一种脂质修饰二硫化钼纳米复合材料的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种脂质修饰二硫化钼复合材料的制备方法及应用，属于材料合成和生物医药技术领域。

背景技术：

众所周知，癌症已成为威胁人类生命健康的世界性问题，而通过化学药物治疗是目前临床治疗肿瘤的重要方法。但传统化疗药物不可避免的存在着毒副作用大、专一性差等弊端。所以开发具有靶向性的高效新型药物传递系统成为癌症治疗领域的热点。近年来，随着科学技术的不断发展，纳米药物载体因其独特的结构和性能引起了医学界的广泛关注，其可提高药物靶向性、稳定性、生物利用度等，还具有降低药物的毒副作用和缓控释药等优点。因此，纳米载体材料作为药物传递方面深受关注。

层状二硫化钼（mos2）是一种类石墨烯层状结构的tmd，由化学键合的二维s-mo-s纳米片组通过范德华力的相互作用堆叠的片层结构，其超薄的2d纳米平面结构赋予它超高比表面积以及优异的理化性质，使其成为非常有潜力的生物医学纳米材料。层状mos2是非常理想的石墨烯替代品，在控制药物释放、光热及光动力治疗、诊断成像、生物传感器等领域展现出广阔的应用前景。mos2由于它的结构特征具有巨大的比表面积，可以为药物提供许多结合位点，因此能够用于载药。与脂质体和胶束相比，mos2具有更好的物理化学稳定性，无需载体的瓦解就能释放药物。

光热治疗（ptt）是最近兴起的一种微创癌症治疗方法。它使用光热材料吸收激光并将其转化为热量，从而导致肿瘤组织局部升温过高，造成蛋白质变性，细胞膜损伤，并导致肿瘤不可逆的消融死亡。激光用于治疗时的非特异性会杀伤正常细胞，具有一定的副作用。光热试剂的使用能够增强选择性，从而使得激光能在肿瘤的微环境部位产生足够的热量杀死肿瘤细胞。mos2具有良好的光热效应，可将近红外（nir）光转化为热量，用于局部光热治疗。mos2纳米片作为光热治疗试剂已经成功用于肿瘤的光学治疗。但其仍然存在稳定性差，水溶性和生物相容性不高等问题，限制了其在医药学领域的应用。因此对mos2进行必要修饰和改性，是提高其在生物医学领域的应用性能的必要手段。

未经修饰的mos2对溶质、酸碱度、离子强度等溶液环境比较敏感，在生理环境下易发生团聚。因此需要对mos2烯进行必要的修饰和改性，以改善其在生物医学领域的应用性能。常用的修饰方法有亲水链（如聚乙二醇peg）共价修饰、高分子聚合物（如普朗尼克f127）非共价修饰等。通过大量实验和查阅文献发现，虽然有机聚合物的引入能够有效增加氧化石墨烯的亲水性，降低网状内皮系统的摄取，但却不能阻止载药氧化石墨烯的不可逆聚沉；并且，药物的大量吸附会中和氧化石墨烯表面的电荷，从而降低层与层之间的相互排斥力。

技术实现要素：

本发明目的是为了解决二硫化钼在生理环境中易团聚而沉降的问题，采用脂质体对二硫化钼进行修饰的方法，得到二硫化钼-脂质复合材料，该药物载体具有在生理环境中稳定性好、载药量高、细胞亲和性好、靶向释药等优点，具有良好的应用前景。

为了达到以上目的，按照下列步骤进行：

（1）将二硫化钼溶于水中，得到混悬液，超声分散，得到二硫化钼水分散液；

（2）将蛋黄磷脂溶于氯仿中，置于旋转蒸发仪上旋转成膜，然后加水溶性磷酸盐缓冲液溶解，旋转使膜脱落，超声后即得脂质体分散液；

（3）将步骤（1）所述的二硫化钼和步骤（2）所述的脂质体分散液混合后置于恒温水浴振荡箱中搅拌，离心得到沉淀，用水溶性磷酸盐缓冲液溶解，超声后即得二硫化钼-脂质纳米复合材料。

优选的，步骤（1）中所述的超声功率200w-400w，超声时间10min-30min，冰水浴。

优选的，步骤（1）中所述的二硫化钼水分散液浓度为0.5mg/ml-1mg/ml。

优选的，步骤（2）中所述的蛋黄磷脂和氯仿的质量比为1:75。

优选的，步骤（2）中所述的脂质体分散液的浓度为3-5mg/ml。

优选的，步骤（3）中所述的二硫化钼分散液和脂质体分散液的质量比为1:5-1:20。

所述二硫化钼-脂质复合材料应用于抗癌药物载体方面。

本发明的有益效果：

（1）本发明制备的二硫化钼-脂质纳米复合材料，粒径在200-400nm的范围内，载药量高达104.4%，经过脂质修饰后，明显改善了载体材料在生理条件下的稳定性；经过24h，二硫化钼材料在水溶性磷酸盐缓冲液和细胞培养液中产生明显的聚沉现象，而二硫化钼-脂质复合材料在三种分散介质中均保持良好的分散性和稳定性。

（2）相比于普通的纳米载药颗粒，将药物载体用脂质修饰使其具有生物相容性和靶向性，在肿瘤部位较低ph的环境下快速地释放药物，降低了药物对正常组织的伤害，而且二硫化钼具有优异的光热性能，可作为光热治疗剂，结合靶向性，治疗肿瘤，具有良好的应用前景。

（3）本发明所述二硫化钼-脂质复合材料的制备方法，是通过非共价修饰改善了二硫化钼在生理条件下极不稳定的缺点。

（4）本发明操作简单，成本低，易于大规模生产，可以广泛应用于生物医药领域，作为药物载体降低抗肿瘤药物的毒副作用。

附图说明

图1是实施例1所制备的二硫化钼（a）和二硫化钼-脂质（b）材料的原子力显微镜图谱（右侧的坐标图表示afm图谱中所画直线上的粒子的厚度的具体数值）。

图2中a是实施例1所制备的二硫化钼分别在纯净水（左）、磷酸盐缓冲液（pbs，ph为7.4）（中）和含10%的胎牛血清rpmi-1640培养液（右）中的稳定性考察图；b是实施例1所制备的二硫化钼脂质分别在纯净水（左）、磷酸盐缓冲液（pbs，ph为7.4）（中）和含10%的胎牛血清rpmi-1640培养液（右）中的稳定性考察图。

图3是实施例5中不同浓度的二硫化钼材料（a）和二硫化钼-脂质（b）材料的光热性能考察结果图。

图4是实施例6中游离阿霉素（a）、二硫化钼-阿霉素（b）和二硫化钼-脂质-阿霉素（c）的在pbs溶液中的分散图；

图5是实施例7中二硫化钼-脂质-阿霉素复合材料的体外释药图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

（1）将二硫化钼水分散液用细胞破碎仪破碎成纳米尺寸的二硫化钼水分散液，功率200w，超声时间10min，冰水浴中进行；

（2）称取蛋黄磷脂，并将其溶于适量的氯仿中，蛋黄磷脂和氯仿的质量比为1:75；然后量取该溶液置于茄形瓶中，利用旋转蒸发仪使之旋转成膜（先旋转半分钟再抽真空）。然后往容器中加入适量pbs溶液并旋转使膜脱落，将茄形瓶中的内容物倒入到10ml离心管中，超声分散使之澄清；

（3）配制一定量的浓度为1mg/ml的二硫化钼水溶液，取5ml离心管若干，分别加入二硫化钼溶液，脂质体溶液和适量纯水，二硫化钼和脂质体的质量比为1：5，置于恒温振荡器搅拌过夜（37℃）；将溶液离心（13000r，30min），弃去上清，将沉淀分散于适量pbs溶液中，超声分散使之澄清，得到脂质修饰二硫化钼（浓度0.5mg/ml）。

如图1原子力显微镜图谱结果所示，二硫化钼（a）的平均尺寸在210±2nm，厚度在5nm左右，表明了已利用细胞破碎法成功制备纳米级的二硫化钼；在将脂质体包裹到二硫化钼上之后（b），厚度增加到15nm左右，这说明已成功地将脂质包覆到二硫化钼的表面。粒径测量结果也表明，二硫化钼粒径为217±2nm，而脂质修饰二硫化钼的粒径则增加到了250±2nm，粒径略有增加，但依旧处于纳米级别，这说明已经成功地将脂质体包裹到二硫化钼的表面，而且脂质修饰的二硫化钼稳定性良好。二硫化钼的zeta电位为﹣43.28mv，脂质体的电位为﹣27.65mv；而经脂质修饰的二硫化钼电位变为﹣34.29mv，接近于脂质体的电位，zeta电位的变化表明，脂质体已经成功地包裹到二硫化钼表面。稳定性结果（如图2所示）表明，二硫化钼-脂质在三种分散介质中均保持良好的稳定性。进而说明用脂质体对二硫化钼进行表面修饰后可明显改善二硫化钼在生理环境中易沉聚的缺点，增强其稳定性和分散性。

实施例2：

（1）将二硫化钼水分散液用细胞破碎仪破碎成纳米尺寸的二硫化钼水分散液，功率300w，超声时间20min，冰水浴中进行；

（2）称取蛋黄磷脂，并将其溶于适量的氯仿中，蛋黄磷脂和氯仿的质量比为1:75；然后量取该溶液置于茄形瓶中，利用旋转蒸发仪使之旋转成膜（先旋转半分钟再抽真空），然后往容器中加入适量pbs溶液并旋转使膜脱落，将茄形瓶中的内容物倒入到10ml离心管中，超声分散使之澄清；

（3）配制一定量的浓度为1mg/ml的二硫化钼水溶液，取5ml离心管若干，分别加入二硫化钼溶液，脂质体溶液和适量纯水，二硫化钼和脂质体的质量比为1：10，置于恒温振荡器搅拌过夜（37℃）；将溶液离心（13000r，30min），弃去上清，将沉淀分散于适量pbs溶液中，超声分散使之澄清，得到脂质修饰二硫化钼（浓度0.5mg/ml）。

粒径测量结果表明，二硫化钼粒径为205±2nm，经脂质修饰后粒径变为245±2nm。二硫化钼的zeta电位为﹣43.78mv，脂质包裹以后，zeta电位变为﹣32.58mv。

实施例3：

（1）将二硫化钼水分散液用细胞破碎仪破碎成纳米尺寸的二硫化钼水分散液，功率250w，超声时间30min，冰水浴中进行；

（2）称取蛋黄磷脂，并将其溶于适量的氯仿中，蛋黄磷脂和氯仿的质量比为1:75；然后量取该溶液置于茄形瓶中，利用旋转蒸发仪使之旋转成膜（先旋转半分钟再抽真空），然后往容器中加入适量pbs溶液并旋转使膜脱落；将茄形瓶中的内容物倒入到10ml离心管中，超声分散使之澄清；

（4）配制一定量的浓度为1mg/ml的二硫化钼水溶液，取5ml离心管若干，分别加入二硫化钼溶液，磷脂溶液和适量纯水，二硫化钼和脂质体的质量比为1：15置于恒温振荡器搅拌过夜（37℃）；将溶液离心（13000r，30min），弃去上清，将沉淀分散于适量pbs溶液中，超声分散使之澄清，得到脂质修饰二硫化钼（浓度0.5mg/ml）。

粒径测量结果表明，二硫化钼粒径为213±2nm，经脂质修饰后粒径变为258±2nm。二硫化钼的zeta电位为﹣44.08mv，脂质包裹以后，zeta电位变为﹣35.36mv。

实施例4：

（1）将二硫化钼水分散液用细胞破碎仪破碎成纳米尺寸的二硫化钼水分散液，功率400w，超声时间30min，冰水浴中进行；

（2）称取蛋黄磷脂，并将其溶于适量的氯仿中，蛋黄磷脂和氯仿的质量比为1:75；然后量取该溶液置于茄形瓶中，利用旋转蒸发仪使之旋转成膜（先旋转半分钟再抽真空），然后往容器中加入适量pbs溶液并旋转使膜脱落；将茄形瓶中的内容物倒入到10ml离心管中，超声分散使之澄清；

（4）配制一定量的浓度为1mg/ml的二硫化钼水溶液，取5ml离心管若干，分别加入二硫化钼溶液，磷脂溶液和适量纯水，二硫化钼和脂质体的质量比为1：20置于恒温振荡器搅拌过夜（37℃）；将溶液离心（13000r，30min），弃去上清，将沉淀分散于适量pbs溶液中，超声分散使之澄清，得到脂质修饰二硫化钼（浓度0.5mg/ml）。

粒径测量结果表明，二硫化钼粒径为204±2nm，经脂质修饰后粒径变为254±2nm。二硫化钼的zeta电位为﹣44.08mv，脂质包裹以后，zeta电位变为﹣34.36mv。

实施例5:二硫化钼脂质复合材料的光热性能考察

取不同浓度的样品溶液（二硫化钼、二硫化钼脂质）和纯水置于比色皿中，使用红外激光器照射，记录它们在10min之内的温度变化情况并作图。实验结果如图3显示，二硫化钼（a）在红外激光照射下的10分钟内温度逐渐升高，浓度越高，升温越快，这说明二硫化钼纳米材料可以吸收光能并将其转化成热能，具有优异的光热性能，且其光热性质具有明显的浓度依赖性；二硫化钼脂质复合材料（b），在激光照射下随着时间的增加温度也逐渐升高，且升温的速率与二硫化钼相似，具有良好的光热性能，其光热性能也同样具有浓度依赖性,可以作为很好的光热治疗剂.

实施例6：负载阿霉素的二硫化钼脂质复合材料的制备

取二硫化钼-脂质复合材料100mg，置于离心管中，加入阿霉素溶液（1mg/ml）200μl，恒温震荡24h（37℃），离心，取上清液稀释，在480nm处，用紫外分光光度法测量上清液和阿霉素対照液的吸光度，进而计算载药量。实验结果表明，二硫化钼载体对dox的负载率达到了113.6%，表明二硫化钼是可以负载dox的理想载体，二硫化钼脂质复合材料载体对dox的负载率比二硫化钼稍有降低，为104.4%，但是二硫化钼负载dox后在生理环境下发生明显的聚沉现象（如图4），分散性和稳定性较差，利用脂质体修饰的二硫化钼载药在生理环境下的稳定性和分散性增强，几乎没有团聚，因此二硫化钼脂质复合材料是能够负载抗肿瘤药物的理想载体。

实施例7：负载阿霉素的二硫化钼脂质复合材料的药物释放考察

将1ml载药二硫化钼-脂质分别加入到透析袋中，扎紧，然后将其浸没在20mlph为5.0和7.4的pbs缓冲溶液中，放置在37℃恒温振荡箱中振荡并计时，在不同时间点依次将溶出介质全部取出并补充进新的20mlpbs缓冲液继续振荡。将取出的溶出介质用荧光分光光度法（激发波长为488nm，测定波长为591nm，狭缝10nm）测定其荧光强度，与标准阿霉素释放量做比求得阿霉素的释放率。所得结果如图5所示，dox在二硫化钼载体和二硫化钼脂质载体的释放具有显著的ph依赖性。在pbs缓冲液的ph为5.0时的dox释放量高于ph为7.4时的dox释放量,这表明载药后载体的ph依赖特性可以增强药物在肿瘤组织中的释放，减少了药物在血液循环中的释放，可以有效地降低药物的毒副作用。此外脂质修饰后的二硫化钼载体载药稳定性好，分散性高，可以作为很好的载药载体材料。