利用该两相深共熔溶剂提取银杏叶活性成分的方法。技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种提取银杏叶活性成分的两相深共熔溶剂，由等体积的亲水相和疏水相组成，所述亲水相由物质a和物质b按体积比10-0:0-10组成，所述物质a由des1和水按质量比6:3.5-4.5组成，所述des1是由氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1.5-2.5制备而成；所述物质b由des2和水按质量比4.5:5-6组成，所述des2是由氯化胆碱和丙二酸按照摩尔比1:1.5-2.5制备而成；所述疏水相是由甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸按照摩尔比1:2:2.5-3.5制备而成的深共溶溶剂des3。作为优选，所述亲水相由物质a和物质b按体积比7.75-8.75:2.25-1.25组成。最优选的，深共熔溶剂中亲水相由物质a和物质b按体积比8.75:1.25组成。作为优选，所述物质a由des1和水按质量比6:4-4.5组成，所述des1是由氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:2-2.5制备而成；所述物质b由des2和水按质量比4.5:5.5-6组成，所述des2是由氯化胆碱和丙二酸按照摩尔比1:1.5-2制备而成；所述疏水相是由甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸按照摩尔比1:2:2.5-3制备而成。最优选的，所述物质a由des1和水按质量比6:4组成，所述des1是由氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:2制备而成；所述物质b由des2和水按质量比4.5:5.5组成，所述des2是由氯化胆碱和丙二酸按照摩尔比1:2制备而成；所述疏水相des3是由甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸按照摩尔比1:2:3制备而成。本发明所述的两相深共熔溶剂的制备方法，包括如下步骤：(1)按摩尔比称取氯化胆碱和乙酰丙酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des1，将des1和水按照质量比混合即得物质a；(2)按摩尔比称取氯化胆碱和丙二酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des2，将des2和水按照质量比混合即得物质b；(3)将物质a和物质b按体积比混合即得两相深共溶溶剂的亲水相；(4)按摩尔比称取甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸并混合均匀，在80～110℃之间加热，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des3，作为两相深共溶溶剂的疏水相；(5)将亲水相和疏水相等体积进行混合，静置后分层，即得到两相深共熔溶剂。本发明所述的两相深共熔溶剂提取银杏叶活性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据料液比先按照两相深共熔溶剂的制备方法制备两相深共熔溶剂置于提取容器中，精确称取银杏叶粉末加入提取容器中的两相深共溶溶剂中，混合均匀；(2)混匀后加热提取，提取结束后离心，两相体系分层，上相为疏水相，下相为亲水相。取亲水相检测其中的黄酮、萜内酯、原花青素含量，取疏水相检测其中的聚异戊烯醇乙酸酯含量。其中，步骤(1)所述银杏叶粉末与稀释后的深共熔溶剂的质量体积比为1:15-25g/ml。优选银杏叶粉末与两相深共熔溶剂的质量体积比为1:20-25g/ml。最优的质量体积比为1:20g/ml。其中，步骤(2)所述的加热提取为振荡加热提取或搅拌加热提取。所述振荡或搅拌的转速为100-300rpm，温度为50-70℃，时间为30-60min。优选的振荡或搅拌的转速为150-160rpm，温度为60-65℃，时间为40-45min。最优的振荡或搅拌的转速为150rpm，温度为60℃，时间为40min。本发明的两相深共熔溶剂(tpdess)性质与各相深共熔溶剂(dess)的组成成分、组成摩尔比及含水量有着重要关系，细微的组分不同可以引起dess性质极大的改变，可以利用此特性对dess进行性质调整以适应不同的应用需求。本发明的tpdess，能够在同一时间内把银杏叶中的几种活性成分高效地提取出来，由于聚戊烯醇类化合物的疏水性较大，与黄酮、萜内酯等物质极性相差大，单一的溶剂进行联合高效提取可行性不大，本发明设计出了两相体系深共熔溶剂，可以形成稳定的两相体系，上相为疏水相，下相为亲水相。搅拌提取后也可以迅速分成两相，如图1所示。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明制备的两相深共熔溶剂为绿色溶剂，安全无污染，可重复利用，易生物降解，具有蒸汽压低、不可燃、溶解性和导电性优良、电化学窗口稳定等性质；同时本发明的tpdess的粘度小，氢键稳定，流动性好；使用本发明的tpdess可以同时提取银杏叶中多种活性成分，并且不会形成残留，对环境和人体不会产生危害。(2)本发明深共熔溶剂的制备方法简单方便，原料来源广，成本低，生降解性高。(3)采用本发明两相深共熔溶剂提取银杏叶活性成分的方法，操作简便，提取效率高，使用安全，不会造成资源浪费。附图说明图1为dess提取前两相体系和提取后两相体系的示意图；图2为不同提取温度对dess提取银杏叶活性成分提取率的影响关系图；图3为不同提取时间对dess提取银杏叶活性成分提取率的影响关系图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。实验原料：实验的原料银杏叶来自于邳州市铁富镇银杏叶生产基地，银杏叶采摘时间为5月。标准品芦丁购自上海源叶生物科技有限公司，标准品银杏内酯a来自中国药品生物制品检定所，异丙醇、甲醇、正己烷为色谱纯，其他所用药品均为分析纯。p1201高效液相色谱仪和uv1201检测器，大连依利特分析仪器有限公司；uv-1200型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；jy-2恒温搅拌油浴锅，金坛市天竟实验仪器厂；恒温培养振荡器zwyr-2112b，上海智诚分析仪器制造有限公司；tg16a-ws台式高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。其他原料都是市售可得，将原料氯化胆碱、乙酰丙酸、丙二酸、甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸在真空干燥箱中干燥除水。实施例1(1)按摩尔比例1:2称取氯化胆碱和乙酰丙酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des1，将des1和水按照质量比6:4混合即得物质a；(2)按摩尔比1:2称取氯化胆碱和丙二酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des2，将des2和水按照质量比4.5:5.5混合即得物质b；(3)将物质a和物质b按体积比8.75:1.25混合即得两相深共溶溶剂的亲水相；(4)按摩尔比1:2:3称取甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸并混合均匀，在80～110℃之间加热，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des3，作为两相深共溶溶剂的疏水相；(5)将亲水相和疏水相按体积比1:1混合，静置后分层，即得到两相深共熔溶剂。实施例2(1)按摩尔比例1:2.5称取氯化胆碱和乙酰丙酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des1，将des1和水按照质量比6:4.5混合即得物质a；(2)按摩尔比1:2.5称取氯化胆碱和丙二酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des2，将des2和水按照质量比4.5:6混合即得物质b；(3)将物质a和物质b按体积比7.75:2.25混合即得两相深共溶溶剂的亲水相；(4)按摩尔比1:2:3.5称取甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸并混合均匀，在80～110℃之间加热，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des3，作为两相深共溶溶剂的疏水相；(5)将亲水相和疏水相按体积比1:1混合，静置后分层，即得到两相深共熔溶剂。实施例3(1)按摩尔比例1:1.5称取氯化胆碱和乙酰丙酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des1，将des1和水按照质量比6:3.5混合即得物质a；(2)按摩尔比1:1.5称取氯化胆碱和丙二酸并混合均匀，在80～110℃之间加热搅拌，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des2，将des2和水按照质量比4.5:5混合即得物质b；(3)将物质a和物质b按体积比8.75:1.25混合即得两相深共溶溶剂的亲水相；(4)按摩尔比1:2:2.5称取甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸并混合均匀，在80～110℃之间加热，直至形成透明液体，即为深共溶溶剂des3，作为两相深共溶溶剂的疏水相；(5)将亲水相和疏水相按体积比1:1混合，静置后分层，即得到两相深共熔溶剂。实施例4实施例4与实施例1的制备方法相同不同之处在于：将只含有物质a的亲水相和疏水相按体积比1:1混合，静置后分层，即得到两相深共熔溶剂。实施例5实施例5与实施例1的制备方法相同不同之处在于：将只含有物质b亲水相和疏水相按体积比1:1混合，静置后分层，即得到两相深共熔溶剂。实施例6(1)将实施例1-5制备的任意一种两相深共熔溶剂4ml加入20ml具塞玻璃瓶中，精确称取0.2g40目银杏叶粉末加入具塞玻璃瓶中的两相深共熔溶剂中，涡旋混匀；(2)混匀后在60℃，150rpm磁力搅拌提取40min，提取结束后在10000rpm下离心10min，离心后取亲水相，检测其中的黄酮、萜内酯、原花青素含量，取疏水相检测其中的聚戊烯醇乙酸酯含量。实施例7(1)将实施例1-5制备的任意一种两相深共熔溶剂3ml加入20ml具塞玻璃瓶中，精确称取0.2g40目银杏叶粉末加入具塞玻璃瓶中的两相深共熔溶剂中，涡旋混匀；(2)混匀后在50℃，160rpm磁力搅拌提取45min，提取结束后在10000rpm下离心10min，离心后取亲水相，检测其中的黄酮、萜内酯、原花青素含量，取疏水相检测其中的聚戊烯醇乙酸酯含量。实施例8(1)将实施例1-5制备的任意一种两相深共熔溶剂5ml加入20ml具塞玻璃瓶中，精确称取0.2g40目银杏叶粉末加入中具塞玻璃瓶中的两相深共熔溶剂中，涡旋混匀；(2)混匀后在70℃，100rpm磁力搅拌提取60min，提取结束后在10000rpm下离心10min，离心后取亲水相，检测其中的黄酮、萜内酯、原花青素含量，取疏水相检测其中的聚戊烯醇乙酸酯含量。实施例9(1)将实施例1-5制备的任意一种两相深共熔溶剂4ml加入20ml具塞玻璃瓶中，精确称取0.2g40目银杏叶粉末加入具塞玻璃瓶中的两相深共熔溶剂中，涡旋混匀；(2)混匀后在65℃，300rpm振荡搅拌提取30min，提取结束后在10000rpm下离心10min，离心后取亲水相，检测其中的黄酮、萜内酯、原花青素含量，取疏水相检测其中的聚戊烯醇乙酸酯含量。实施例10(1)将实施例1-5制备的任意一种两相深共熔溶剂4ml加入20ml具塞玻璃瓶中，精确称取0.2g40目银杏叶粉末加入具塞玻璃瓶中的两相深共熔溶剂中，涡旋混匀；(2)混匀后在50℃，300rpm磁力搅拌提取30min，提取结束后在10000rpm下离心10min，离心后取亲水相，检测其中的黄酮、萜内酯、原花青素含量，取疏水相检测其中的聚戊烯醇乙酸酯含量。实施例11活性成分的检测方法(1)银杏叶黄酮含量检测黄酮检测采用紫外分光光度计芦丁法。取0.5ml待测样品，加0.3ml5％亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml，放置6min，加入4％氢氧化钠溶液4ml，70％乙醇4.5ml，混合均匀后放置20min，在510nm下检测。用芦丁标准品配成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.008、0.016、0.024、0.032、0.04、0.048、0.056、0.064、0.072mg/ml，显色后检测，并绘制标准曲线。使用芦丁法检测的黄酮标准曲线为y＝6.1786x–0.0689，r2＝0.9989，检测范围0-0.072mg/ml。(2)银杏叶萜内酯含量检测萜内酯在碱性条件下(ph＞7.5)可发生开环反应，在羟胺存在下生成异羟肟肪酸，然后同fecl3反应生成有色配合物，基于该反应机理，可以用银杏内酯a为标样，采用分光光度法测定银杏叶中总萜内酯含量。制定标准曲线的过程为：准确配制1.42mg/ml银杏内酯a标准溶液10ml，吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别置于6支20ml比色管中，各加70％乙醇溶液到1.0ml，然后加入0.4ml碱性羟胺溶液(13.9％盐酸羟胺水溶液+3.5mol/lnaoh溶液(1:2)混合，现用现配)，反应5min后加入3mol/lhci溶液0.4ml，6％fecl3溶液0.2ml，混合均匀，再加入70％乙醇溶液5ml，摇匀后在波长517mn处测定并绘制标准曲线。萜内酯的标准曲线为y＝1.2243x-0.00154，r2＝0.9992，检测范围为0-1mg/ml。(3)银杏叶原花青素的含量测定原花青素含量测定选用4-二甲基肉桂醛(dmac)分光光度法，具体检测方法为：精确量取12.5ml浓盐酸、12.5ml水，用无水乙醇定容至100ml制成酸性乙醇，酸性乙醇需现配现用。将50mgdmac用酸性乙醇定容至50ml配制成显色剂。1ml样品液加3ml显色剂，在室温下放置10min进行显色反应，反应后在644nm处检测。用银杏叶原花青素标准品配成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.0129、0.0258、0.0387、0.0516、0.0645、0.0774、0.0903、0.1032、0.1161、0.129mg/ml，显色后检测，并绘制标准曲线。根据稀释后的10组标准溶液，用检测得到的吸光值与原花青素浓度在excel图表工具中绘制标准曲线，拟出相应线性关系方程式，得到的原花青素的标准曲线方程为：y＝8.8157x+0.0114(0<x<0.129)r2＝0.9994，说明原花青素在0～0.129mg/ml浓度范围内线性型良好，该方法可以用于原花青素的定量分析。(4)银杏叶聚戊烯醇乙酸酯的含量检测方法分析色谱条件的确定检测采用hplc高效液相色谱对聚戊烯醇乙酸酯类化合物进行分析，在不同流动相、柱温、检测波长条件下进样，确定最适的检测条件。聚戊烯醇乙酸酯标准曲线的建立准确称取14.7mg聚戊烯醇乙酸酯标准品，溶于6ml正己烷中，制备成聚戊烯醇乙酸酯标准液。将标准液稀释成11组不同浓度的溶液，分别为：0.0613、0.0245、0.49、0.735、0.98、1.225、1.47、1.715、1.96、2.205、2.45(单位：mg/ml)，用hplc检测各组浓度下的峰面积，根据峰面积与浓度的关系，绘制出标准曲线。根据稀释后的11组标准溶液，用检测得到的峰面积与聚戊烯醇乙酸酯浓度在excel图表工具中绘制坐标图，拟出相应线性关系方程式，得到的聚戊烯醇乙酸酯的标准曲线：y＝1179.4x+12.746(0<x<1.96)，r2＝0.9991，说明聚戊烯醇乙酸酯在0～1.96mg/ml浓度范围内线性型良好，该方法可以用于聚戊烯醇乙酸酯的定量分析。试验例1tpdess对银杏叶中的活性成分提取率研究，结果如表1所示。其中采用实施例1-3的tpdess，并采用实施例6的提取方法，考察本发明的tpdess以及提取方法对银杏叶中的活性成分的提取率；对比例1为提取溶剂为水，并采用实施例4的提取方法。对比例2为提取溶剂为70％乙醇，并采用实施例4的提取方法。表1tpdesss对银杏叶中活性成分提取率的影响原花青素(mg/g)黄酮(mg/g)萜内酯(mg/g)聚戊烯醇乙酸酯(mg/g)实施例121.284±0.91692.2165±0.045822.9552±0.057874.2829±1.9386实施例221.145±0.91242.2127±0.056722.8436±0.047974.1857±1.9367实施例321.168±0.91352.2089±0.053822.8735±0.059774.1753±1.8769对比例111.2574±0.25371.0537±0.023612.3582±0.0247未测出对比例218.4372±0.27421.6832±0.521819.3527±0.6831未检出由表1结果可知，采用本发明的两相深共熔溶剂和提取方法，对比了传统的提取溶剂水和70％乙醇的提取率，本发明的实施例提取率明显要高，最高能达到提取率22.0956±0.7129mg/g。这能说明，本发明的tpdess可以应用于银杏叶活性成分的同步提取，提取效率优于传统溶剂，其中原花青素提取率21.284±0.9169mg/g，黄酮提取率2.2165±0.0458mg/g，萜内酯提取率为22.9552±0.0578mg/g，聚戊烯醇乙酸酯提取率为74.2829±1.9386mg/g，原花青素、黄酮、萜内酯、聚戊烯醇乙酸酯的一次提取效率分别为86.07％，77.72％，93.29％和94.63％。因此，本发明的tpdess可高效的同步提取银杏叶中多个活性成分。并且本发明tpdess是一种高效的绿色溶剂，相对于传统有机溶剂不会产生任何污染，并且使用安全。试验例2dess组分比例对银杏叶中活性成分提取率的影响。采用实施例1-3的tpdess，并采用实施例6的提取方法；考察本发明实施例1的深共熔溶剂对对银杏叶中的活性成分的提取率；结果如表2所示。其中对比例3与实施例1的深共熔溶剂原料和制备方法相同，不同之处组分氯化胆碱和丙二酸的摩尔比为1:1，氯化胆碱和乙酰丙酸的摩尔比为1:1，甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸摩尔比为1:1:4，并采用相同的提取方法。其中对比例4与实施例1的深共熔溶剂原料和制备方法相同，不同之处组分氯化胆碱和丙二酸的摩尔比为1:3，氯化胆碱和乙酰丙酸的摩尔比为1:3，甲基三辛基氯化铵、辛醇和辛酸摩尔比为1:3:2，并采用相同的提取方法。表2tpdess组分不同摩尔比对银杏叶活性成分提取率影响由表2结果可知，采用本发明实施例的摩尔比所得两相深共熔溶剂与对比例相比，对于银杏叶中活性成分的提取率明显要高。其中对比例4的摩尔配比不能形成稳定的两相体系，故不能进行提取。组分摩尔比对于dess的形成和性质有很大影响。dess的组分摩尔比会影响到dess的粘度、表面张力等性质，也会影响dess组分间、dess与提取物间的氢键作用、范德华力、疏水作用力等分子间作用力，进而影响提取率。实施例3不同亲水相和疏水相制备所得的tpdess对银杏叶中活性成分提取率的影响。采用实施例1、实施例4和实施例5的两相深共熔溶剂(tpdess)，银杏叶与tpdess的质量体积比1:20(g/ml，料液比)，磁力搅拌150rpm，提取温度50℃，提取时间为30min。选取物质a和物质b体积比8.75:1.25组成的tpdess作为联合提取的提取溶剂，原花青素提取率为17.5974±0.8514mg/g，比实施例4单一物质a/疏水相两相体系提取率高10.71％，比实施例5单一物质b/疏水相两相体系提取率高9.02％；黄酮提取率为2.1815±0.0168mg/g，比单一物质a/疏水相两相体系提取率高6.98％，比单一物质b/疏水相两相体系提取率高15.91％；萜内酯提取率为17.7957±0.8657mg/g，比单一物质a/疏水相两相体系提取率高24.83％，但是比单一物质b/疏水相两相体系提取率高2.47％；聚异戊烯醇乙酸酯提取率为75.7373±2.0148mg/g，与单一物质a/疏水相两相体系提取率相同，比单一物质b/疏水相两相体系提取率高78.53％，效果显著。试验例4tpdess提取方法对银杏叶活性成分提取率的影响。采用实施例1的tpdess，同时将将实施例1中物质a和物质b的比例替换成8.25:1.75；分别以提取条件磁力搅拌(150rpm)、超声提取(150w)和摇床震荡(150rpm)作为待选提取方法，其余条件均为：银杏叶与tpdess的质量体积比1:20(g/ml)，亲水相与疏水相等体积混合，提取温度50℃，提取时间为30min。提取结果如表3所示。表3不同提取方法对tpdess提取银杏叶活性成分的影响原花青素(mg/g)黄酮(mg/g)萜内酯(mg/g)聚戊烯醇乙酸酯(mg/g)8.75:1.25搅拌17.5974±0.85142.1815±0.016817.7957±0.865775.7373±2.01488.75:1.25超声12.1337±0.97801.8766±0.053113.0311±0.565947.8669±1.10688.75:1.25振荡14.1188±0.90981.7998±0.051512.5002±0.057857.8056±1.70128.25:1.75搅拌16.3307±1.10172.0493±0.091018.3675±0.368374.4370±1.57618.25:1.75超声10.6401±0.96251.6743±0.034315.5223±0.057846.6246±1.83078.25:1.75振荡14.4401±0.48131.7957±0.058414.4469±0.623851.1173±1.74267.75:2.25搅拌17.0113±0.91692.0196±0.016820.0828±0.499174.8909±1.59947.75:2.25超声8.7495±0.85891.3210±0.047415.9171±0.340143.6770±0.68907.75:2.25振荡14.7048±0.47231.6689±0.032715.0731±0.23144.3698±1.0139由表3结果可知，对同一提取溶剂来说，三种提取方法对四种活性成分的提取率是：磁力搅拌＞摇床提取＞超声提取。在磁力搅拌方法中，随着物质b比例升高，聚戊烯醇乙酸酯和原花青素提取率基本相似，都在误差范围内，黄酮提取率下降，萜内酯提取率上升；在超声提取方法中，随着物质b比例升高，萜内酯提取率上升，其余三个指标提取率下降；在摇床振荡提取方法中，原花青素提取率基本保持不变，黄酮和聚戊烯醇乙酸酯提取率稍微下降，萜内酯提取率上升。综合双相体系在三个提取方法中显示出的提取能力，可以推断出，随着des1含量的升高，tpdess两相体系提取原花青素能力基本相似，提取黄酮和聚戊烯醇乙酸酯能力下降，提取萜内酯能力上升。所以，最优的磁力搅拌150rpm，同时物质a和物质b的的体积比为8.75:1.25时，提取效果最好。试验例5银杏叶与tpdess的质量体积比(g/ml)(即料液比)对银杏叶活性成分提取率的影响。提取条件为：磁力搅拌150rpm，提取温度50℃，提取时间30min；考察银杏叶与本发明实施例1的tpdess不同的质量体积比(g/ml)对银杏叶活性成分提取率的影响，选取的料液比例分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/ml)的情况，结果如表4所示；表4料液比对银杏叶活性成分提取的影响由表4结果可知，提取料液比为1:15-25活性成分提取率较好。随着tpdess的增加，提取率逐渐上升，直到1:20达到平衡，此时，再增加tpdess体积，提取率不再上升，到1:30时下降明显。经分析，当料液比为1:20时，提取率较高。对于tpdess来说，亲水相/疏水相＝1:1(v/v)，若降低亲水相比例，亲水相料液比降低，亲水性成分提取率降低，疏水相料液比增加，但疏水性物质提取率并不升高，因此，亲水dess与疏水dess等体积混合是最佳的混合比例。试验例6不同温度对tpdess提取银杏叶活性成分提取率的影响。提取条件为：磁力搅拌150rpm，银杏叶与tpdess的质量体积比1:20(g/ml)，提取时间30min；考察本发明实施例1的tpdess在不同的温度下对银杏叶活性成分的提取率，选取的温度为45、50、55、60、65、70℃对活性成分进行提取；结果如图2所示。由图2可知，聚戊烯醇乙酸酯在50℃达到平衡值，黄酮在55℃达到提取平衡，原花青素和萜内酯在60℃时才达到提取平衡。为了综合考虑四个物质的提取率，提取温度选择50-70℃；优选60-65℃，最佳温度为60℃。试验例7不同提取时间对tpdess提取银杏叶活性成分提取率的影响。提取条件为：磁力搅拌150rpm，银杏叶与tpdess的质量体积比1:20(g/ml)，提取时间30min，提取温度60℃；考察本发明实施例1的tpdess在不同的提取时间下对银杏叶活性成分的提取率，选取时间为25、30、35、40、45、50、55、60、65min对活性成分进行提取；结果如图3所示。由图3结果所示，聚戊烯醇乙酸酯在30min达到提取平衡，黄酮和萜内酯在35min达到提取平衡，而原花青素的平衡时间为40min。至此，选取提取时间为30-60min，优选40-45min，最优为40min。综上所述，本发明制备的深共熔溶剂，在搅拌转速150rpm，提取温度60℃，料液比1:20，时间为40min。原花青素提取率21.284±0.9169mg/g，黄酮提取率2.2165±0.0458mg/g，萜内酯提取率为22.9552±0.0578mg/g，聚戊烯醇乙酸酯提取率为74.2829±1.9386mg/g，原花青素、黄酮、萜内酯、聚戊烯醇乙酸酯的一次提取效率分别为86.07％，77.72％，93.29％和94.63％。因此，本发明制备的两相体系深共熔溶剂，可以同时高效的联合提取银杏叶中多个活性成分。当前第1页12