本发明涉及水产养殖领域，具体是一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法。
背景技术：
免疫刺激剂((immunologic stimulant)是指能够调节动物免疫系统并激活免疫机能，增强机体对细菌和病毒等传染性病原体抵抗力的一类物质。近年来，国内、外均开展了将免疫刺激剂用于水产养殖动物传染性疾病预防的研究，其主要目的是为了将免疫刺激剂用于预防使用化学药物难于奏效的水产养殖动物的病毒和细菌性疾病。
鱼类的免疫机制可以分为特异性和非特异性免疫，所谓非特异性免疫就是机体对非特定的病原体的防御机制，其中分布在鱼类体表粘液，血液和肾脏等器官中的溶菌酶(lysozyme)，就是一种在补体(complement)的协同作用下，可以将细菌溶解的酶补体是存在于鱼类粘液和血液中的一组蛋白质，其活化途径有两条:一是能被抗原抗体复合物激活的经典激活途径，二是能被与抗体无关的细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和肽聚糖等激活的替代途径。无论哪种途径活化的补体都能将菌体溶解。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种肠膜明串珠菌菌种生长繁殖速度快，菌粉收获量大的大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法。制备得到的免疫刺激剂安全、转染效果好，可明显提高大黄鱼的非特异性免疫。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：NTM048 菌株购于位于日本千叶县木更津市 (2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi， Chiba，Japan)的独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，其保藏号为NITE BP-1519，分类命名为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。
一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法，包括以下步骤：
1）斜面活化培养：将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养，pH为6.0~6.5，温度为20~25℃，活化培养时间为12~24h，在培养基中加入1~2倍的无菌水，搅拌均匀得到种子液。斜面培养基成分及其重量份为：60~70份蔗糖、20~30份麦芽糖、5~6份酵母膏、5~6份大豆蛋白胨、0.005~0.008份生物素、0.01~0.02份FeSO4·7H2O、0.2~0.3份MgSO4·7H2O、 0.01~0.02份MnSO4·H2O、3.2~4.8份K2HPO4·3H2O、0.5~0.9份KH2PO4、0.04~0.06份CaCl2·6H2O、0.2~0.5份NaCl、0.1~0.2份吐温-20、10~20份琼脂和1000~1200份水；
2）一级摇瓶培养：将种子液按3~10%的接种量转接到一级种摇瓶中，恒温摇床培养，pH为6.0~6.5，温度为20~25℃，摇床转速为100~150r/min，培养时间为12~36h；
3）二级摇瓶培养：将一级摇瓶培养得到的菌液按3~10%的接种量转接到二级种摇瓶中，进行恒温振荡培养，pH为6.0~6.5，温度为20~25℃，摇床转速为100~200r/min，培养时间为12~36h；
4）发酵罐培养：将二级种摇瓶培养后的菌液按3~10%的接种量接种到消毒灭菌过的发酵罐中，发酵罐培养，pH为6.0~6.5，温度为25~30℃，摇床转速为150~250r/min。发酵培养基成分及其重量份为：100~120份蔗糖、50~60份麦芽糖、5~6份酵母浸出物、5~6份大豆蛋白胨、0.001~0.003份（S）-4-苄基-2-唑烷酮、0.01~0.02份FeSO4·7H2O、0.2~0.3份MgSO4·7H2O、 0.01~0.02份MnSO4·H2O、3.2~4.8份K2HPO4·3H2O、0.5~0.9份KH2PO4、0.04~0.06份CaCl2·6H2O、0.04~0.06份NaCl、0.1~0.2份吐温-20和1000~1200份水。发酵过程中补充培养基，得到发酵液。发酵期间补充培养基，12~12.5h后第一次补加发酵培养基，并添加18~22%甘油，20~20.5h后第二次补加发酵培养基，24~26h后第三次补加发酵培养基，发酵至46~50h。菌种的活力旺盛，生长繁殖速度快，接种到发酵罐中后菌种快速生长，并迅速进入对数期，发酵16~20h进入稳定期。在发酵期间，（S）-4-苄基-2-唑烷酮和培养基中其他成分有耦合作用，促使菌种分裂增殖形成新细胞，生成的细胞壁中壳聚糖结构中氮元素含量提高，壳聚糖活性官能团被修饰，降低了壳聚糖的生理活性，大幅降低其危险性；
5）菌粉制备：通过离心或过滤或磁分离发酵液得到湿肠膜明串珠菌，用无菌水或PBS洗涤后，超声破碎处理，冷冻干燥得到肠膜明串珠菌菌粉。超声破碎条件为：超声破碎功率为430~460W，破碎时间为17~23min，时间间隔为10：8s/s；
6）免疫刺激剂制备：在3~5份肠膜明串珠菌菌粉中加入10~20份β-1,3-葡聚糖，在20~25℃温度下搅拌1~2h，再加入1~3份炙黄芪提取物、1~3份潞党参提取物、1~3份制首乌提取物、1~3份肉苁蓉提取物和3~5份积雪草提取物，混合均匀后冷冻干燥得到免疫刺激剂。上述免疫刺激剂可活化抗原呈递细胞，并能提高溶菌酶和补体的活性，增加机体中补体的C3成分;不仅可以增强巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬活性，而且还可以提高这些细胞的杀菌活性;激活自然杀伤细胞(NK)，增强其杀伤异物细胞的活性外，还能促进巨噬细胞白细胞介素一2(interleukin-2, IL-2)。肠膜明串珠菌菌粉、β-1,3-葡聚糖与中草药提取物（炙黄芪提取物、潞党参提取物、制首乌提取物、肉苁蓉提取物和积雪草提取物）有耦合作用，能抑制 LPS引起的 p65亚基核转运。通过抑制 NF-κB转录活性,从而抑制下游炎症因子 IL-6、TNF-α的释放而发挥抗炎效应。与此同时, 还促进 IL-10的产生 , 维持促炎因子和抗炎因子之间的平衡 。并且还能通过活化衰老细胞NF-κB的核转位，增强NF-κB与IL-2启动子的结合，提高IL-2表达，延缓衰老细胞免疫功能衰退。综上所述，上述免疫刺激剂通过活化抗原呈递细胞，并增强巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬活性和杀菌活性，同时延缓衰老细胞免疫功能的衰退来提高大黄鱼的非特异性免疫，从而大大降低大黄鱼对细菌和病毒等传染性病原体抵抗力，提高大黄鱼的存活率。
作为优选，一级种摇瓶培养基成分及其重量份为：90~100份蔗糖、30~40份麦芽糖、5~6份酵母膏、5~6份大豆蛋白胨、5~8份柠檬酸二铵、5~8份乙酸钠、0.01~0.02份FeSO4·7H2O、0.2~0.3份MgSO4·7H2O、 0.01~0.02份MnSO4·H2O、3.2~4.8份K2HPO4·3H2O、0.5~0.9份KH2PO4、0.04~0.06份CaCl2·6H2O、0.2~0.5份NaCl、0.1~0.2份吐温-20和1000~1200份水。
作为优选，二级种摇瓶培养基成分及其重量份为：100~120份蔗糖、50~60份麦芽糖、5~6份酵母膏、5~6份大豆蛋白胨、5~8份柠檬酸二铵、5~8份乙酸钠、0.01~0.02份FeSO4·7H2O、0.2~0.3份MgSO4·7H2O、 0.01~0.02份MnSO4·H2O、3.2~4.8份K2HPO4·3H2O、0.5~0.9份KH2PO4、0.04~0.06份CaCl2·6H2O、0.2~0.5份NaCl、0.1~0.2份吐温-20和1000~1200份水。上述一级种摇瓶培养基和二级种摇瓶培养基中营养物质充足，能满足肠膜明串珠菌生长繁殖的需求，培养得到的菌种细胞呈对或短链状排列，细胞壁厚度高于MS培养基培养的肠膜明串珠菌细胞壁。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明方法制备的免疫刺激剂生理活性低，安全、转染效果好，通过活化抗原呈递细胞，并增强巨噬细胞和嗜中性白细胞的吞噬活性和杀菌活性，同时延缓细胞免疫功能的衰退来提高大黄鱼的非特异性免疫，从而大大降低大黄鱼对细菌和病毒等传染性病原体抵抗力，提高大黄鱼的存活率。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法，包括以下步骤：
1）斜面活化培养：将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养，pH为 6.5，温度为22℃，活化培养时间为12h，在培养基中加入1.5倍的无菌水，搅拌均匀得到种子液。斜面培养基成分及其重量份为：65份蔗糖、25份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、0.007份生物素、0.02份FeSO4·7H2O、0.26份MgSO4·7H2O、0.01份MnSO4·H2O、4.2份K2HPO4·3H2O、0.8份KH2PO4、0.05份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20、15份琼脂和1000份水；
2）一级摇瓶培养：将种子液按3~10%的接种量转接到一级种摇瓶中，恒温摇床培养，pH为6.5，温度为22℃，摇床转速为100r/min，培养时间为24h。一级种摇瓶培养基成分及其重量份为：100份蔗糖、35份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、6份柠檬酸二铵、7份乙酸钠、0.01份FeSO4·7H2O、0.27份MgSO4·7H2O、 0.01份MnSO4·H2O、4.3份K2HPO4·3H2O、0.7份KH2PO4、0.05份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水；
3）二级摇瓶培养：将一级摇瓶培养得到的菌液按3~10%的接种量转接到二级种摇瓶中，进行恒温振荡培养，pH为6.5，温度为22℃，摇床转速为150r/min，培养时间为24h。二级种摇瓶培养基成分及其重量份为：100份蔗糖、55份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、6份柠檬酸二铵、6份乙酸钠、0.01份FeSO4·7H2O、0.2份MgSO4·7H2O、0.01份MnSO4·H2O、4.3份K2HPO4·3H2O、0.7份KH2PO4、0.05份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水；
4）发酵罐培养：将二级种摇瓶培养后的菌液按5%的接种量接种到消毒灭菌过的发酵罐中，发酵罐培养，pH为6.5，温度为28℃，摇床转速为200r/min。发酵培养基成分及其重量份为：110份蔗糖、55份麦芽糖、5.7份酵母浸出物、5.6份大豆蛋白胨、0.002份（S）-4-苄基-2-唑烷酮、0.01份FeSO4·7H2O、0.27份MgSO4·7H2O、 0.01份MnSO4·H2O、4.1份K2HPO4·3H2O、0.8份KH2PO4、0.05份CaCl2·6H2O、0.05份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水。发酵过程中补充培养基，得到发酵液。发酵期间补充培养基，12h后第一次补加发酵培养基，并添加20%甘油，20h后第二次补加发酵培养基，24h后第三次补加发酵培养基，发酵至48h；
5）菌粉制备：通过离心发酵液得到湿肠膜明串珠菌，用PBS洗涤后，超声破碎处理，冷冻干燥得到肠膜明串珠菌菌粉。超声破碎条件为：超声破碎功率为450W，破碎时间为20min，时间间隔为10：8s/s；
6）免疫刺激剂制备：在4份肠膜明串珠菌菌粉中加入16份β-1,3-葡聚糖，在22℃温度下搅拌1.5h，再加入2份炙黄芪提取物、2份潞党参提取物、2份制首乌提取物、2份肉苁蓉提取物和4份积雪草提取物，混合均匀后冷冻干燥得到免疫刺激剂。
实施例2：
一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法，包括以下步骤：
1）斜面活化培养：将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养，pH为 6.0，温度为25℃，活化培养时间为12h，在培养基中加入1.5倍的无菌水，搅拌均匀得到种子液。斜面培养基成分及其重量份为：65份蔗糖、25份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、0.007份生物素、0.02份FeSO4·7H2O、0.25份MgSO4·7H2O、0.02份MnSO4·H2O、4.2份K2HPO4·3H2O、0.8份KH2PO4、0.05份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20、15份琼脂和1000份水；
2）一级摇瓶培养：将种子液按3~10%的接种量转接到一级种摇瓶中，恒温摇床培养，pH为6.0，温度为25℃，摇床转速为100r/min，培养时间为24h。一级种摇瓶培养基成分及其重量份为：100份蔗糖、35份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、5.5份柠檬酸二铵、7份乙酸钠、0.02份FeSO4·7H2O、0.27份MgSO4·7H2O、 0.02份MnSO4·H2O、4.6份K2HPO4·3H2O、0.7份KH2PO4、0.05份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水；
3）二级摇瓶培养：将一级摇瓶培养得到的菌液按3~10%的接种量转接到二级种摇瓶中，进行恒温振荡培养，pH为6.0，温度为25℃，摇床转速为150r/min，培养时间为24h。二级种摇瓶培养基成分及其重量份为：100份蔗糖、55份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、5.5份柠檬酸二铵、5.5份乙酸钠、0.02份FeSO4·7H2O、0.2份MgSO4·7H2O、0.02份MnSO4·H2O、4.6份K2HPO4·3H2O、0.7份KH2PO4、0.05份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水；
4）发酵罐培养：将二级种摇瓶培养后的菌液按5%的接种量接种到消毒灭菌过的发酵罐中，发酵罐培养，pH为6.0，温度为28℃，摇床转速为200r/min。发酵培养基成分及其重量份为：110份蔗糖、55份麦芽糖、5.7份酵母浸出物、5.5.5份大豆蛋白胨、0.002份（S）-4-苄基-2-唑烷酮、0.02份FeSO4·7H2O、0.27份MgSO4·7H2O、 0.02份MnSO4·H2O、4.1份K2HPO4·3H2O、0.8份KH2PO4、0.05份CaCl2·6H2O、0.05份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水。发酵过程中补充培养基，得到发酵液。发酵期间补充培养基，12h后第一次补加发酵培养基，并添加20%甘油，20h后第二次补加发酵培养基，24h后第三次补加发酵培养基，发酵至48h；
5）菌粉制备：通过过滤发酵液得到湿肠膜明串珠菌，用无菌水洗涤后，超声破碎处理，冷冻干燥得到肠膜明串珠菌菌粉。超声破碎条件为：超声破碎功率为450W，破碎时间为23min，时间间隔为10：8s/s；
6）免疫刺激剂制备：在5份肠膜明串珠菌菌粉中加入20份β-1,3-葡聚糖，在20℃温度下搅拌2h，再加入1份炙黄芪提取物、3份潞党参提取物、2份制首乌提取物、2份肉苁蓉提取物和5份积雪草提取物，混合均匀后冷冻干燥得到免疫刺激剂。
实施例3：
一种大黄鱼非特异性免疫刺激剂的制备方法，包括以下步骤：
1）斜面活化培养：将保藏号为 NITE BP-1519的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)接种到斜面培养基上进行活化培养，pH为 6.2，温度为24℃，活化培养时间为24h，在培养基中加入1.5倍的无菌水，搅拌均匀得到种子液。斜面培养基成分及其重量份为：65份蔗糖、24份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、0.007份生物素、0.02份FeSO4·7H2O、0.25份MgSO4·7H2O、0.02份MnSO4·H2O、4.7份K2HPO4·3H2O、0.8份KH2PO4、0.045份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20、16份琼脂和1000份水；
2）一级摇瓶培养：将种子液按6%的接种量转接到一级种摇瓶中，恒温摇床培养，pH为6.2，温度为24℃，摇床转速为100r/min，培养时间为24h。一级种摇瓶培养基成分及其重量份为：100份蔗糖、35份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、5.5份柠檬酸二铵、7份乙酸钠、0.02份FeSO4·7H2O、0.27份MgSO4·7H2O、 0.02份MnSO4·H2O、4.7份K2HPO4·3H2O、0.7份KH2PO4、0.045份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水；
3）二级摇瓶培养：将一级摇瓶培养得到的菌液按6%的接种量转接到二级种摇瓶中，进行恒温振荡培养，pH为6.2，温度为24℃，摇床转速为150r/min，培养时间为24h。二级种摇瓶培养基成分及其重量份为：100份蔗糖、55份麦芽糖、5.5份酵母膏、5.5份大豆蛋白胨、5.5份柠檬酸二铵、5.5份乙酸钠、0.02份FeSO4·7H2O、0.2份MgSO4·7H2O、0.02份MnSO4·H2O、4.7份K2HPO4·3H2O、0.7份KH2PO4、0.045份CaCl2·6H2O、0.4份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水；
4）发酵罐培养：将二级种摇瓶培养后的菌液按5%的接种量接种到消毒灭菌过的发酵罐中，发酵罐培养，pH为6.2，温度为28℃，摇床转速为200r/min。发酵培养基成分及其重量份为：110份蔗糖、55份麦芽糖、5.7份酵母浸出物、5.5.5份大豆蛋白胨、0.002份（S）-4-苄基-2-唑烷酮、0.02份FeSO4·7H2O、0.27份MgSO4·7H2O、 0.02份MnSO4·H2O、4.1份K2HPO4·3H2O、0.8份KH2PO4、0.045份CaCl2·6H2O、0.045份NaCl、0.1份吐温-20和1000份水。发酵过程中补充培养基，得到发酵液。发酵期间补充培养基，24h后第一次补加发酵培养基，并添加20%甘油，20h后第二次补加发酵培养基，24h后第三次补加发酵培养基，发酵至48h；
5）菌粉制备：通过磁分离发酵液得到湿肠膜明串珠菌，用无菌水洗涤后，超声破碎处理，冷冻干燥得到肠膜明串珠菌菌粉。超声破碎条件为：超声破碎功率为450W，破碎时间为23min，时间间隔为10：8s/s；
6）免疫刺激剂制备：在5份肠膜明串珠菌菌粉中加入20份β-1,3-葡聚糖，在20℃温度下搅拌2h，再加入1份炙黄芪提取物、3份潞党参提取物、2份制首乌提取物、3份肉苁蓉提取物和5份积雪草提取物，混合均匀后冷冻干燥得到免疫刺激剂。
实施例4：
试验在6～9月份进行，将养殖大黄鱼网箱分成8组，5组网箱为试验组，3组为对照组，使用含免疫刺激剂的饲料（每公斤饲料添加免疫刺激剂50mg）投喂，连续投喂8周，统计自然发病死亡率，计算相对免疫保护率（Relative Percent Survival, RPS），RPS=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%。结果显示，实验组大黄鱼的病害发生率显著下降，平均成活率提高37.39%，相对免疫保护率RPS达84.40%，表明饲喂免疫刺激剂能增强大黄鱼在养殖中对病菌感染的抵抗力（表1）；
表1 大黄鱼养殖抗病试验结果
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。