杭白菊提取物在制备防治心肌肥厚的药物中的应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及杭白菊提取物的新用途，具体涉及杭白菊提取物在制备防治心肌肥厚的药物中的应用。

(二)

背景技术：

杭白菊(chrysanthemummorifoliumramat，cm)是我国菊花的一个重要品种，被归类为浙江省八大名药材“浙八味”之一。杭白菊主要产地是浙江省桐乡市，也是国家卫生部第一批批准的药食同源的道地药材之一，杭白菊是2010年版《中国药典》收载的正品菊花，挥发油、甾体、三萜、酚类、多糖及微量元素为cm的主要成分。

国内外学者已对菊花的药理作用进行了大量的研究，证实菊花具有抗菌、抗病毒、降低血压、预防高血脂、抗衰老等多种药理活性，部分药理活性与它的抗氧化和清除自由基有关，其中黄酮类是菊花提取物中含量较多的有效成分，具有良好的清除自由基、抗氧化的功能(邝春林，吕都，黄霞，高玮，申光辉，张志清.杭白菊不同溶剂提取物的抗氧化活性研究.食品工业科技,2015,21:83-87)。在心血管疾病领域，有研究者发现，杭白菊水提物对缺血损伤心肌有明显保护作用，可能通过抑制炎症因子的产生、聚集和释放起到对缺血心肌的保护作用(黄浩，郭环宇，金红峰.杭白菊水提取物对犬急性心肌梗死后缺血心肌的保护作用.浙江中西医结合杂志2011,21(5):307-310)。杭白菊提取物(chrysanthemumextract，ce)对缺血性损伤心肌有明显保护作用，包括降低心肌梗死面积、减轻心肌缺血损伤范围与程度、减少心肌损伤标志性酶的释放、降低缺血性心律失常严重程度，减轻脂质过氧化，增加抗氧化能力(周新妹，杨军，夏强.ce抗缺血心肌损伤的作用研究.浙江大学硕士学位论文.2006.5)。而肾素血管紧张素醛固酮系统活化、氧化应激、心肌细胞凋亡、细胞因子触发炎症反应、nf-κb过度表达等可能与心肌肥厚的发展和转归密切相关。据此，我们推测ce可能有抗心肌肥厚的作用。但将ce应用于治疗以心肌肥厚为基础的相关疾病国内外未见研究报道。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供杭白菊提取物(ce)在制备防治心肌肥厚或以心肌肥厚为基础的相关疾病的药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了杭白菊提取物在制备防治心肌肥厚或以心肌肥厚为基础的疾病的药物中的应用。

所述以心肌肥厚为基础的疾病例如：高血压、风湿性心脏病、肺心病、糖尿病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、冠心病、心肌梗塞或贫血等。

所述杭白菊提取物由原料杭白菊经干燥、80％(体积分数，下同)乙醇水溶液提取得到。具体的，所述杭白菊提取物按如下方法制得：

将新鲜杭白菊置于鼓风干燥箱中，45℃干燥至恒重，粉碎，过100目筛，得到杭白菊粉末，将所得杭白菊粉末按料液比1：15(w/v，g/ml)加入80％乙醇水溶液中，超声提取30min，过滤收集滤液，滤渣重复提取2次，合并每次所得滤液，减压浓缩，真空冻干得到所述杭白菊提取物；紫外吸收法(uv法)测定总黄酮含量为33％±3％。

所述杭白菊提取物也可在市面上商购获得，具体例如：购自浙江圣氏生物科技有限公司的杭白菊提取物，为淡黄色粉末，气味清香，生料比10：1，总黄酮质量分数36％。

推荐所述杭白菊提取物的常规用量为120～480mg/kg/d，优选150～300mg/kg/d，更加优选120～200mg/kg/d，最优选150mg/kg/d。用药途径可以为口服或注射给药。

所述杭白菊提取物可制成如下形式的药物制剂：杭白菊提取物片、杭白菊提取物缓释片或杭白菊提取物胶囊等，并且，所述药物制剂以杭白菊提取物计为120～240mg/单位计量。

例如：杭白菊提取物片以杭白菊提取物计为120～240mg/片；所述杭白菊提取物缓释片以杭白菊提取物计为120～240mg/片；所述杭白菊提取物胶囊以杭白菊提取物计为120～240mg/胶囊。

所述杭白菊提取物还可以制成杭白菊提取物可药用盐的形式(例如盐酸杭白菊提取物)，或者与人体可接受的药用辅料组成药物组合物的形式，因此，本发明还包括所述杭白菊提取物可药用盐或所述药物组合物在制备防治心肌肥厚或以心肌肥厚为基础的疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明利用β受体激动剂异丙肾上腺素刺激诱导小鼠心肌，复制小鼠心肌肥厚模型；利用腹主动脉缩窄诱导大鼠心肌肥厚，复制大鼠心肌肥厚模型，应用不同剂量的中药杭白菊提取物，经药效学整体动物实验研究，取得了肯定的治疗效果，为新药筛选提供了基础。

(四)附图说明

图1为实施例1中各组小鼠心肌组织sod活性、mda含量及血清ldh活性的变化n＝10，与对照组比较，^*p<0.01；与iso模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图2为实施例1各组小鼠心肌组织学改变(he染色，×200,n＝10)

a：对照组；b：iso模型组；c：iso+ce120mg/kg/d治疗组；d：iso+ce480mg/kg/d治疗组。

图3-i为实施例1各组小鼠心肌细胞病理切片(masson染色，×200)；(n＝10)

a：对照组；b：iso模型组；c：iso+ce120mg/kg/d治疗组；d：iso+ce480mg/kg/d治疗组。

图3-ii为实施例1各组小鼠心肌间质纤维化定量分析；

n＝10，与对照组比较，^*p<0.01；与iso模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图4为实施例1各组小鼠心肌细胞erk1蛋白表达变化(erk1，×200)；

a：对照组；b：iso模型组；c：iso+ce120mg/kg/d治疗组；d：iso+ce480mg/kg/d治疗组。

图5为实施例1各组小鼠心肌细胞erk2蛋白表达变化(erk2，×200)；

a：对照组；b：iso模型组；c：iso+ce120mg/kg/d治疗组；d：iso+ce480mg/kg/d治疗组。

图6为实施例1各组小鼠心肌细胞erk1/2蛋白表达定量变化；

n＝10，与对照组比较，^*p<0.01；与iso模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01。

图7为实施例2各组大鼠心肌组织学改变(he染色，×200)；

a：对照组；b：aac模型组；c：aac+ce120mg/kg/d治疗组；d：aac+ce480mg/kg/d治疗组；e：aac+缬沙坦10mg/kg/d治疗组(n＝8)。

图8为实施例2各组腹主动脉缩窄高血压大鼠心肌组织anp，β-mhc表达的变化；

a：对照组；b：aac模型组；c：aac+ce120mg/kg/d治疗组；d：aac+ce480mg/kg/d治疗组；e：aac+缬沙坦10mg/kg/d治疗组(n＝8)。

(五)具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：杭白菊提取物抑制异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚作用及其机理初步研究

1材料与方法

1.1实验动物：

清洁级昆明种小鼠，雌雄兼有，体重(20±2)g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：scxk(浙)2015-0002，在浙江省实验动物中心屏障环境动物实验室喂养和实验。

1.2药品与试剂：

杭白菊提取物(ce)，浙江圣氏生物科技有限公司，淡黄色粉末，气味清香，生料比10:1，总黄酮质量分数36％；盐酸异丙肾上腺素(isoprenaline，iso)注射液(上海禾木制药有限公司，批号160408)；乳酸脱氢酶(ldh)、丙二醛(mda)及总超氧化歧化酶(t-sod)测试盒、蛋白定量测试盒均购自南京建成生物工程有限公司；兔抗erk1/2抗体购于美国santacruz有限公司；辣根过氧化物酶，山羊抗小鼠抗体igg购于美国cellsignaling有限公司。

1.3主要仪器：

-70℃低温冰箱(美国forma公司产品)；紫外成像扫描仪(美国bio-rad公司产品)；美国foeodyne公司产影像分析仪；美国millipore公司产超纯水系统；低温离心机及低温冰箱(德国heraeus产品)；pcy仪9600(美国perkinelmer公司)；酶标仪(美国bio-rad550)；稳压稳流定时电泳仪(上海精密仪器厂)；722n可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；mp200a型电子天平(上海第二天平仪器厂)；kdc-2046低温离心机(中科大创新股份有限公司中佳分公司)；qwin图象分析软件(德国leica有限公司)。

1.4动物分组及造模：

取健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为：空白(对照)组、模型组、模型+ce低剂量治疗组、模型+ce高剂量治疗组4组，每组15只。除空白组外，其他各组小鼠均皮下注射iso，每天一次，第一天剂量为40mg/kg，第二天为20mg/kg，第三天为10mg/kg，第四天开始保持10mg/kg，连续14天。自由进食，给水，建立心肌肥厚模型，空白组每天皮下注射等量的生理盐水作为对照。

1.5给药：

给药和造模同时进行，每日上午注射iso4h后，分别给予低、高剂量ce120mg/kg和480mg/kg灌胃治疗，每天一次。空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每天一次，连续4周。1.6心脏重量指数测定：

小鼠末次给药后禁食不禁水12h，称小鼠体重(bodyweight,bw)，眼球取血处死，迅速打开胸腔取出心脏，用预冷的生理盐水洗尽残血，滤纸吸干后称量全心重(heartweight,hw)，再分离出左心室，称左心室重量(lvw)，分别计算心重指数(hw/bw)和左心室重量指数(lvwi＝lvw/bw)。另取心肌组织制作组织病理切片，沿房室环剪去大血管、心房以及右心室游离壁，将余下的室间隔、左心室游离壁置于10％福尔马林溶液中固定24h。取出固定液中的左心室标本，经流水冲洗，梯度乙醇脱水，透明，常规石蜡包埋，沿左心室长轴线每隔1mm横断面连续切取5μm厚切片，进行he及masson染色光学显微镜下观察，拍照。观察心肌肥厚、纤维化程度，用qwin图象分析软件分析心肌纤维化程度，分析比较各组心肌组织病理学变化。

1.7血清ldh活性、心肌组织sod活性和mda含量测定：

小鼠眼球取血后于4℃，2000r/min，离心10分钟，分离血清，严格按照ldh试剂盒说明操作，测定ldh活性。取小鼠心肌组织，手工制备组织匀浆，于4℃，2000r/min，离心10分钟，取上清液进行测定，sod活性和mda含量，严格按照试剂盒说明操作。

1.8免疫组化检测小鼠心肌细胞erk1/2蛋白表达

免疫组化染色，erk1/2蛋白表达采用sp法，其主要步骤：石蜡切片脱蜡水化，3％双氧水浸泡20min，羊血清孵育10min，依次加erk1/2抗体一抗室温下60min，山羊抗小鼠igg二抗室温30min，链亲和素-过氧化物酶溶液室温10min，dab显色，苏木素复染，脱水封片，显微镜下观察。用qwin图象分析软件，对组织切片免疫组化染色胞浆中阳性表达进行定量分析，计算镜下光密度值。

1.9统计学分析：

所有数据用spss17.0统计软件进行分析。结果以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用t检验，以p＜0.05被认为有统计学意义。

2结果

2.1ce对iso所致小鼠心脏质量参数的影响：

与空白组比较，连续皮下注射iso后，模型组小鼠的全心和左心室重量指数有明显增加(p＜0.01)，符合《药理实验方法学》第二版中的心肌肥厚模型标准，说明心肌肥厚模型制备成功。用ce120、480mg/kg治疗后，hwi和lvwi都较模型组有所减小，差异有统计学意义(p＜0.05)，而480mg/kgce组变化更为明显。sin对小鼠心肌肥厚有一定的保护作用。结果见表1。

表1各组小鼠全心和左心室重量指数比较(mg/g，)

与空白组比较，^*p＜0.01；与模型组比较，^#p＜0.05，^##p＜0.01

2.2ce对iso所致小鼠心肌肥厚组织中氧化损伤指标的影响：

连续皮下注射iso后，模型组小鼠血清ldh、心肌组织中mda含量明显升高，sod活性明显降低，与空白组比较有显著差异性(p＜0.01)；用ce120、480mg/kg治疗后，各治疗组的ldh、mda值对比模型组明显下降，sod明显上升，具有显著差异性(p＜0.05)；480mg/kgce组效果更加明显，表明ce对小鼠心肌肥厚损伤有一定的对抗作用，结果见图1。

2.3心肌组织病理切片观察

各组小鼠心肌组织光镜下切片显示，正常对照组心肌细胞红色，排列整齐、致密，胞质着色均匀，间质细胞无增生。iso模型组细胞呈心肌肥厚改变，心肌细胞体积增大，呈圆形或类圆形，细胞核体积增大染色加深，血管和心肌细胞之间可见蓝色纤维化增多和炎性细胞浸润。高剂量杭白菊提取物，治疗后，心肌损害的情况较模型组减轻，细胞排列较整齐，增粗不明显，炎性细胞浸润减轻，胞质着色明显，间质纤维化明显减轻。见图2，图3-i，图3-ii。

2.4各组小鼠心肌细胞erk1/2蛋白表达变化

图4，图5，图6显示，与空白对照组比较，模型组心肌组织中总erk1/2蛋白相对表达量明显增加，与空白对照组比较差异显著(均p<0.05)。ce治疗后，心肌组织中总erk1/2的蛋白表达明显降低，与模型组比较差异显著(均p<0.05)。

结论：

1、iso诱导的心肌肥厚模型组小鼠心肌细胞体积增大，呈圆形或类圆形，细胞核体积增大染色加深，血管和心肌细胞之间可见蓝色纤维化增多和炎性细胞浸润；模型组中血清ldh水平、心肌mda含量升高及心肌sod活性下降，同时erk1/2蛋白的表达升高，与对照组相比差异显著；

2、应用ce疗，可明显改善iso诱导的小鼠心肌肥厚的纤维化改变，降低iso诱导的小鼠心肌肥厚模型血清ldh水平、心肌mda含量、升高心肌sod活性，抑制其erk1/2蛋白的表达，显示良好的心肌保护作用，其中大剂量ce的作用较强；

3、ce对iso诱导的小鼠心肌肥厚有保护作用，其发生机制可能与抑制erk1/2蛋白的表达、降低血清ldh水平、心肌mda含量、升高心肌sod活性的水平有关，ce能清除氧自由基和抗脂质过氧化作用，提高机体的抗氧化能力。

实施例2：杭白菊提取物对腹主动脉缩窄诱导的大鼠心肌肥厚的保护作用及其机理研究。

l材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂及仪器

杭白菊提取物(ce)，浙江圣氏生物科技有限公司，淡黄色粉末，气味清香，生料比10:1,总黄酮质量分数36％；缬沙坦，华润赛科药业有限责任公司，批号：20161008；胞浆内钙离子浓度荧光检测试剂盒(fura-3/am)，上海宝曼生物科技有限公司；山羊抗鼠的心房利钠肽(atrialnatriureticpeptide,anp)和β-肌球蛋白重链(β-myosinheavychain,β-mhc)多克隆抗体、辣根酶标记兔抗羊igg，武汉博士德生物技术有限公司；大鼠血压计，上海玉研科学仪器有限公司；荧光显微镜，ptll048，日本；紫外分光光度计，ultmspec-2000型，pharmacia；电泳数据处理与分析系统，kodak公司；hpsonos5500彩色超声诊断仪，美国惠普公司。

1.1.2实验动物

健康sd大鼠50只，雌雄兼有，体重(243±21)g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：scxk(浙)2015-0002，在浙江省实验动物中心屏障环境动物实验室喂养和实验。

1.2实验方法

1.2.1心肌肥厚模型制备及实验分组

50只大鼠行腹主动脉缩窄术(abdominalaortacoarctation，aac)，术前禁食12h，自由饮水。用3％戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位四肢固定。无菌条件下于左肋缘下0.5cm、腹正中线旁0.5cm处，纵切口2.5cm，逐层分离组织，进入腹腔。钝性分离腹主动脉鞘，剥离腹主动脉。在左右肾动脉分支下方穿1.0号手术缝线，沿血管走行方向放置7号针头与腹主动脉一起结扎(其中10只仅穿线不结扎作为假手术对照组)，随后抽出针头。腹腔内滴入青霉素(40万u/ml)适量，然后关腹。关笼饲养，正常饮食。腹主动脉缩窄手术大鼠存活35只，假手术对照组大鼠存活8只；死因主要与术中损伤下腔静脉导致出血及麻醉有关。术后4周测定腹主动脉缩窄手术大鼠尾动脉血压，32只大鼠血压(systolicbloodpressure,sbp)≥140mmhg，作为成功复制高血压模型，并随机将32只分为：心肌肥厚组(生理盐水lml/d，ig)、ce组(120mg/kg/d/，ig)、ce组(480mg/kg/d，ig)和缬沙坦组(10mg/kg/d，ig)，每组8只。假手术对照组大鼠8只(生理盐水1ml/d，ip)。

1.2.2动物模型的处理

药物治疗8周后，再次测量体重、尾动脉压；心脏彩超测量舒张末期左心室后壁和室间隔厚度；然后处死大鼠，称左心室湿质量(含室间隔)，检测左心室质量指数(lvmi)。左心室组织一部分置人10％甲醛缓冲液中固定12～24h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋后行切片处理，光学显微镜10×40倍下测量大鼠心肌纤维直径(mfd)，分析心肌组织的病理形态学改变并照相。

1.3心肌细胞内游离钙离子([ca²⁺]i)浓度的测定

参照相关文献(例如：柯俊,陈锋,肖幸,戴木森,王晓萍,陈兵,陈敏,张存泰.钙调蛋白激酶ⅱ抑制剂对肥厚心肌细胞的影响.中华急诊医学杂志,2012,doi：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.02.011)方法分离左室心肌细胞，将负载fura-3的心肌细胞置于荧光显微镜下(ptll048，日本)，钙荧光的激发波长为340/380nm，发射波长为510nm。荧光信号经felix专用软件处理。

1.4westernblot检测anp、β-mhc的蛋白表达

取大鼠心肌组织，用trizol试剂提取组织蛋白质，并用bradford方法测定蛋白质的含量。将提取的等量蛋白质加入3×加样缓冲液，煮沸3min后上样，在制备好的sds聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，然后将蛋白质转印到硝酸纤维素滤膜上，按照标准的westernblot方法分别与anp、β-mhc抗体共同孵育2h，然后洗脱，封闭漂洗后加入稀释的二抗。室温下杂交1h，化学发光剂温浴1min后曝光、显影和定影，最后对结果进行吸光度扫描分析。

1.5统计学方法

所有数据用均数±标准差来表示，采用spssl7.0统计软件进行分析。多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用t检验，以p＜0.05认为有统计学意义。

2结果

2.1对大鼠sbp的影响

与心肌肥厚组比较，120mg/kgce组sbp没有显著降低[(25.05±1.70)kpavs(24.74±1.68)kpa，p>0.05]，但是480mg/kgce组，缬沙坦组sbp降低明显[(18.38±1.36)kpa，(19.07±1.52)kpavs(24.49±1.64)kpa，p<0.01]，说明大剂量ce具有降低sbp的作用，大剂量480mg/kgce作用与缬沙坦组相似。

2.2对室间隔、左室后壁厚度、心肌纤维直径(mfd)、左心室质量指数(lvmi)的影响

ce组和缬沙坦组的室间隔、左室后壁厚度高于对照组(p<0.05)，但低于心肌肥厚组(p<0.01)；ce组的室间隔厚度高于缬沙坦组(p<0.05)，见表2。

ce组和缬沙坦组的mfd均显著低于心肌肥厚组(p<0.01)，高于对照组(p<0.05)。提示ce和缬沙坦有抑制左室肥厚的作用。而ce组mfd又高于缬沙坦组(p<0.05)，说明ce组的作用不如缬沙坦组明显，见表2。

ce组的lvmi明显低于心肌肥厚组(p<0.05)，提示ce有抑制左心室肥厚的作用。但与缬沙坦组比较，ce组的lvmi相对较高，显示其作用弱于缬沙坦，见表2。

表2大鼠各实验组室间隔、左室后壁厚度和心肌组织病理学的变化(n＝8；)

与对照组比较：^*p<0.05，^**p<0.01；与心肌肥厚组比较：^#p<0.05。

2.3心肌组织形态学改变

he染色显示，对照组心肌细胞直径无明显增大，心肌细胞排列规整；心肌肥厚组可见心肌细胞直径明显增大，体积肥大，心肌细胞排列紊乱。ce组和缬沙坦组心肌细胞较心肌肥厚组心肌细胞病理组织学改变减轻，见图7。

2.4心肌细胞[ca²⁺]i的变化

心肌肥厚组细胞内[[ca²⁺]i[(161.52±11.54)nmol/l]明显高于对照组、120mg/kgce组、480mg/kgce组和缬沙坦组[(108.32±9.76，135.28±13.79，119.16±9.83，126.14±9.62)nmol/l，p<0.01]；ce组与对照组之间差异有统计学意义(p<0.05)；缬沙坦组仍高于480mg/kgce组与对照组(p<0.05)。可见，480mg/kgce降低心肌细胞[ca²⁺]i浓度的作用强于缬沙坦(p<0.05)。

2.5杭白菊提取物对腹主动脉缩窄高血压大鼠心肌组织anp、β-mhc的影响

anp、β-mhc的免疫印迹结果显示(见表3，图8)：与对照组相比，心肌肥厚组的anp、β-mhc蛋白表达明显增高(p<0.01)，提示在心肌肥厚时anp、β-mhc参与了心肌肥厚的病理过程，anp、β-mhc在心肌肥厚的发病机制中扮演着一定的角色。ce组和缬沙坦组的anp、β-mhc表达均显著低于心肌肥厚组(p<0.01)，ce对anp、β-mhc蛋白表达的下调作用弱于缬沙坦。因此，ce有可能是通过作用anp、β-mhc减缓和阻止心肌的肥厚。

表3各组腹主动脉缩窄高血压大鼠心肌组织anp，β-mhc表达的变化(n＝8；)

与对照组比较：^*p<0.05，^**p<0.01；与心肌肥厚组比较：^#p<0.05。

结论：

1、大剂量ce具有降低sbp的作用；

2、aac诱导大鼠心肌肥厚，心肌细胞直径明显增大，细胞排列紊乱；ce和缬沙坦治疗后，可以缓解心肌病理组织学改变，ce对aac术后心肌肥厚大鼠有心肌保护作用；

3、ce对抗aac术后大鼠心肌肥厚，可能与抑制心肌细胞[ca²⁺]i，抑制心肌细胞anp，β-mhc蛋白表达有关。

实施例3：杭白菊提取物对压力负荷诱导的大鼠心肌肥厚及肾素血管紧张素醛固酮系统的影响1材料与方法

1.1主要试剂及仪器

杭白菊提取物(ce，总黄酮质量分数36％)，浙江湖州圣氏生物科技有限公司，淡黄色粉末；肾素(pra)检测试剂盒，购自上海灵丹生物技术有限公司；血管紧张素(angⅱ、醛固酮ald)及羟脯氨酸检测试剂盒，南京建成生物工程技术有限公司生产；masson染色试剂盒购自上海联科生物技术有限公司；xsp-c型光学显微镜，上海光学仪器一厂；du-600型紫外分光光度计，美国贝克曼库尔特公司；5415d高速离心机，德国eppendorf公司，超声心动图(美国ge公司，vivid7型号)及13mhz高频线控探头(美国ge公司)。

1.2实验动物与分组

雄性sd大鼠(体重238±19g)，用腹主动脉缩窄术复制心肌肥厚模型，8w后将40只模型大鼠随机分为模型组和ce高、中、低剂量组(各n＝10)。ce高、中、低剂量组用杭白菊提取物480、240、120mg/kg灌胃处理，1次/d，连续8w。同时选取10只仅开腹而不行结扎的大鼠作为假手术组，假手术组和模型组每天以等量蒸馏水灌胃。所有大鼠均购自上海斯莱克公司，造模及后续观察期间均于spf级实验动物房中饲养，人工控制光照，明暗交替时间为12:12，室温(24±1)℃，湿度60％～70％。

1.3心肌肥厚大鼠模型的建立

购回大鼠适应性饲养1w，参照相关文献方法制备心肌肥厚模型：戊巴比妥钠腹腔注射，剑突下行腹正中切口，逐层打开腹腔后，在肾动脉分支以上游离腹主动脉，将7号针头与腹主动脉平行排列后将两者结扎，将针头抽出后关闭腹腔。假手术组仅行开腹而不结扎，其余操作相同。术后1w内给予青霉素(30u/500g)肌注以预防感染。

1.4超声心动图检测

治疗8w后用超声心动图检查，采用10％水合氯醛腹腔麻醉后，取仰卧位后备皮，采用m型超声心动图连续检测3个心动周期，分别记录左室舒张末内径(lvedd)、左室收缩末期内径(lvesd)、左心室射血分数(lvef)及左心室短轴缩短率(lvfs)

1.5心肌肥厚指标检测

8w后将处死大鼠，开胸取出心脏，表面液体吸干后称重，沿房室交界及两心室交界剪开，依次剪去心房及右心室后，将左心室分离并称重，以心脏质量与体质量的比值计算心脏指数(ci)，以左心室质量与体质量的比值计算左心室重量指数(lvmi)。将左心室纵切面进行石蜡包埋，制片，masson染色后，每个心肌标本随机选取5个视野进行测量，以心肌胶原面积与视野总面积的比值为心肌胶原容积分数(cvf)，以小动脉管腔周围胶原面积与动脉管腔面积为心肌血管周围胶原面积比(pvca)。另取5只大鼠，取50mg左心室组织经匀浆、消化后，留取上清液采用试剂盒检测羟脯氨酸含量。

1.6肾素血管紧张素醛固酮系统相关指标检测

8w后将大鼠麻醉后，开胸取主动脉血3ml，不加抗凝剂，静置2h后以4000r/min离心10min后取上清，采用试剂盒检测血清pra、angⅱ及ald水平，具体操作完全按照试剂盒说明书进行。

1.7统计学处理

所有数据用spss17.0统计软件进行分析。结果以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较用t检验，以p＜0.05被认为有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠超声心动图结果比较

与假手术组相比，模型组的lvedd、lvesd均升高，lvef、lvfs均降低(p＜0.05)；ce高、中、低剂量组lvedd、lvesd均低于模型组(p＜0.05)，lvef、lvfs均高于模型组(p＜0.05)，见表4。

表4各组大鼠的超声心动图结果比较(n＝10)

与假手术组比较：*p＜0.05；与模型组比较：#p＜0.05；##p＜0.01。

2.2各组大鼠心肌肥厚的相关指标水平比较

与假手术组相比，模型组的ci、lvmi、cvf、pvca均升高(p＜0.05)；ce高、中、低剂量组ci、lvmi、cvf、pvca均低于模型组(＜0.05)，见表5。

表5各组大鼠心肌肥厚的相关指标比较(n＝10)

与假手术组比较：*p＜0.05；与模型组比较：#p＜0.05；##p＜0.01。

2.3各组大鼠左心室心肌组织羟脯氨酸含量比较

模型组的羟脯氨酸含量为(0.64±0.21)μg/mg，高于假手术组的(0.29±0.07)μg/mg(p＜0.05)；ce高、中、低剂量组的羟脯氨酸含量依次为(0.25±0.08)、(0.37±0.17)和(0.46±0.14)μg/mg，均低于模型组(p＜0.05)；ce中、低剂量组的羟脯氨酸含量高于假手术组(p＜0.05)。

2.4各组大鼠rass系统相关指标的比较

与假手术组相比，模型组的pra、angⅱ及ald均升高(p＜0.05)；ce高、中、低剂量组的pra、angⅱ及ald水平均低于模型组(p＜0.05)，但与假手术组仍有差异，见表6。

表6各组大鼠rass系统相关指标的比较(n＝10)

与假手术组比较：*p＜0.05；与模型组比较：#p＜0.05；##p＜0.01。

结论：

1、ce能改善压力负荷诱导的大鼠心功能及心肌肥厚。

2、ce对大鼠心肌作用，可能与其改善肾素血管紧张素醛固酮系统激活有关，且以上改善作用与其剂量相关。