脾酪氨酸激酶作为肝内胆管细胞癌治疗靶点的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及脾酪氨酸激酶作为肝内胆管细胞癌治疗靶点的应用。

背景技术：

脾酪氨酸激酶(spleentyrosinekinase,syk)基因是1991年首次从猪脾cdna克隆出来，编码一种非受体型蛋白酪氨酸激酶。人类syk基因定位于9号染色体q22区，syk蛋白含635个氨基酸，是一类能催化底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的特异性蛋白激酶，包括受体型酪氨酸激酶、胞质型酪氨酸激酶和核内酪氨酸激酶。酪氨酸蛋白激酶可调节细胞内部及之间的信号转导，在细胞分化、增殖和扩散中起重要作用，且与肿瘤的发生发展存在密切关系。在自身免疫性疾病和血液恶性肿瘤中作用重要，如syk基因高表达可抑制乳腺癌、黑色素瘤和肝癌等恶性肿瘤细胞的增殖与迁移。众多研究表明syk基因具有抑癌作用，这些研究包括但不限于：

郭嘉仲.脾酪氨酸激酶、血管内皮生长因子-c在非小细胞肺癌淋巴转移中作用的研究[d].山东大学,2013.

寇昌伟.鼻咽癌组织脾酪氨酸激酶表达与其启动子甲基化关系和临床意义[d].2009.

杨星.脾酪氨酸激酶在结直肠癌中的表达及其对浸润转移的影响[d].2006.

张倩.脾酪氨酸激酶syk在食管癌中的表达及对其生物学特征影响的研究[d].河北医科大学,2011.

董尚文.dna启动子甲基化在脾酪氨酸激酶syk肺癌表达中的影响[d].天津医科大学,2009.

吉海龙.脾源性酪氨酸激酶基因启动子甲基化与髓母细胞瘤侵袭转移的关系[d].2016.等。

进一步的，杨龙君.肝细胞癌中syk(l)基因的表达及其临床意义[d].中山大学,2012.指出：1、syk(l)可抑制肝癌细胞的增殖、迁移与转移；2、肝癌组织中syk(l)蛋白表达降低，与肿瘤的分化、血管侵犯等侵袭转移有关的临床病理因素相关；3、syk(l)可作为评价肝癌侵袭转移的有效分子标志物。

胡青钢,刘小卫,郑启昌.酪氨酸激酶syk在肝癌中的表达及与血管生成的关系[j].中华肝胆外科杂志,2007,13(7):463-465.采用r27-pcr检测sykmrna在肝细胞性肝癌及癌旁正常组织中的表达,免疫组化sabc法检测标本中cd34的表达反映肿瘤的微血管密度(mvd).结果24例癌旁正常组织中sykmrna均表达阳性,32例肝细胞性肝癌中sykmrna表达率为46.9％(15/32),其中低分化组阳性表达率23.1％(3/13),明显低于高分化组阳性表达率63.2％(12/19)(p＜0.05).肿瘤微血管密度(mvd)检测:低分化组(ⅲ级ⅳ级为49.2±3.6,54.9±4.3),明显高于高分化组(ⅰ级ⅱ级为13.6±4.5,32.3±3.2)与正常组织(5.9±1.7),有显著统计学意义(p＜0.05).sykmrna的表达与cd34的表达明显负相关(r＝-0.97).结论肝细胞性肝癌中syk基因的缺失对癌组织血管的生成起重要的作用。换言之，抑制syk基因的表达会促进癌组织血管生成，进而促进肝癌的进展。

cn105664178a及quc,zhengd,lis,etal.tyrosinekinasesykisapotentialtherapeutictargetforliverfibrosis.[j].hepatology,2018.公开了syk作为肝纤维化/硬化治疗靶点的应用，具体是发现syk基因在肝纤维化/硬化过程中表达升高，通过促进肝星状细胞活化，加速肝纤维化的进程；使用syk抑制剂或者干扰syk基因的表达，可以有效地减缓肝纤维化/硬化的进程，具有很好地治疗作用。

目前，syk抑制剂目前已用于类风湿性关节炎、慢性淋巴细胞白血病等的临床ⅱ/ⅲ期实验，结果令人鼓舞，且药物安全性好。

在细胞学实验和动物体内实验中，已经开发了多种syk小分子化合物抑制剂，包括entospletinib(gs-9973)、fostamatinib(r788)、r406和prt062607(p505-15,biib057)hcl，这些syk抑制剂的生物学效应趋势相似，以entospletinib(gs-9973)抑制syk激酶活性最为稳定、显著。目前市场上已有多种syk小分子化合物抑制剂已应用于多种疾病的临床ii/iii期研究；其中gs-9973是最新报道用于慢性淋巴细胞白血病的临床ⅱ期实验，有效率高达91％，且药物syk靶向特异性强、脱靶率低、生物安全性好。

肝内胆管细胞癌是一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，具有胆管细胞的分化特性，可以根据解剖位置不同，分为肝内胆管细胞癌(icc)，肝门部胆管癌以及肝外胆管细胞癌(ecc)。在过去的四十年里，肝内胆管细胞癌的整体发病率在全球范围内逐步增加。

肝内胆管细胞癌的发病率占肝脏原发恶性肿瘤的10％～15％，并且近年来的发病率和死亡率逐年升高。胆管细胞癌起病隐匿，早期无明显症状和体征，后期发展迅速，易向周围组织侵犯和转移。由于胆管周围解剖关系复杂，外科切除后早期肿瘤易出现局部复发和远处转移发，造成肝内胆管细胞癌预后较差。目前，胆管癌缺乏合适的早期诊断方法和有效的治疗手段，患者预后不良，大部分患者在明确诊断后的几个月内死亡。

目前临床上肝内胆管细胞癌主要有外科手术切除、局部治疗(肝动脉灌注化疗、射频消融、微波消融等)、化疗和放疗等治疗方法。但是，单纯外科手术不能有效治疗大多数患者(发病机制不明，缺少早期诊断标志物，发现时已失去手术机会)，且术后生存率低(5年生存率为8％～47％)、复发率高(术后肝内复发率达46％～68％)；而非手术患者缺少有效的治疗手段，局部治疗对<3cm的单个病灶，以及手术后残留或局部复发者可能获益(整体疗效堪忧)；对不能手术切除或伴有转移的进展期胆管癌，吉西他滨联合铂类抗肿瘤药的化疗方案能延长胆管癌患者生存期，但受限于药物的毒性和耐药性；单纯放疗的疗效非常有限，常常作为一种辅助治疗方式，尚无证据表明术中放疗及导管内短距放疗对进展期胆管癌的疗效优于标准化疗、放化疗联合。到目前为止，胆管癌尚无标准的靶向药物，仅处于探索和临床试验阶段，尚无确定疗效的结论。

cn108273062a公开了foxml在胆管细胞癌中高表达并和预后相关，foxml抑制剂通过增加凋亡抑制胆管细胞癌增殖，foxml敲低可以增加胆管细胞癌对于顺铂的敏感性，且foxml抑制剂联合顺铂抑制胆管细胞癌增殖。由此可知，foxml在胆管细胞癌的发生和发展过程中扮演着重要的角色，为胆管细胞癌的诊断与治疗提供了新思路。

开发出一种可以有效治疗或改善肝内胆管细胞癌的药物对肝内胆管细胞癌患者具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供脾酪氨酸激酶作为肝内胆管细胞癌治疗靶点的应用。

本发明所采取的技术方案是：

syk基因或syk蛋白作为肝内胆管细胞癌治疗靶点的应用。

syk拮抗剂在制备治疗肝内胆管细胞癌药物中的应用。

进一步的，syk拮抗剂选自gs-9973、fostamatinib、r406、prt062607。

syk表达抑制剂在在制备治疗肝内胆管细胞癌药物中的应用。

进一步的，syk表达抑制剂选自syk-sirna、以syk为靶标的mirna或反义核苷酸等调降syk表达的核酸。

进一步的，肝内胆管细胞癌为syk表达量显著高于正常肝内胆管细胞的肝内胆管细胞癌。

本发明的有益效果是：

发明人通过实验发现，syk在肝内胆管细胞癌中表达升高；在体外细胞和体内动物实验中均发现，使用syk拮抗剂gs-9973可以有效抑制肝内胆管细胞癌的增殖，抑制效果接近于一线化疗药物吉西他滨。

附图说明

图1是人正常肝内胆管细胞和肝内胆管细胞癌的syk表达情况；

图2是syk拮抗剂gs-9973对胆管癌细胞(hucct-1、rbe)的抑制结果；

图3是syk拮抗剂gs-9973对胆管癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型的治疗效果。

具体实施方式

syk基因或syk蛋白作为肝内胆管细胞癌治疗靶点的应用。

syk拮抗剂在制备治疗肝内胆管细胞癌药物中的应用。

进一步的，syk拮抗剂选自gs-9973、fostamatinib、r406、prt062607。

syk表达抑制剂在在制备治疗肝内胆管细胞癌药物中的应用。

进一步的，syk表达抑制剂选自syk-sirna、以syk为靶标的mirna或反义核苷酸等调降syk表达的核酸。

进一步的，肝内胆管细胞癌为syk表达量显著高于正常肝内胆管细胞的肝内胆管细胞癌。syk表达量变化，可以使用本领域常用的方法确定，如通过比较免疫组化染色评分的方法评价表达量变化。通过比较其表达量的变化，确定其表达量是否显著高。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

syk在胆管癌组织中的表达情况

采用免疫组织化学染色法检测人正常肝内胆管细胞和肝内胆管细胞癌，比较两者syk的表达情况。

实验如果如图1所示。从图1中可知，对目前收集的5例正常胆管组织与43例肝内胆管细胞癌组织的syk免疫组化染色后进行评分分析，所有肝内胆管细胞癌组织中syk均着色，且与肝内正常胆管细胞相比，syk表达显著升高，平均免疫组化强度评分增高超过1分(***，<0.001)。

syk对胆管癌细胞增殖的影响

选用hucct-1和rbe两种胆管癌细胞株，分别使用gs-9973处理24h、48h和72h，并使用cck8试剂检测不同时间点gs-9973对胆管癌细胞增殖的影响。将hucct-1和rbe细胞制成单细胞悬液，在96孔板中每孔加入100μl约3000个细胞。待细胞贴壁后(约6h)更换含有gs-9973(浓度为2μm)的培养基，分别培养24h、48h、72h。在96孔板中每孔加入10μl的cck8试剂，继续在37℃孵箱中培养2h30min。选择450nm测定吸光度。

实验如果如图2所示。从图2中可知，gs-9973(2μm)可以显著抑制胆管癌细胞hucct-1和rbe的增殖。

使用syk特异性sirna敲低hucct-1和rbe两种胆管癌细胞中的syk表达，并检测敲低syk表达对这两种细胞增殖的影响，结果发现敲低syk能明显抑制这两种胆管细胞的增殖，其结果与使用syk抑制剂的效果类似。

裸鼠皮下移植瘤的靶向syk治疗

对数生长期的hucct-1细胞，经过胰酶消化等处理后用pbs重悬细胞，制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为1*10^7/ml。balb/c裸鼠常规消毒后，以1ml注射器吸取200μl细胞混合液，于裸鼠右侧腋窝皮下注射。每3天观察裸鼠，测量并记录瘤体的长短径和体重，绘制生长曲线；syk拮抗剂gs-9973采用灌胃方式给药治疗，5mg/kg，每日给药一次，自第9天开始，连续给药至第30天。

实验结果如图3所示。从图3中可知，gs-9973可以显著降低肿瘤的生长速度和肿瘤大小，抑制效果略逊于一线化疗药物吉西他滨(在治疗前期抑制效果强于吉西他滨)。