一种具有清热解毒作用的药物组合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种具有清热解毒作用的药物组合物及其制备方法。

背景技术：

连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实。秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，晒干，习称“青翘”；果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”。传统医学认为，连翘苦寒，归心、肺、小肠经，功能清热解毒、消肿散结、疏散风热。中医认为，清热解毒之“毒”为火热壅盛所致的“热毒”或“火毒”，主要为温热病及热毒炽盛症。现代医学研究认为，清热解毒中药所解之“毒”包括细菌、病毒、内毒素等“外源性之毒”和氧自由基、细胞因子等“内源性之毒”。连翘为典型的清热解毒药，可用于温热病的各个阶段。

现代药理研究表明连翘具有抗炎、抗病原微生物、解热镇痛、镇吐、保肝等作用。其中，连翘提取物具有抗炎、抗氧化、抑菌等作用，连翘挥发油具有抑菌作用，而且文献报道(党珏等，连翘提取物和连翘挥发油对酵母致热大鼠的解热机制研究，天然产物研究与开发，2017，29:1542-1545)，连翘提取物、连翘挥发油均有解热作用。但目前未将连翘提取物与连翘挥发油共同制备清热解毒药物的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种组分精炼、具有良好清热解毒作用的药物组合物。本发明的另一目的在于提供该药物组合物的制备方法及用途。

本发明提供了一种具有清热解毒作用的药物组合物，它是含有如下体积配比的原料药制备而成的制剂：

连翘提取物1份、连翘挥发油0.01-1份。

其中，它是由如下体积配比的原料药制备而成的制剂：

连翘提取物1份、连翘挥发油0.01-1份。

其中，它是由如下体积配比的原料药制备而成的制剂：

连翘提取物1份、连翘挥发油0.048份。

其中，所述连翘提取物的连翘酯苷A含量≥6.0％、连翘苷含量≥0.5％。

其中，所述连翘提取物的制备方法如下：取连翘，粉碎，经水提醇沉方法提取，即可；

优选地，连翘提取物的制备方法如下：取连翘，粉碎，加水煎煮三次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液于60℃以下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20的清膏，放冷，加入4倍量乙酵，搅匀，静置2小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，即得。

其中，所述连翘挥发油的α-蒎烯含量为52.57％，β-蒎烯含量为18.07％。

其中，所述连翘挥发油的制备方法如下：

取青翘，粉碎、加水提取，收集挥发油、脱水，即可。

其中，它是以连翘提取物、连翘挥发油为活性成分，加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂；

其中，所述制剂为注射剂或口服制剂；

其中，所述口服制剂为凝胶剂、散剂、颗粒剂、口服液、片剂、丸剂。

本发明还提供了上述药物组合物的制备方法，它包括如下操作步骤：

(1)按配比称取原料药；

(2)混合，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

本发明还提供了上述药物组合物在制备具有清热、解毒作用的药物中的用途。

本发明由连翘提取物、连翘挥发油制备的药物组合物，配伍合理，各原料药配合使用发挥了协同增效作用，具有良好的清热解毒效果，为临床提供了一种新的药物选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1连翘提取物、连翘挥发油对干酵母致大鼠发热模型的作用。

图2连翘提取物、连翘挥发油对脂多糖(LPS)致大鼠发热模型的作用。

图3本发明组合物对干酵母致大鼠发热模型的协同解热作用。

具体实施方式

实施例1本发明组合物的制备

处方：连翘提取物1ml、连翘挥发油0.048ml。

制备方法：

1、连翘挥发油：可以是市售产品、或文献方法制备、或按照2015版《中华人民共和国药典》第四部“挥发油测定法”中甲法制备：1kg青翘打成粗粉，加6L水回流提取5h。将所得挥发油有无水硫酸钠脱水。

2、连翘提取物：可以是市售产品、或文献方法制备、或按照2015版《中华人民共和国药典》中规定的连翘提取物提取方法制备。每1mL相当于原药材2.67g，HPLC测定连翘酯苷A含量≥6.0％,连翘苷含量≥0.5％。

药典方法具体如下：取连翘，粉碎成粗粉，加水煎煮三次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液于60℃以下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20(室温)的清膏，放冷，加人4倍量乙酵，搅匀，静置2小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，即得。

3、混合：每1mL浓度为2.67g/mL的连翘提取物加入0.048mL挥发油即可。

连翘挥发油的提取率为1.8％，提取0.048mL连翘挥发油需要2.67g生药，连翘提取物的给药浓度为2.67g/mL，故连翘提取物+挥发油组的给药剂量配比为提取物：挥发油＝1：0.048，即每mL浓度为2.67g/mL的连翘提取物加入0.048mL挥发油。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例1本发明组合物的药效考察

一、发热模型的选择

1仪器与材料

1.1仪器电子分析天平(BP-211D型，德国Sartorius)、台式高速离心机(TG16-WS型，长沙湘仪离心机有限公司)、电子体温计(常山县亿思达电子有限公司)、足趾容积测试仪PV-200(成都泰盟软件有限公司)

1.2动物SD雄性大鼠，体重200g-240g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：SCXK(川)2013-15

1.3药物与试剂青翘(批号：1506009)，购自四川新荷花中药饮片股份有限公司；连翘提取物(成都市克洛玛生物科技有限公司，批号150311)阿司匹林肠溶片(批号：国药准字H53021845，云南白药集团股份有限公司)；吐温-80(批号：20140426，天津市科密欧化学试剂有限公司)；脂多糖(批号：Lot#044M4004V，sigma)；生理盐水，高活性干酵母(产品标准：GB/T20886，安琪酵母股份有限公司)。

2方法

2.1供试品的制备

连翘挥发油的提取按照2015版《中华人民共和国药典》第四部“挥发油测定法”中甲法制备。1kg青翘打成粗粉，加6L水回流提取5h。将所得挥发油有无水硫酸钠脱水。临用前，用质量分数为0.5％的吐温-80溶液(具体为0.5g吐温-80溶解到100g水中)配制成每1ml溶液中含连翘挥发油0.024ml的浓度。

连翘提取物直接购买自成都克洛玛生物科技有限公司，HPLC测定连翘酯苷A含量≥6.0％,连翘苷含量≥0.5％。临用前，用质量分数为0.5％的吐温-80溶液配制成每1ml溶液中含连翘提取物0.5g的浓度。

阿司匹林肠溶片用研钵研成粉末，用生理盐水配制成10mg/mL的混悬液备用。

2.2皮下注射干酵母致大鼠发热模型

分别对大鼠测3次体温，淘汰温差高于0.5℃的大鼠，选出50只大鼠分为5组，每组10只，取2次体温的平均值作为实验前正常体温。除空白组外，其余4组分别于大鼠背部皮下注射20％酵母混悬液(10mL/kg)，于造模后1、2、3、4、5h测体温，当体温升高0.8℃左右(即造模后5h左右)时开始灌胃给药10mL/kg：正常对照组给予生理盐水，模型组给予0.5％吐温-80溶液，阳性对照组给予阿司匹林，给药组分别给予连翘提取物和连翘挥发油。测量6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10h体温，计算体温变化值。

2.3腹腔注射脂多糖(LPS)致大鼠发热模型

分别对大鼠测3次体温，淘汰温差高于0.5℃的大鼠，选出50只大鼠分为5组，每组10只，取2次体温的平均值作为实验前正常体温。除空白组外，其余4组分别于大鼠腹腔注射10mL/kg脂多糖(LPS)溶液(2μg/mL)，于造模前半小时灌胃给药10mL/kg：正常对照组给予生理盐水，模型组给予0.5％吐温-80溶液，阳性对照组给予阿司匹林，给药组分别给予连翘提取物和连翘挥发油。造模后半小时开始测量大鼠肛温，给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5h测量体温，计算体温变化值。

2.4数据分析数据采用SPSS 20.0统计软件分析。各组数据以表示，两两比较用t检验，多组比较用单因素方差分析进行统计。

3结果

3.1连翘提取物和连翘挥发油对干酵母致大鼠发热模型的作用

连翘提取物和连翘挥发油对干酵母致大鼠发热模型的作用见图1和表1所示，造模后大鼠的体温小幅下降之后上升明显，并在造模后5h左右升温超过0.8℃；给药后，与模型组比较，连翘提取物和连翘挥发油分别从第6.5h和6h开始，对大鼠体温升高有显著的抑制趋势(*P<0.05或**P<0.01)，有统计学意义。

3.2连翘提取物和连翘挥发油对脂多糖(LPS)致大鼠发热模型的作用

连翘提取物和连翘挥发油对脂多糖(LPS)致大鼠发热模型的作用见图2和表2所示，注射了LPS后，大鼠的体温上升呈现明显的二相热，并在造模后4h左右达到峰值；与模型组比较，连翘提取物和连翘挥发油对大鼠体温升高有抑制趋势(*P<0.05或**P<0.01)。其中连翘提取物对大鼠体温升高的抑制作用较挥发油起效时间更快。

干酵母和脂多糖(LPS)致热原理都是刺激细胞产生内源性致热源，从而作用于下丘脑体温调节中枢，引起发热介质的释放导致机体发热。连翘提取物和连翘挥发油在试验中，与阳性药物有相同的作用趋势，推测其作用机制可能是抑制了内源性致热源的释放以及COX-2的活性，进而降低PG水平，减弱了对下丘脑体温调节中枢的刺激。

干酵母致大鼠发热模型在5小时后体温迅速升高，并在温度升高达峰之后能稳定的维持6到7小时。脂多糖致热呈现明显的二相热，发热的时间相对酵母模型短。因此，2种发热模型均能用来评价药物的解热效果，但其中干酵母模型热程较长，且发热稳定，可确保能检测药物解热作用的全过程，更适合于研究本发明组合物的协同解热作用机理，因此，选择干酵母模型进行进一步效果验证。

二、本发明组合物的效果验证

1材料与方法

1.1实验动物

110只SD大鼠雄性，200g-240g，由四川省医学科学院实验动物研究所提

供，动物合格证号：SCXK(川)2013-15。实验动物使用许可证号：SYXK(川)2014-124；饲养环境：成都中医药大学科研实验室，(温度23℃±2℃，相对湿度40％±2％)。

1.2药品与试剂

连翘(生产批号：1601123，四川新荷花中药饮片股份有限公司)；连翘提取物(自制：按照药典方法提取，每ml相当于原药材2.67g，HPLC测定连翘酯苷A含量≥6.0％,连翘苷含量≥0.5％)；连翘挥发油(自制：水蒸气蒸馏法，得油率为1.8％，其中α-蒎烯含量为52.57％，β-蒎烯含量为18.07％)；安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司产品)；大鼠环磷酸腺苷(cAMP)试剂盒(批号：20171030，南京建成生物工程研究所)和前列素E2(PGE2)ELISA试剂盒(批号：20171030，南京建成生物工程研究所)；大鼠IL-1β试剂盒(2301B71055，杭州联科生物技术有限公司)、IL-6试剂盒(230670844，杭州联科生物技术有限公司)、TNF-α试剂盒(238270925，杭州联科生物技术有限公司)。

1.3主要仪器

电子天平(德国Sartorius公司)；欧姆龙(OMRON)电子体温计MC-347(欧姆龙大连有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)；Alleregra X30R多功能台式高速冷冻离心机(贝克曼库尔特商贸中国有限公司)。

2方法

2.1供试品的制备

连翘挥发油的提取按照2015版《中华人民共和国药典》第四部“挥发油测定法”中甲法制备。1kg青翘打成粗粉，加6L水回流提取5h。将所得挥发油有无水硫酸钠脱水。临用前，用质量分数为0.5％的吐温-80溶液配制成每1ml溶液中含连翘挥发油0.048ml的浓度。

连翘提取物按照2015版《中华人民共和国药典》中规定的连翘提取物提取方法自行制备。每1mL相当于原药材2.67g，HPLC测定连翘酯苷A含量≥6.0％,连翘苷含量≥0.5％。

挥发油+提取物组：即按照实施例1方法制备的组合物。

阿司匹林肠溶片用研钵研成粉末，用生理盐水配制成10mg/mL的混悬液备用。

2.2干酵母致大鼠发热模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量测定

60只大鼠分为6组，分别为空白组10只、模型组10只、阳性对照组10只、挥发油组10只、提取物组10只、挥发油+提取物组(即实施例1方法制备的组合物)；10只，大鼠适应性测量肛温3天。正式实验前半小时，连续测量三次体温，取平均值作为基础体温。体温大于38.3℃或者相邻两次体温差值大于0.5℃的动物淘汰。

除空白组外，每只大鼠颈部皮下注射20％干酵母液10ml/kg造模，空白组注同体积生理盐水，注射后稍揉散。于造模后0.5h开始，每隔1h测量大鼠肛温。大鼠体温升高超过0.8℃时给药。阳性对照组给予阿司匹林10mg/ml，挥发油组给予挥发油0.48ml/kg(相当于26.7g/kg生药)，提取物组给予连翘提取物26.7g/kg生药，挥发油+提取物组给予大鼠连翘混合物26.7g/kg生药，空白组给予相同体积的生理盐水10ml/kg。给药后每0.5h测量一次大鼠体温。

给药后2h每组大鼠眼眶取血1ml，低温3500r/min离心15min，取上清液用于生化指标IL-1β、IL-6、TNF-α测定。继续测量大鼠肛温致给药后4h。

按照试剂盒说明书，分别测定大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量测定。

2.3干酵母致大鼠发热模型下丘脑含量测定PGE2、cAMP含量测定

50只大鼠分为5组，分别为空白组10只、模型组10只、挥发油组10只、提取物组10只、挥发油+提取物组10只，造模方法和给药剂量参照2.2中所述。

于给药后2h脱颈处死大鼠，迅速取全脑，预冷去离子水(RO)漂洗2次，冰台上取下丘脑并称重，用RO水制成10mg/ml的匀浆液，离心取上清用于PGE2、cAMP含量测定。

按照试剂盒说明书，分别测定大鼠下丘脑PGE2、cAMP含量测定。

2.4数据分析数据采用SPSS 20.0统计软件分析。各组数据以表示，两两比较用t检验，多组比较用单因素方差分析进行统计。

3结果

3.1连翘提取物和连翘挥发油对干酵母致大鼠发热模型的协同解热作用及血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量测定结果

连翘提取物和连翘挥发油对干酵母致大鼠发热模型的协同解热作用见图3、表3和表4所示。

表3大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量测定

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。

从血清指标中可看出，挥发油能降低大鼠血清IL-1β的含量，提取物能降低IL-1β、IL-6含量，提取物和挥发油混合给药后，对IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均能明显降低，说明本发明组合物中，两种原料发挥了协同增效作用，对抑制炎症因子的表达效果良好，清热解毒效果更佳。

由表4可知，给药后，与模型组比较，连翘提取物、连翘挥发油以及混合给药组均对大鼠体温升高有抑制趋势(*P<0.05或**P<0.01)。其中混合给药组对大鼠体温升高的抑制作用显著优于单用提取物组、单用挥发油组，说明本发明组合物中，两种原料发挥了协同增效作用，清热效果更佳。

3.2下丘脑PGE2、cAMP含量测定

大鼠下丘脑中PGE2、cAMP含量测定见表5所示。

表5大鼠下丘脑含量测定PGE2、cAMP含量测定

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。

PGE2、cAMP均为中枢发热介质，研究表明，致热原引起发热时，下丘脑中的PGE2、cAMP含量显著增加，抑制其含量能抑制发热反应。

由表5可知，与模型组比较，提取物组大鼠下丘脑中PGE2、cAMP含量显著降低(*P<0.05)，本发明组合物给药后，PGE2、cAMP含量显著降低(**P<0.01)，说明本发明组合物中，两种原料发挥了协同增效作用，清热效果更佳。

综上，本发明由连翘提取物和连翘挥发油按特定配比制备的组合物，能显著降低大鼠体温、抑制血清及下丘脑炎症因子的表达，效果均显著优于连翘提取物、连翘挥发油单独给药，说明本发明特定配比的组合物发挥了原料的协同增效作用，为临床提供了一种新的有效清热解毒药物，也为进一步通过代谢组学方法研究连翘提取物和挥发油的作用机理提供了理论依据。