一种绞股蓝皂苷TN-1在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及绞股蓝的技术领域，尤其涉及一种绞股蓝皂苷tn-1在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术：

绞股蓝(gynostemmapentaphyllum(thunb.)makino.)，又名七叶胆、五叶参、七叶参和甘蔓茶等，是一种葫芦科绞股蓝属的多年生攀缘植物，系我国民间常用的一种中草药，是现在所知仅有的含有人参皂苷类成分的非人参属植物。据统计，目前全世界上的绞股蓝品种共有17个种2个变种，其中中国有14个种2个变种，主要分布区域为东南亚等地以及我国秦岭及长江以南地区。2002年3月5日，绞股蓝被国家卫生部列入保健品名单，成为药食两用新资源。

绞股蓝皂苷(gypenoside，gyp)是绞股蓝中的一种主要活性成分，其中，gypxlvi是福建省南靖地区绞股蓝地上部分的主要的绞股蓝皂苷之一，而另一绞股蓝皂苷，gyptn-1的含量则非常低。目前尚未见到有文献对gyptn-1的生物活性进行详细的报道。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种绞股蓝皂苷tn-1在制备抗肝癌药物中的应用，本案由此产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种绞股蓝皂苷tn-1在制备抗肝癌药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种绞股蓝皂苷tn-1在制备抗肝癌药物中的应用。

所述绞股蓝皂苷tn-1，名称为(20s)-达玛烷-24-烯-2α,3β,12β,20-四醇-20-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，为白色粉末，分子式为c36h62o9，分子量为638.439结构式为：

所述绞股蓝皂苷tn-1(gyptn-1)，可以通过酶法转化绞股蓝总皂苷的方法，逐步分离纯化得到，其制备方法简单、成本低。当然，所述绞股蓝皂苷tn-1也可以从商业渠道获得。

所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、混悬剂、糖浆剂、肠溶制剂、乳剂悬浮液和注射剂中的至少一种制剂形式。

本发明通过测定mtt法、集落形成试验和ao/eb荧光染色测定gyptn-1的体外抗肝癌活性，结果表明，绞股蓝皂苷tn-1对人肝癌细胞smmc7721和bel7402的生长具有显著的抑制作用，对肝癌细胞smmc7721和bel7402的处理48h的ic50分别为36.65±12.31μg/ml、53.42±5.83μg/ml，其ic50值与比较公认的抗癌药物人参皂苷ih901相近。由此可见，绞股蓝皂苷tn-1可在制备抗肝癌药物中应用，具有良好的开发应用前景。

所述绞股蓝皂苷tn-1在制备抗肝癌药物中的应用至今未见报道，由于其对于人肝癌细胞的抑制活性显著，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于肝癌的防治显然具有显著的进步。

附图说明

图1为本发明的绞股蓝皂苷tn-1对不同细胞株处理48h的抑制曲线；

图2为本发明绞股蓝皂苷tn-1的集落形成数据统计图；

图3为本发明绞股蓝皂苷tn-1的抑制肝癌细胞smmc7721集落形成图；

图4为本发明绞股蓝皂苷tn-1的抑制不同细胞株的ao/eb荧光染色图。

具体实施方式

以下给出本发明制备方法的实施例，对本发明作进一步描述。本发明所选用的人正常肝细胞changliver、肝癌细胞株smmc7721、bel7402均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，为公开的生物材料。

实施例1实验方法

1.1样品和试剂的配制

样品用甲醇配成浓度为50mg/ml的母液，经0.22μm膜过滤后，于4℃备用。

pbs缓冲液：137mmol/lnacl，2.7mmol/lkcl，4.3mmol/lna2hpo4，1.4mmol/lkh2po4(ph7.3)，121℃，40min高压灭菌。

mtt溶液：称取250mgmtt，加50ml的pbs缓冲液，搅拌30min，0.22μm滤膜过滤除菌后，分装，4℃保存，两周内有效。

1.2细胞培养

人正常肝细胞changliver、肝癌细胞株smmc7721、bel7402均用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液于37℃,5％co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.3mtt法

将对数生长期的细胞，用胰酶消化后计数，按照每孔2500个细胞接种入96孔板中，于37℃，5％co2培养箱中培养24h。每孔中加入含有不同浓度药物的培养基200μl(gyptn-1为0,20,40,80,100μg/ml或绞股蓝总皂苷和gypxlvi均为0,25,50,100,200,400μg/ml)继续培养。加药组(加细胞和加药)和对照组(加细胞不加药)均设3组重复，并设有8组空白对照(不加细胞)。

经过药物处理48h后，每孔加20μl的mtt(5mg/ml)后置于37℃温育4h，终止培养，吸弃上清并加入150μl的dmso使结晶物充分溶解，用微孔板快速振荡器振荡10min，最后用酶标仪测定570nm波长下的光吸收值a。

细胞生长抑制率＝(a对照组-a加药组)÷(a对照组-a空白)×100％

1.4集落形成实验

(1)取对数生长期细胞，用edta-胰酶消化细胞并进行细胞计数，并于6孔板中，每孔中接种2ml，使每孔接种细胞1000个。

(2)在6孔板的每孔中加入2ml稀释好的细胞悬液，在5％co2，37℃培养箱中培养24h。

(3)然后加入一系列含有不同浓度梯度药物的培养基2ml(gyptn-1为0,5,10μg/ml或gypxlvi均为0,10,20μg/ml)继续培养。同时设置对照组(只加细胞不加药)。

(4)连续培养15天，每3天换液一次，至第15天终止培养，弃培养液，pbs洗两次，用4％的多聚甲醛溶液固定30min，然后用0.1％的结晶紫固定30min，蒸馏水漂洗2次，空气干燥，然后用扫描仪扫描整个6孔板底部。集落数量，并以下列公式计算集落抑制率：

集落抑制率(％)＝(1-集落数给药÷集落数对照)×100％

1.5ao/eb荧光染色

(1)取对数生长期细胞，用edta-胰酶消化细胞并进行细胞计数，并调节细胞浓度至25000个/ml，并每孔中接种100μl，使每孔接种细胞2500个。

(2)在96孔板的每孔中加入100μl稀释好的细胞悬液，在5％co2，37℃培养箱中培养24h。

(3)然后加入一系列不同浓度梯度柯里拉京的培养基200μl(gyptn-1为0,100μg/ml或gypxlvi均为0,200μg/ml)继续培养。

(4)药物处理48h后，吸去培养基，加100μl荧光染色液(含50μg的ao/eb)染色5min，pbs洗2次，荧光显微镜下观察拍照，随机取5个视野，分别计数呈绿色荧光和橙红色荧光的细胞。

1.6数据统计

采用spss22.0统计软件进行处理，所有数据以mean±sd表示，并进行t检验和显著性分析。

实施例2结果与分析

2.1绞股蓝皂苷tn-1体外细胞毒活性

采用mtt法测定不同浓度的绞股蓝皂苷tn-1(0,20,40,80,100μg/ml)对人正常肝细胞changliver和肝癌细胞株smmc7721，bel7402药物处理48h，然后通过计算570nm下吸光值a的变化，从而得到药物对细胞株的抑制率曲线。

如图1所示，从抑制曲线的结果来，绞股蓝皂苷tn-1对这三株细胞都具有比较明显的细胞毒作用，且呈浓度依赖性，通过统计软件spss22.0计算得出gyptn-1对细胞株changliver、smmc7721和bel7402的半抑制浓度ic50，分别为47.7±11.59，36.65±12.31，53.42±5.83μg/ml。

2.2gyptn-1抑制肝癌细胞smmc7721集落形成

本研究测定不同浓度的绞股蓝皂苷tn-1(0,5,10μg/ml)对肝癌细胞smmc7721处理两周后，对细胞集落进行结晶紫染色处理，然后对细胞集落进行拍照和计数，结果如图2及图3所示。通过统计表明，在10μg/ml药物浓度下gyptn-1对肝癌细胞smmc7721的抑制率为60.53±3.16％。

2.3绞股蓝皂苷tn-1抗肝癌活性ao/eb荧光显微观察

由于ao(吖啶橙)能够穿过完整的细胞膜使dna染色并发出绿色荧光，而eb(溴化乙锭)只能穿过受损的细胞膜使dna染色并发出橘红色荧光。因此，如图4所示，ao/eb荧光染色后正常细胞呈现绿色荧光，死亡细胞呈现橘红色荧光。染色结果表明：100μg/ml的gyptn-1能够明显使得3个细胞株changliver、smmc7721、bel7402都出现橘红色荧光，即是细胞出现死亡现象。该结果说明gyptn-1具有抗肝癌活性。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。