呋喃香豆素类化合物在制备抗过敏药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及呋喃香豆素类化合物在制备抗过敏药物中的应用。

背景技术：

药物类过敏反应是源于药物直接刺激肥大细胞或嗜碱性粒细胞，导致肥大细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶、组胺等活性递质而引发。在临床上，患者首次用药时即有可能发生类过敏反应，结果不仅给患者带来巨大的经济负担，也会造成新的痛苦甚至生命威胁。研究发现人源mrgprx2受体(mas相关g蛋白欧联受体x2)可介导类过敏反应，当药物刺激人源mrgprx2受体后，可引起肥大细胞钙离子浓度升高而引发脱颗粒反应，进而导致类过敏反应发生。临床上所用的抗过敏药物主要包括抗组胺类药物，过敏反应介质阻释剂及激素类药物。拮抗mrgprx2受体可以使得类过敏反应停滞在源头，但拮抗mrgprx2受体的抗过敏药物还是一片空白，因此mrgprx2受体拮抗剂的研究越来越受到人们的关注，药物拮抗mrgprx2受体的目的主要是使得从源头防止类过敏反应的发生，从根本上解决类过敏反应的危害，开发利用mrgprx2受体拮抗剂或先导化合物对抗过敏候选药物开发具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种呋喃香豆素类化合物在制备抗过敏药物中的应用，丰富了抗过敏药物类型，为抗过敏治疗提供了全新的选择和策略。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种呋喃香豆素类化合物在制备抗过敏药物中的应用。

优选地，所述呋喃香豆素类化合物为欧前胡素、异欧前胡素或珊瑚菜素。

优选地，所述抗过敏药物为用于拮抗mrgprx2受体的药物。

优选地，所述抗过敏药物为用于抑制人肥大细胞ku812的β-氨基己糖苷酶释放的药物。

优选地，所述抗过敏药物为临床可接受的药物制剂。

优选地，所述的药物制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明首次证实了呋喃香豆素类化合物可以有效拮抗由化合物48/80(c48/80)引起人肥大细胞ku812的β-氨基己糖苷酶释放，进而可以抑制类过敏反应；将呋喃香豆素类化合物制备成抗过敏制剂，将丰富抗过敏药物类型，为抗过敏治疗提供了全新的选择和策略。

附图说明

图1为不同浓度的欧前胡素抑制由c48/80引起的ku812的β-氨基己糖苷酶释放结果图，其中，c48/80作为阴性对照药物，以tm缓冲液作为空白对照(control)。

图2为不同浓度的异欧前胡素抑制由c48/80引起的ku812的β-氨基己糖苷酶释放结果图，其中，c48/80作为阴性对照药物，以tm缓冲液作为空白对照(control)。

图3为不同浓度的珊瑚菜素抑制由c48/80引起的ku812的β-氨基己糖苷酶释放结果图，其中，c48/80作为阴性对照药物，以tm缓冲液作为空白对照(control)。

图4为欧前胡素在mrgprx2-hek293细胞膜色谱柱上的保留行为。

图5为异欧前胡素在mrgprx2-hek293细胞膜色谱柱上的保留行为。

图6为珊瑚菜素在mrgprx2-hek293细胞膜色谱柱上的保留行为。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

欧前胡素(结构式如式i)，异欧前胡素(结构式如式ii)和珊瑚菜素(结构式如式iii)是通过前期mrgprx2受体高表达细胞膜色谱(cmc)筛选发现，这三种呋喃香豆素类化合物与mrgprx2受体有很好的亲和力。因此，根据其与mrgprx2受体的亲和作用，申请人运用体外细胞药理学实验，采用细胞表面高表达mrgprx2受体的ku812细胞模型，考察了它们对由c48/80引起的ku812的β-氨基己糖苷酶释放的抑制作用。研究结果表明：三种呋喃香豆素类化合物(欧前胡素，异欧前胡素和珊瑚菜素)可以有效的抑制由c48/80引起的ku812的β-氨基己糖苷酶的释放，说明这三种呋喃香豆素类化合物是潜在的制备抗过敏的药物。

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

1.实验材料

仪器：全自动微板读取仪购于bio-rad公司(加利福尼亚，美国)。

细胞系：ku812培养在10％血清的imem培养基中，加1∶100青霉素-链霉素。培养基每隔天用新鲜培养基半置换使细胞维持在2×10⁶个细胞每毫升的密度。

主要试剂：tm缓冲溶液(组成(g/l)：6.954的nacl，0.353的kcl，2.383的hepes，0.162的kh2po4，0.282的cacl2，0.143的mgso4，0.991的葡萄糖，1的牛血清白蛋白。二甲基亚砜购自广州市金华大化学试剂有限公司，c48/80购自sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)。欧前胡素，异欧前胡素和珊瑚菜素均购自成都普菲德生物科技有限公司(成都，中国)。tritonx-100购于科昊生物工程公司(西安，中国)，d-glucose天津科密欧化学试剂公司(天津，中国)，牛血清白蛋白和hepes购自mp生物医学有限公司(法国)。

2.实验方法

(1)β-氨基己糖苷酶释放

将ku812细胞接种于96孔板中，30000个细胞/孔，培养过夜。96孔板经过1500rpm离心5min后，吸弃原培养基，根据预设的分组，分别加入不同的药物：空白对照组加入90μltm缓冲液，给药组加入90μl待测试药物的30μg/mlc48/80溶液，阴性对照组加入90μl30μg/mlc48/80溶液。于培养箱37℃孵育30min，后1500rpm离心5min，各孔分别吸取50μl至新孔。再将阴性对照组的剩余tm缓冲液吸弃后，加90μl0.1％tritonx-100裂解液，吹打，静置5min，然后1500rpm离心5min后取50μl至新孔为裂解组。向各孔加入50μlβ-氨基己糖。37℃孵育90min后加入150μl/孔的na2co3/nahco3终止液，放置于摇床上以50转/min的频率混匀2min。于405nm测定其吸光度。

按以下公式计算β-氨基己糖苷酶释放率。

β-氨基己糖苷酶释放率＝(测试组od值/(空白对照组od值+裂解组od))×100％；

其中，所述测试组od值为空白对照组od值、给药组od值或者阴性对照组od值。

3.实验结果

数据用均数±标准误(mean±sem)表示，图表绘制应用graphpadprism5.0软件。经统计，各组化合物抑制ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放的结果如表1-3.

欧前胡素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放结果展示在表1和图1中，其中，control为空白对照组，c48/80为阴性对照组，不同浓度表示给药组中的欧前胡素的浓度。

表1欧前胡素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放率(％)

图1为欧前胡素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放图(相对于阴性对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝4)。

由表1及图1发现10μm，50μm，100μm和200μm的欧前胡素对比于阴性对照组，在统计学上，具有显著性差异(p<0.05)。说明欧前胡素可以剂量依赖性地抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放。

异欧前胡素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放结果展示在表2和图2中，其中，control为空白对照组，c48/80为阴性对照组，不同浓度表示给药组中的异欧前胡素的浓度。

表2异欧前胡素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放率(％)

图2为异欧前胡素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放图(相对于阴性对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝4)。

由表2及图2发现10μm，50μm，100μm和200μm的异欧前胡素对比于阴性对照组，在统计学上，具有显著性差异(p<0.001)。说明异欧前胡素可以剂量依赖性地抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放。

珊瑚菜素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放结果展示在表3和图3中，其中，control为空白对照组，c48/80为阴性对照组，不同浓度表示给药组中的珊瑚菜素的浓度。

表3珊瑚菜素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放率(％)

图3为珊瑚菜素抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放图(相对于阴性对照组，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝4)

由表3及图3发现50μm的珊瑚菜素对比于阴性对照组，在统计学上，具有显著性差异(p<0.05)。说明珊瑚菜素可以剂量依赖性地抑制抑制由c48/80引起的ku812细胞的β-氨基己糖苷酶释放。

实施例2

1.实验材料

仪器：lc-2010aht(shimazu)，自制装柱机。

细胞系：mrgprx2-hek293细胞培养在培养基为10％的胎牛血清的dmem培养基中，加1∶100青霉素-链霉素的5％co2，37℃的环境中。培养基隔天用新鲜培养基置换使细胞健康生存。

主要试剂：dmem培养基与胎牛血清均购自hyclone(犹他州洛根市，美国)，大孔硅胶购自青岛美高集团有限公司(青岛，中国)。

2.实验方法

2.1mrgprx2-hek293细胞膜固定相的制备

取上述mrgprx2-hek293细胞(约7×10⁶个细胞)混悬液，在1000rpm,4℃条件下用离心5min，弃上清，取底层细胞；将离心好的细胞用5ml生理盐水洗2遍，再将已得到的细胞加tris-hcl5ml在冰浴条件下超声30min破碎，再用细胞破碎仪(400w,8次，每次3s)破碎后，5000rpm条件离心10min，取上清液；在12000g下离心20min，弃上清，用10ml生理盐水吹散后得细胞膜混悬液。称取相应量的大孔硅胶45mg(已纯化过，5μm，)放于105℃烘箱活化30min。将上述装有已活化好的硅胶的具支试管中放在冰中，用10ml注射器中，在涡旋状态下把细胞膜混悬液与硅胶充分混合5min后，用磁力搅拌器搅拌30min(4℃冰箱中)后，4℃冰箱中放置过夜；次日，用5ml生理盐水在800g离心力条件下离心5min，3遍。以洗去未接合在硅胶上的细胞膜。

2.2mrgprx2-hek293细胞膜色谱柱的制备

用自制装柱机进行装柱，装柱流速2.0ml/min，装柱时间10min，色谱柱放4℃冰箱中待用。

2.3mrgprx2-hek293细胞膜的色谱条件

mrgprx2-hek293细胞膜的色谱条件是流动相为水，流量为0.2ml/min，柱温37℃，检测器波长为254nm。

2.4欧前胡素，异欧前胡素及珊瑚菜素在mrgprx2-hek293细胞膜色谱柱上的保留行为

分别记录1.0mg/ml的欧前胡素，1.0mg/ml异欧前胡素及1.0mg/ml珊瑚菜素在mrgprx2-hek293细胞膜色谱柱上的保留行为。

3.实验结果

1.0mg/ml的欧前胡素，1.0mg/ml异欧前胡素及1.0mg/ml珊瑚菜素在mrgprx2-hek293细胞膜色谱柱上的保留行为分别如图4，图5及图6。欧前胡素、异欧前胡素和珊瑚菜素在mrgprx2-hek293细胞膜色谱柱上均有良好的保留，证明欧前胡素、异欧前胡素和珊瑚菜素作用在mrgprx2受体上。

4.结论

通过上述实验结果表明，呋喃香豆素类化合物(欧前胡素，异欧前胡素和珊瑚菜素)均能有效拮抗由c48/80引起的ku812的β-氨基己糖苷酶释放，其中以欧前胡素和异欧前胡素为最佳。

综合以上实验可以得出，本发明发现了呋喃香豆素类化合物(欧前胡素，异欧前胡素和珊瑚菜素)新的药理作用，即其具有良好的拮抗由c48/80引起的ku812的β-氨基己糖苷酶释放作用，开拓了中药组分新的临床应用领域，对开发抗过敏药物具有重要意义。

本发明公开了一种呋喃香豆素类化合物在制备抗过敏药物中的应用，本发明首次发现呋喃香豆素类化合物具有拮抗肥大细胞由c48/80引起的类过敏反应的作用，且作用的受体为mrgprx2受体。对呋喃香豆素类化合物进行体外细胞实验，选择了表明高表达mrgprx2受体的人肥大细胞系ku812。考察了它们对由c48/80引起人肥大细胞ku812的β-氨基己糖苷酶释放的拮抗作用。研究结果表明呋喃香豆素类化合物可以有效地拮抗由c48/80引起人肥大细胞ku812的β-氨基己糖苷酶释放，说明呋喃香豆素类化合物是潜在的用于制备抗过敏的药物，本发明为目前类过敏反应的治疗提供了一种全新的选择和思路，拓宽了抗过敏药物的选择领域，也为该技术领域的发展做出了贡献；本发明是具有明确化学结构的化合物，用于制药时可量化投料，用于制备现代剂型，具有发展成为抗过敏药物的潜力。

本发明是具有明确化学结构的化合物，用于制药时可量化投料，有利用于制备现代剂型。