本发明属于微生物繁殖过程中添加中药的发酵技术，尤其涉及一种复合菌种发酵的四君子散的制备方法。
背景技术：
：四味君子散是四种中药组成，分别为党参、白术(炒)、茯苓、甘草(炙)组成，各种中药的重量份数是：党参60份、白术(炒)60份、茯苓60份、甘草(炙)30份。组方中党参味甘性平、补中益气、和脾胃，其活性成分皂甙能提高机体免疫力；白术健脾益气，燥湿利水，调节免疫功能，其活性成分是挥发性成分和白术内酯类成分、苷类成分以及多糖类成分；茯苓味甘性平，渗湿利水；健脾和胃；宁心安神，其活性成分茯苓多糖提升免疫力效果极佳；甘草具有清热解毒，调和诸药，其活性成分甘草酸是细胞免疫调节剂。四位中药组成了经典名方，扶脾养胃，补益中气，亦能治疗各种免疫力低下疾病。然而四君子散中的中药组成，富含纤维素，禽类体内无法充分消化纤维素，这样使得很多有效成分难于溶出被动物利用。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，而提供的复合菌种发酵的四君子散的制备方法。本发明的目的是这样实现的：一种复合菌种发酵的四君子散的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1）、取四君子散组方中的党参60份、白术(炒)60份、茯苓60份、甘草(炙)30份；水洗后烘干、然后粉碎成粉末，粉末大小为40-80目；得到中药粉剂，备用；步骤2）、采用复合菌种固态发酵菌种发酵，采用的复合菌种固态发酵菌种分别为：地衣芽孢杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和党参内生菌1号；步骤3）、将地衣芽孢杆菌接种到由5份牛肉膏、10份蛋白胨、5份氯化钠、20份琼脂和1000份水组成的培养基中，在使用恒温摇床在34度环境下培养24小时获得地衣芽孢杆菌原菌液；将党参内生菌1号菌种接种到PDA培养基中使用恒温摇床在34℃环境下培养24小时获得党参内生菌1号原菌液；将干酪乳杆菌接种到由15份葡萄糖、10份蛋白胨、10份牛肉膏、5份酵母膏、5份柠檬酸钠、2份磷酸二氢钾、5份醋酸钠、0.2份硫酸镁、0.2份硫酸锰和1000份水组成的培养基中，使用恒温摇床在34度环境下培养24小时获得干酪乳杆菌原菌液；使用与干酪乳杆菌相同的培养基和培养环境及方法分别获得嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液；然后分别对地衣芽孢杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液、党参内生菌1号原菌液进行提纯；步骤4）、将提纯后的地衣芽孢杆菌原菌液和党参内生菌1号原菌液，从斜面接入三角瓶中，振荡培养24小时；将提纯后的干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液和双歧杆菌原菌液，从斜面接入克氏瓶中，温度控制34℃，培养24小时；步骤5）、将步骤4）中培养后的地衣芽孢杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液、党参内生菌1号原菌液混合均匀，各个原菌液的占比为：地衣芽孢杆菌原菌液15~25%、干酪乳杆菌原菌液15~25%、嗜酸乳杆菌原菌液15~25%、双歧杆菌原菌液15~25%、党参内生菌1号原菌液15~25%，混合均匀后获得菌种原液，备用；步骤6）、培养基的制备；培养基采用红糖、中药粉剂和水制成，红糖1~2%，中药粉剂55~60%，余量为蒸馏水，得到培养基，备用；步骤7）、将步骤6）获得的培养基加热至34℃时接种，将步骤5）得到的菌种原液接种到培养基中，接种量为4％；采用厌氧发酵，温度34℃，发酵时间48~72小时，当PH值达到4.0时完成发酵，发酵完成以后晒干即得所述的复合菌种发酵的四君子散。所述的党参内生菌1号的分离方法如下：取党参切成1cm长小块，依次进入75%酒精内1分钟，1%次氯酸钠溶液15分钟，然后再用75%酒精浸泡1分钟，去除表面菌株之后，再用蒸馏水冲洗5遍；插入含有双抗WA培养基中，放在恒温培养箱中28度培养；观察到有0.5cm的菌丝从党参切口处长出后，将菌丝转接到PDA培养基中培养；内生菌菌种纯化采用平板分离法；分离后培养细菌，然后将细菌产物按照党参药典标准检测法进行测量，最后找到一株真菌，可以产生高效生物活性党参生物皂苷似成分，即为所述的党参内生菌1号。所述的双抗WA培养基的制备方法为：取琼脂15份，加水定容到1000份，加入效价为200,150IU/ml的青霉素和链霉素，既得所述的双抗WA培养基。所述的PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200份，切成块煮沸30分钟，用纱布过滤，再加入20份葡萄糖和15份琼脂，溶化后补足水至1000份，既得所述的PDA培养基。本发明将现代生物工程技术与传统的中药制剂方法相结合，使中药生产现代化，弥补传统制法的不足。将生物菌发酵技术应用到中药中，分解四君子散组方中中药的纤维素让有效成分易于溶出，同时药物有效成分变成小分子更易被吸收，更易到达靶器官发挥作用。从而提高了四君子散的药效和生物利用度。不仅如此，使用复合菌种来发酵四君子散，发酵后的四君子散不仅含有中药有效作用的生理活性成分，而且还富含有菌种和基质在发酵制备过程中产生的多种维生素、丰富的氨基酸及多种易于吸收的微量元素。这些营养成分组分合理，极易被机体吸收和利用。同时微生物在繁殖过程中加入了中药粉剂，对微生物进行了定向筛选，让微生物及其副产物表达出一部分中药的特性。所以采用本制备方法发酵后的四君子散制剂，表现出了微生物和中药的叠加效果，更适应市场需要。党参内生菌1号增加中药组方中的党参活性成分的产生和积累。使用复合菌种发酵后的四君子散，是一种完全取代抗生素的无药残、防病促生长的中药微生态制剂，由于四君子散和复合菌对免疫系统的协同作用，因此使用复合菌种发酵后的四君子散生产的兽药其免疫能力远远超过其它类产品及普通的四君子散。具体实施方式实施例1：一种复合菌种发酵的四君子散的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1）、取四君子散组方中的党参60份、白术(炒)60份、茯苓60份、甘草(炙)30份；水洗后烘干、然后粉碎成粉末，粉末大小为40-80目；得到中药粉剂，备用；步骤2）、采用复合菌种固态发酵菌种发酵，采用的复合菌种固态发酵菌种分别为：地衣芽孢杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌、党参内生菌1号；步骤3）、将地衣芽孢杆菌接种到由5克牛肉膏、10克蛋白胨、5克氯化钠、20克琼脂和1000毫升水组成的培养基中，接种量为1%，在使用恒温摇床在34度环境下培养24小时获得地衣芽孢杆菌原菌液；将党参内生菌1号菌种接种到PDA培养基中使用恒温摇床在34℃环境下培养24小时获得党参内生菌1号原菌液；将干酪乳杆菌接种到由15克葡萄糖、10克蛋白胨、10克牛肉膏、5克酵母膏、5克柠檬酸钠、2克磷酸二氢钾、5克醋酸钠、0.2克硫酸镁、0.2克硫酸锰和1000毫升水组成的培养基中，接种量为1%，使用恒温摇床在34度环境下培养24小时获得干酪乳杆菌原菌液；使用与干酪乳杆菌相同的培养基和培养环境及方法分别获得嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液；然后分别对地衣芽孢杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液、党参内生菌1号原菌液进行提纯；步骤4）、将提纯后的地衣芽孢杆菌原菌液和党参内生菌1号原菌液，从斜面接入三角瓶中，振荡培养24小时；将提纯后的干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液和双歧杆菌原菌液，从斜面接入克氏瓶中，温度控制34℃，培养24小时；步骤5）、将步骤4）中培养后的地衣芽孢杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液、党参内生菌1号原菌液混合均匀，各个原菌液的占比为：地衣芽孢杆菌原菌液20%、干酪乳杆菌原菌液20%、嗜酸乳杆菌原菌液20%、双歧杆菌原菌液20%、党参内生菌1号原菌液20%，混合均匀后获得菌种原液，备用；步骤6）、培养基的制备；培养基采用红糖、中药粉剂和水制成，红糖2%，中药粉剂60%，余量为蒸馏水，得到培养基，备用；步骤7）、将步骤6）获得的培养基加热至34℃时接种，将步骤5）得到的菌种原液接种到培养基中，接种量为4％；采用厌氧发酵，温度34℃，发酵时间72小时，当PH值达到4.0时完成发酵，发酵完成以后晒干即得所述的复合菌种发酵的四君子散。所述的党参内生菌1号的分离方法如下：取党参切成1cm长小块，依次进入75%酒精内1分钟，1%次氯酸钠溶液15分钟，然后再用75%酒精浸泡1分钟，去除表面菌株之后，再用蒸馏水冲洗5遍；插入含有双抗WA培养基中，放在恒温培养箱中28度培养；观察到有0.5cm的菌丝从党参切口处长出后，将菌丝转接到PDA培养基中培养；内生菌菌种纯化采用平板分离法；分离后培养细菌，然后将细菌产物按照党参药典标准检测法进行测量，最后找到一株真菌，可以产生高效生物活性党参生物皂苷似成分，即为所述的党参内生菌1号。所述的双抗WA培养基的制备方法为：取琼脂15克，加水定容到1000毫升，加入效价为200,150IU/ml的青霉素和链霉素，既得所述的双抗WA培养基。所述的PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200克，切成块煮沸30分钟，用纱布过滤，再加入20克葡萄糖和15克琼脂，溶化后补足水至1000毫升，既得所述的PDA培养基。本发明，所述的各种菌的原菌种，均从农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）引进，或者本公司实验室自己分离。确保了各菌种的存活和质量。对比实验：实验材料试验动物：1日龄白羽肉鸡360只，由河南大用集团提供。主要试剂和仪器禽流感抗原：乾元浩生物股份有限公司生产；法氏囊抗体酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，美国IDEXX公司生产；鸡传染性法氏囊病耐热保护剂活疫苗(B87株，批号为(2015)040132094)，山西隆克尔生物制药有限公司生产；禽流感(H9亚型)灭活疫苗(SS株，批号为015178)，肇庆大华农生物药品有限公司生产；新城疫Ⅳ系疫苗，市购；酶标仪，美国Biotek公司生产。实验方法试验动物分组与处理，取1日龄白羽肉鸡360只，饲养至10日龄，随机分成4组，每组90只。Ⅰ组为复合菌种发酵的四君子散0.2%低剂量组；Ⅱ组为复合菌种发酵的四君子散0.4%中剂量组；Ⅲ组为复合菌种发酵的四君子散0.6%高剂量组；Ⅳ组为对照组，饲料中添加0.6%四君子散（没有发酵）。以上各组从10日龄开始在饲料中混饲药物，每天早晚各1次，连喂7d。在7日龄免疫新城疫Ⅳ系疫苗和禽流感(H9亚型)灭活疫苗，13日龄免疫鸡传染性法氏囊病耐热保护剂活疫苗，18日龄免疫新城疫Ⅳ系疫苗。免疫程序如表1所示。表1免疫程序日龄疫苗名称免疫方式剂量7新城疫Ⅳ系疫苗滴鼻点眼1倍量7禽流感灭活疫苗肌内注射1倍量13鸡传染性法氏囊病饮水1倍量18新城疫Ⅳ系疫苗饮水1倍量1、法氏囊抗体效价和抗体阳性率的测定在第10，17，24，31，38日龄，每组随机抽取20只白羽肉鸡，翼下静脉采血1mL，分离血清，-20℃保存，按照法氏囊抗体酶联免疫分析试剂盒说明测定抗体效价。抗体效价大于396时，判为阳性，统计各日龄抗体阳性率。2、禽流感抗体的测定用微量血凝抑制(HI)法测定禽流感HI抗体，每组随机抽取20只白羽肉鸡，分别于10，17，24，31，38日龄采血，分离血清，按常规方法用96孔V形血凝板进行HI试验，H9血清抗体的HI效价用lb表示。结果和分析统计学分析利用SPSS17.0统计软件对试验数据进行处理，以单变量方差分析进行统计学分析，试验数据以平均数±标准差表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。复合菌种发酵的四君子散对传染性法氏囊病抗体效价的影响，结果如表2所示。表2复合菌种发酵的四君子散对传染性法氏囊病抗体效价的影响组别10日龄17日龄24日龄31日龄38日龄Ⅰ组1589.8±166.41001.5±178.0888±52.8501.25±30.651002.8±125.34Ⅱ组1678.3±185.0966±142.2922.4±93.0471.38±56.751101.8±105.36Ⅲ组1710.6±195.3942.6±102.5834.8±48.7669.78±48.431162.7±108.28Ⅳ组1671.2±171.3823.4±145.3778.3±85.8398.35±23.82713.75±73.58肉鸡血清中传染性法氏囊病中和抗体效价在10日龄时，各组差异不显著(P＞0.05)；17日龄时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与Ⅳ组比较差异显著(P＜0.05)，试验组间没有差异；31，38日龄时，复合菌种发酵的四君子散中剂量组和高剂量组与Ⅳ组比较差异极显著(P＜0.01)。说明试验组能有效提高肉鸡血清中传染性法氏囊病抗体效果。复合菌种发酵的四君子散对传染性法氏囊病抗体阳性率的影响，结果如表3所示。表3复合菌种发酵的四君子散对传染性法氏囊病抗体阳性率的影响（%）组别10日龄17日龄24日龄31日龄38日龄Ⅰ组10084596590Ⅱ组10086658694Ⅲ组100100788999Ⅳ组10077566985在17，24，31，38日龄时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肉鸡血清中抗体阳性率均高于Ⅳ组，3个试验组间比较，Ⅲ组(复合菌种发酵的四君子散高剂量组)抗体阳性率最高。阳性率统计数据说明，复合菌种发酵的四君子散可以提高疫苗免疫后血清中传染性法氏囊病抗体的上升速度和整体抗体水平，远远优于四君子散（未发酵）组。复合菌种发酵的四君子散对H9亚型禽流感抗体效价的影响，结果如表4所示。表4复合菌种发酵的四君子散对H9亚型禽流感抗体效价的影响组别10日龄17日龄24日龄31日龄38日龄Ⅰ组7.4±0.85.2±0.64.6±0.94.9±0.85.4±0.4Ⅱ组7.1±0.75.7±0.84.5±0.84.8±0.95.5±0.5Ⅲ组7.7±0.55.9±0.65.4±0.65.8±0.65.9±0.7Ⅳ组7.7±0.75.2±0.94.6±0.53.9±0.94.6±0.6由表4可知：在10日龄时，各组抗体效价差异不显著(P＞0.05)；在17日龄时，Ⅲ组(复合菌种发酵的四君子散高剂量组)抗体效价与其他3组比较差异显著(P＜0.05)；在31，38日龄时，Ⅲ组与Ⅳ组比较差异极显著(P＜0.01)。说明复合菌种发酵的四君子散有提高H9亚型禽流感中和抗体效价的作用。抗体水平是代表体液免疫的一个重要指标，而且在抵御病毒入侵及病毒清除灭活等方面发挥着首要作用。传染性法氏囊病和H9亚型禽流感抗体在禽抵抗病毒侵染、中和体内易感染病毒的过程中起着重要作用。本实验运用现代科技，经过益生菌发酵后，使四君子散药效大幅提升，可以更好的服务于畜牧业。实施例2：一种复合菌种发酵的四君子散的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1）、取四君子散组方中的党参60份、白术60份、茯苓60份、甘草30份；水洗后烘干、然后粉碎成粉末，粉末大小为40-80目；得到中药粉剂，备用；步骤2）、采用复合菌种固态发酵菌种发酵，采用的复合菌种固态发酵菌种分别为：地衣芽孢杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和党参内生菌1号；步骤3）、将地衣芽孢杆菌接种到由5份牛肉膏、10份蛋白胨、5份氯化钠、20份琼脂和1000份水组成的培养基中，在使用恒温摇床在34度环境下培养24小时获得地衣芽孢杆菌原菌液；将党参内生菌1号菌种接种到PDA培养基中使用恒温摇床在34℃环境下培养24小时获得党参内生菌1号原菌液；将干酪乳杆菌接种到由15份葡萄糖、10份蛋白胨、10份牛肉膏、5份酵母膏、5份柠檬酸钠、2份磷酸二氢钾、5份醋酸钠、0.2份硫酸镁、0.2份硫酸锰和1000份水组成的培养基中，使用恒温摇床在34度环境下培养24小时获得干酪乳杆菌原菌液；使用与干酪乳杆菌相同的培养基和培养环境及方法分别获得嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液；然后分别对地衣芽孢杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液、党参内生菌1号原菌液进行提纯；步骤4）、将提纯后的地衣芽孢杆菌原菌液和党参内生菌1号原菌液，从斜面接入三角瓶中，振荡培养24小时；将提纯后的干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液和双歧杆菌原菌液，从斜面接入克氏瓶中，温度控制34℃，培养24小时；步骤5）、将步骤4）中培养后的地衣芽孢杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、双歧杆菌原菌液、党参内生菌1号原菌液混合均匀，各个原菌液的占比为：地衣芽孢杆菌原菌液15~24%、干酪乳杆菌原菌液15~24%、嗜酸乳杆菌原菌液15~24%、双歧杆菌原菌液15~24%、党参内生菌1号原菌液15~24%，混合均匀后获得菌种原液，备用；步骤6）、培养基的制备；培养基采用红糖、中药粉剂和水制成，红糖1~2%，中药粉剂55~60%，余量为蒸馏水，得到培养基，备用；步骤7）、将步骤6）获得的培养基加热至34℃时接种，将步骤5）得到的菌种原液接种到培养基中，接种量为4％；采用厌氧发酵，温度34℃，发酵时间48~72小时，当PH值达到4.0时完成发酵，发酵完成以后晒干即得所述的复合菌种发酵的四君子散。所述的党参内生菌1号的分离方法如下：取党参切成1cm长小块，依次进入75%酒精内1分钟，1%次氯酸钠溶液15分钟，然后再用75%酒精浸泡1分钟，去除表面菌株之后，再用蒸馏水冲洗5遍；插入含有双抗WA培养基中，放在恒温培养箱中28度培养；观察到有0.5cm的菌丝从党参切口处长出后，将菌丝转接到PDA培养基中培养；内生菌菌种纯化采用平板分离法；分离后培养细菌，然后将细菌产物按照党参药典标准检测法进行测量，最后找到一株真菌，可以产生高效生物活性党参生物皂苷似成分，即为所述的党参内生菌1号。所述的双抗WA培养基的制备方法为：取琼脂15份，加水定容到1000份，加入效价为200,150IU/ml的青霉素和链霉素，既得所述的双抗WA培养基。所述的PDA培养基的制备方法为：取马铃薯200份，切成块煮沸30分钟，用纱布过滤，再加入20份葡萄糖和15份琼脂，溶化后补足水至1000份，既得所述的PDA培养基。当前第1页1 2 3