益母草总生物碱在制备具有促血管生成作用的药物中的用途的制作方法

本发明涉及益母草总生物碱的用途。

背景技术：

产后出血、冠心病、脑梗死等各种缺血性疾病严重危害人类健康，通过药物治疗是目前治疗的主要方法，通过药物促进缺血组织在原有微血管基础上形成新毛细血管，并与原有血管网相交汇，改善供血。因此，寻找促血管生成的药物成为现在治疗缺血性疾病的研究热点。

中药成分极其复杂，其有效作用成分大多还未弄清楚，导致了多年来中药无法打入国际市场。益母草做药用已有悠久的历史，其为唇形科益母草属植物leonurusjaponicushoutt.的新鲜或干燥地上部分,原名茺蔚,始载于,别名益母艾、苦草、坤草等,其味辛、微苦,性微寒,入心包、肝经,具有活血调瘀、调经利水的功能。随着人们对益母草认识的加深和现代科学技术的进步，越来越多的药理活性被发现，尤其是益母草总生物碱在妇科疾病上的应用越来越多，而关于益母草总生物碱促血管生成的研究未见报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了益母草总生物碱促血管生成的新用途。

首先，本发明提供了益母草总生物碱在制备具有促血管生成作用或者修复血管损伤的药物中的用途。

其中，所述的药物是用于治疗缺血性疾病的药物。

其中，所述的药物是用于治疗缺血性心脑血管疾病的药物。

其中，所述的药物是用于治疗冠心病、心绞痛、动脉硬化、脑血栓、脑缺血或者治疗产后出血的药物。

其中，所述的药物是由益母草总生物碱为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述的制剂包括但不限于注射剂、粉针剂、片剂、胶囊、软胶囊、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂、散剂、膏剂、油剂、栓剂、涂膜剂、凝胶剂。

本发明还提供了一种制备益母草总生物碱的方法，包括如下步骤：

a、称取益母草药材，用盐酸水溶液进行提取，过滤；

b、将益母草提取物上阳离子交换树脂，洗脱，收集洗脱液，调ph至中性，滤液浓缩后干燥，得干燥固体；

c、将干燥固体加乙醇提取生物碱，即可。

步骤a中盐酸水溶液的浓度为0.5％；所述提取的次数为2次，第1次用10倍量的盐酸水溶液提取，第2次用8倍量的盐酸水溶液提取；所述提取的温度为80℃。

步骤b中，所述阳离子交换树脂是732型强酸型阳离子交换树脂，所述洗脱的方法是：先以水洗至近中性，再以nacl溶液洗脱，洗脱至生物碱反应呈阴性为止，收集洗脱液；优选地，所述nacl溶液的浓度为3mol/l；

和/或，步骤c中，所述乙醇提取的方法是：取干燥固体，加6倍量无水乙醇超声提取3次，超声功率为360w，每次20分钟。

本发明还提供了一种药物组合物，它是由前述方法制备的益母草总生物碱为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

斑马鱼被广泛应用于中药的不同提取部位的药效评价。中药有效部位新药是近期国内中药企业研发的热点之一，这主要是由于有效部位体现了中药的药效成分，符合西药的研发思路。利用斑马鱼来筛选药物就成为一个热点，因为斑马鱼具有与人类高度相似度额基因组，具有与步入动物相似的心血管、造血、神经及代谢等系统们大量高度一致的活性代谢产物，并呈现出与人类十分相似的生理学特征。一些已知的药物在斑马鱼上也出现了相似的治疗效果。本发明实验证实，本发明益母草总生物碱应用于斑马鱼，可以有效促进血管生成，且血管生成与益母草总生物碱呈剂量依赖性。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种以益母草总生物碱为活性成分的促血管生成的药物，对缺血性疾病和产后出血都有很好的治疗作用。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为不同浓度益母草总生物碱对斑马鱼胚胎体节间血管指数的影响；

图2为不同浓度益母草总生物碱对斑马鱼体节间血管生成的影响的荧光显微成像图。

具体实施方式

实施例1益母草总生物碱的制备

树脂的预处理：732型强酸型阳离子交换树脂以去离子水浸泡过夜，并洗至去离子水近无色；先加入5倍量5％hcl水溶液浸泡1h左右，随时搅拌，用去离子水洗至流出水近中性；后加入5倍量5％naoh溶液浸泡1h，随时搅拌，用去离子水洗至流出水近中性；最后加入5倍量5％hcl水溶液浸泡2h左右，使阳离子交换树脂转换为h型，并用去离子水洗至近中性。

称取益母草药材5kg，采用0.5％的盐酸水溶液80℃提取2次，溶剂用量分别是10、8倍，提取时间各为1.5h，过滤，将过滤后的益母草提取液(ph1～2)上预处理好的阳离子交换树脂，先以去离子水洗至近中性，弃去水洗液。再以3mol/lnacl溶液洗脱，以6bv/h洗脱至生物碱反应呈阴性为止，收集洗脱液，加饱和氢氧化钠溶液调节ph至中性，滤液浓缩后干燥。取干燥固体加6倍量无水乙醇超声提取3次，超声功率为360w，每次20分钟，提取液减压浓缩，即得益母草药材总碱提取物(96.9g)。

通过以下试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1益母草总生物碱促进斑马鱼血管生成实验

(1)实验材料

①药物及制备

供试药物，益母草，采自四川省西昌市冕宁县，由成都中医药大学中药鉴定教研室任李敏教授鉴定为益母草l.japonicus的干燥块茎。益母草的总生物碱采取实施例1的方法制备。

益母草总生物碱用dmso配置成50mg/ml的贮备液，-10℃保存。苏尼替尼(sunitinib，北京百灵威科技有限公司，批号：le70p63)。

②斑马鱼

无病原体斑马鱼[血管绿色荧光标记的转基因tg(flk1：egfp)]，由成都中医药大学药学院斑马鱼实验平台培养繁殖。

③试剂

试药使用前用二甲基亚砜(dmso，美国sigmaaldrich公司)

溶解为母液；斑马鱼拍照时用固定液(4％甲基纤维素溶于培养液中)固定；苏尼替尼(sunitinib，北京百灵威科技有限公司，批号：le70p63)。

④实验仪器

斑马鱼繁育与养殖系统(北京爱生科技公司)；

axioobservera1荧光倒置显微成像系统(德国zeiss公司)；

m165-fc体式荧光显微成像系统(德国leica公司)；

恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；

al104电子天平(瑞士mettlertoled公司)；；

水浴锅，低温冰箱等。

(2)实验方法：

①斑马鱼饲养和繁育条件

斑马鱼饲养于全封闭循环系统，养殖和繁殖均参照zebrafishbook标准，斑马鱼房内光照/黑暗比为14h/10h，室内温度26℃，水温28℃,ph7.2-7.5，电导率500-550μs/cm，其各项水质指标均合要求。繁育前，将雌雄以1:1数量移入产卵盒，并用隔板将雌雄分开，次日清晨移去隔板雄鱼追逐雌鱼后30min便可收集胚胎。胚胎用培养液清洗干净移入无菌培养皿后，置于28.5℃恒温培养箱中。

②药物处理

选择发育正常的10hpf胚胎期斑马鱼(flk1-egfp)随机放入24孔板中，每孔10枚，每组50枚。分别按照空白对照组、模型组(药液中含有1.5μg/mlsunitinib)、给药组(药液中含有1.5μg/mlsunitinib和浓度分别为100、50、25、12.5、6.25μg/ml的益母草总碱)，将相应浓度药物溶解于胚胎培养液中，每孔分别加入1500μl各工作液，于28.5℃恒温箱中待斑马鱼胚胎发育至48hpf后，在体式荧光显微镜下观察斑马鱼体节间血管(isvs)的生长情况，并利用成像系统拍摄照片。

③斑马鱼体节间血管指数(isvindex)的计算

统计斑马鱼体节间血管指数(isvindex)，包括完整血管数×1加不完整血管数×0.5(从卵黄囊之后的节间血管开始计算)。

③实验结果和评价：

结果表明，如图1与图2所示，与模型组相比，各个给药浓度均有血管新生，且给药浓度越大斑马鱼节间血管指数越大，呈剂量依赖性。给药浓度为100μg/ml时，斑马鱼胚胎体节间血管指数接近于空白对照组，此时斑马鱼血管新生效果最佳，12.5μg/ml时有血管生成，但效果减弱。12.5-100μg/ml的益母草总碱能显著促进斑马鱼体节间血管生成(p＜0.01)。

实验结果证明，本发明益母草总生物碱可以有效修复血管损伤，促进血管生成，可以制备成为促血管生成药物，临床应用前景优良。