本发明涉及一种应用方法，尤其是一种辛伐他汀的应用，属于生物医药的技术领域。
背景技术：
牙髓炎是指发生于牙髓组织的炎性病变，主要特征是对外界刺激，尤其是冷热的敏感性增强。牙髓是主要包含神经血管的疏松结缔组织，位于牙齿内部的牙髓腔内。深龋、楔状缺损等牙体硬组织疾病如不能得到及时有效地控制和治疗，均可引发牙髓炎，成为口腔中最为多发和常见的疾病之一。
牙髓由结缔组织、淋巴细胞、血管、神经纤维和牙髓干细胞组成，其主要功能为产生牙质，并维持牙质的生理活性。在牙髓中，牙髓干细胞具有很强的产生成牙质细胞的能力，能够在牙齿受到外界损伤时产生新的牙质。尽管牙髓干细胞的数量不到牙髓细胞总数的1％，但是在牙髓炎过程中，它们在牙质再生的过程中起着至关重要的作用。因此，牙髓干细胞在再生医学方面具有广阔的应用前景。
目前，口服抗生素是治疗牙髓炎的最常用手段，然而在很多情况下效果并不理想。今年来，研究者发现降脂药——辛伐他汀能够在体外和体内诱导牙髓干细胞分化，从而促进牙髓再生。然而，在牙髓炎中，关于辛伐他汀对牙髓干细胞的影响以及它作为治疗牙髓炎的药物，迄今为止尚无报道。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种辛伐他汀的应用，其能有效治疗牙髓炎，安全可靠。
按照本发明提供的技术方案，一种辛伐他汀的应用，利用辛伐他汀来改善炎症状态下牙髓干细胞的状态，以用来治疗牙髓炎。
当辛伐他汀的浓度为0～10μg/ml时，能够加快牙髓干细胞的增殖。
炎症状态下，辛伐他汀能够促进牙髓干细胞的细胞周期进程。
炎症状态下，辛伐他汀能够促进牙髓干细胞的凋亡。
炎症状态下，辛伐他汀能够抑制牙髓干细胞的炎症反应。
炎症状态下，辛伐他汀能够促进牙髓干细胞中血管内皮生长因子的表达与分泌。
本发明的优点：通过辛伐他汀用来调节牙髓干细胞的增殖、细胞周期、细胞凋亡、炎症反应和血管内皮因子的表达分泌，即采用辛伐他汀来治疗牙髓炎，安全有效，为牙髓炎的治疗提供了一种新的方法，治愈效率高。
附图说明
图1为本发明中采用形态学(a)和间充质细胞标记基因的表达(b)对分离的细胞进行鉴定。
图2为辛伐他汀对牙髓干细胞活性的影响。(a)不同浓度的辛伐他汀处理牙髓干细胞，“**”，p<0.01，表示辛伐他汀浓度为8μg/ml时，细胞的活力极显著高于浓度为8μg/ml时的细胞活力；(b)lps与辛伐他汀共同作用于牙髓干细胞；“**”，p<0.01，表示lps+辛伐他汀组的细胞活力极显著高于lps组。
图3为辛伐他汀对牙髓干细胞周期的影响；“**”，p<0.01，表示lps+辛伐他汀组与lps组相比，差异极其显著。
图4为辛伐他汀对牙髓干细胞凋亡的影响。“**”，p<0.01。
图5为辛伐他汀对牙髓干细胞中炎症相关基因的表达的影响。“**”，p<0.01。
图6为辛伐他汀对牙髓干细胞中血管内皮生长因子分泌与表达的影响。“**”，p<0.01。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细阐述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
本发明实施例中使用的牙髓干细胞来自于5位牙髓炎患者的第三磨牙，并通过常规的口腔手术获得。
实施例1、牙髓干细胞的分离
牙髓炎患者的第三磨牙被取下后，浸泡于α-mem培养基中，所述培养基中添加3mg/ml的i型胶原酶和4mg/ml的分散酶，37℃培养1h。经过酶消化，牙髓分散成单个细胞，细胞悬液接种于25cm2的细胞培养瓶中。细胞培养所用的培养基为imdm培养基，其中，添加10％的胎牛血清，2mm的l-谷氨酰胺，100u/ml的链霉素和100u/ml的青霉素。经过大约7天的培养，细胞克隆开始形成，挑取克隆至新的培养瓶中继续培养，当细胞的汇合度达到70％时，细胞根据需要用于其它的实验。
牙髓干细胞属于间充质干细胞的一种，为了确定培养的细胞为牙髓干细胞，从细胞形态和分子标记两方面对培养的细胞进行鉴定。由图1(a)所示，细胞呈现典型的间充质干细胞形态。进一步地，通过鉴定间充质干细胞特有的标记基因是否表达，来确定培养的细胞的类型。由图1(b)所示，间充质干细胞特有的标记基因cd73、cd90和cd166在细胞中高水平表达。在检测过程中，分别使用如下引物进行扩增，具体为：
cd73-f:5’-agcagcattcctgaagatcca-3’
cd73-r:5’-ttccagaacatttcatccgtgt-3’
cd90-f:5’-gatcctagcctcacccgtca-3’
cd90-r:5’-tgttttttgcagccttggct-3’
cd166-f:5’-gataccattatcataccttgccg-3’
cd166-r:5’-gataccattatcataccttgccg-3’
这些数据表明，培养的细胞为牙髓干细胞。
实施例2、辛伐他汀对牙髓干细胞活性的影响
将牙髓干细胞接种于96孔细胞板，向培养基中加入不同浓度的辛伐他汀，使得其终浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml。细胞的活性采用mtt法测定，按照如下过程完成：细胞经辛伐他汀或lps刺激后，向每孔细胞中加入10μl的mtt溶液(5mg/ml)，37℃孵育3h。去除培养基，向每个细胞孔中加入200μl甲瓒溶液，待结晶全部溶解后，在570nm出测定溶液的吸光度，吸光度与细胞的数量成正比。细胞在药物处理0天时的细胞数量作为增殖的起点，即为100％。细胞连续培养10天，分别在第2天、4天、6天、8天、10天时测定吸光度，该天的细胞数量以当天的吸光度/第0天时的吸光度x100％表示。实验结束后，绘制不同药物浓度下牙髓干细胞的增殖曲线。
由图2(a)可以看出，当辛伐他汀的浓度较低时(2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，10μg/ml)，药物能够加快牙髓干细胞的增殖。其中，当辛伐他汀的浓度为8μg/ml时，细胞的增殖速度最快。当药物浓度较大时(15μg/ml和20μg/ml)，细胞的增殖速度小于对照组。由此可见，一定浓度的辛伐他汀可以刺激牙髓干细胞的增殖，而且当浓度为8μg/ml时，增殖效果最明显。
lps是一种牙髓炎的诱导剂，为了观察辛伐他汀在炎症状态下对牙髓干细胞的影响，用60μg/mllps诱导细胞的炎症状态，并用8μg/ml的辛伐他汀进行干预。实验中将细胞随机分为4组，分别为：对照组、lps组、辛伐他汀+lps组、辛伐他汀组。同样采用mtt法测定细胞的增殖曲线。由图2(b)可知，与对照组相比，lps组的细胞生长明显较慢，而辛伐他汀+lps组细胞的增殖速度有所提升。由此可知，无论是正常状态的牙髓干细胞，还是炎症状态下的细胞，辛伐他汀都具有增强细胞活性的能力。
实施例3、辛伐他汀对牙髓干细胞的细胞周期的影响
为了测试辛伐他汀对细胞周期的影响，将细胞随机分为4组，分别为：对照组、lps组、辛伐他汀+lps组、辛伐他汀组。用冰上预冷的pbs溶液清洗牙髓干细胞，向细胞中加入0.5ml70％的预冷乙醇，并在4℃孵育30min。随后用100mg/ml的rnase在37℃处理细胞30min，然后加入50mg/ml的碘化丙啶。紧接着，采用流式细胞术对各个时期的细胞进行计数分析。
由图3可知，经过lps处理后，处于g1期细胞的比例从对照组的71.34±1.76％上升到81.04±2.43％，而辛伐他汀组中，g1期细胞的数量降到了74.12±1.12％。相应地，s期细胞的数量显著上升。这些变化都具有统计学差异。所以，辛伐他汀具有促进牙髓干细胞分裂增殖的功能。
实施例4、辛伐他汀对牙髓干细胞凋亡的影响
随机将牙髓干细胞分为4组，分别为：对照组、lps组、辛伐他汀+lps组、辛伐他汀组。经过药物处理后，采用annexinv-fitc和碘化丙啶对细胞进行染色，染色条件为37℃5min。随后，采用流式细胞术分析每组细胞的凋亡情况。
由图4可知，lps组中细胞凋亡数量较对照组显著增加，辛伐他汀组与对照组相比，凋亡的细胞略有增加，而辛伐他汀+lps组中细胞凋亡的数量较lps组有显著的增加。由此可见，辛伐他汀能够促进炎症状态下的牙髓干细胞的凋亡。
实施例5、辛伐他汀对炎症因子表达的影响
牙髓炎发生时，牙髓中的炎症反应由众多的细胞因子介导，主要包括il-1，il-4，il-6，il-1β，ifn-γ和tnf-α。这些因子的表达水平通过qpcr的方法测定。测定过程为：随机将牙髓干细胞分为4组，分别为：对照组、lps组、辛伐他汀+lps组、辛伐他汀组。经过药物处理后，采用trizol试剂裂解细胞，提取总rna，并反转录合成cdna。在qpcr反应中，以1μl的cdna作为模板，分别采用以下引物做扩增。引物序列分别为：
il-1-f：5’-tgagctcgccagtgaaatga-3’
il-1-r：5’-catggccacaacaactgacg-3’
il-4-f：5’-gtgcaccgagttgaccgta-3’
il-4-r：5’-cgtactctggttggcttcct-3’
il-6-f：5’-tcaatattagagtctcaaccccca-3’
il-6-r：5’-agaaggcaactggaccgaag-3’
il-1β-f：5’-cctgagctcgccagtgaaat-3’
il-1β-r：5’-catggccacaacaactgacg-3’
ifn-γ-f：5’-gcagctaaaacagggaagcg-3’
ifn-γ-r：5’-cttgcttaggttggctgcct-3’
tnf-α-f：5’-ctgggcaggtctactttggg-3’
tnf-α-r：5’-ctggaggccccagtttgaat-3’
由图5可知，与对照组相比，lps组上调了il-1，il-4，il-6，il-1β，ifn-γ和tnf-α的表达，其中il-1β和tnf-α的变化最为明显，分别升高了7.84倍和12.17倍，表明lps在牙髓干细胞中诱导出了炎症反应。与lps组相比，辛伐他汀+lps组中，出了il-6的表达未发生显著变化，其它的炎症因子基因的表达均受到了抑制，其中il-1β和tnf-α的变化最为明显，分别下降了3.2倍和3.5倍。这些结果表明，辛伐他汀能够有效地抑制炎症反应。
实施例6、辛伐他汀对血管内皮生长因子(vegf)的影响
在牙髓炎过程中，血管生长因子对于血管的生成至关重要，而且与炎症反应密切相关。在众多的血管生成因子中，血管内皮生长因子(vegf)最为重要，它与血管生成，新生血管的穿透相关。血管内皮生长因子的分泌采用elisa的方法测定测定过程为：随机将牙髓干细胞分为4组，分别为：对照组、lps组、辛伐他汀+lps组、辛伐他汀组。经过药物处理后，取50μl培养基上清和标准品加入到购买的酶标板中，室温孵育2h，然后用pbs溶液清洗3次。向每个孔中加入200μl底物，反应10-15min后加入终止液进行终止，用酶标仪在450nm波长读取各孔的吸光度。标准曲线根据已知标准品的浓度及产生的吸光度值来绘制，根据待测样品的吸光度来计算样品中血管内皮生长因子的浓度。
同时，采用qpcr的方法测定血管表皮生长因子基因的表达水平。细胞处理与分组与elisa相同。测定方法为：用trizol试剂裂解细胞，提取总rna，并反转录合成cdna。在qpcr反应中，以1μl的cdna作为模板，分别采用以下引物做扩增。引物序列分别为：
vegf-f：5’-ctcaccaaggccagcacata-3’
vegf-r：5’-ggctccagggcattagacag-3’
由图6可知，与对照组相比，lps组vegf含量显著上升，然而，lps+辛伐他汀组vegf的含量明显下降。同样，由图6可知，与对照组相比，lps组vegf的表达显著上升，然而，lps+辛伐他汀组vegf的表达明显下降。由此可见，辛伐他汀能够显著抑制vegf的表达与合成。
实施例7、辛伐他汀对牙髓炎的治疗效果
50例牙髓炎患者接收辛伐他汀的治疗，患者每日服用药物1mg，连续服用2周。另外，50例牙髓炎患者给予安慰剂作为对照组。用药治疗结束后，采用4级标准对治疗效果进行评价，分别为：
痊愈：症状全部消失，饮食与睡眠均正常，冷、热饮食刺激无任何疼痛感，治疗2年以上未复发；
显著：主要症状基本消失，偶有冷、热刺激后牙周不适，治疗1年以上未复发；
好转：主要症状基本消失，偶有冷、热刺激后牙周不适，治疗1年以内轻度复发，但未作治疗而自行恢复；
无效：牙痛症状虽有缓解，冷、热刺激使病情加重，心烦、失眠，停止治疗半年内仍多次复发，须再行治疗。
治疗结果如表1。
表1.辛伐他汀对牙髓炎患者的治疗效果统计表
由表1可以看出，辛伐他汀治疗牙髓炎的有效率高达96％，且对病人无任何副作用。
这些结果表明，炎症状态下，辛伐他汀具有促进牙髓干细胞的增殖的功能，并能有效地抑制炎症反应，以及抑制血管内皮生长因子的表达与合成。进一步地，辛伐他汀能够高效地治疗牙髓炎，并对患者无任何毒副作用。
最后需要说明的是，以上实施例仅用说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优化的实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。