一种具有pH响应的壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统的制备方法与流程

本发明涉及一种具有ph响应的壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统的制备方法，属于材料合成和纳米医药领域。

技术背景

石墨烯量子点具有较好的水溶性和生物低毒性，且作为一种准零维的纳米材料，表现出独特的光学性质，可以诱导发出荧光，这些都为其作为荧光探针提供了可能，其表面含有大量的羧基，可以与含有氨基的药物分子发生酰胺化反应生成药物前体。壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，由于其良好的生物相容性、可降解性和抗菌性等优良性能被广泛应用于化工、化妆品、食品和医药等诸多领域。本发明通过酰胺化反应可方便的制备石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体，再通过壳聚糖的凝胶化过程将药物前体包裹到壳聚糖凝胶中，制备了具有ph响应的壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统。

技术实现要素：

本发明的目的是为了提供一种具有ph响应的壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统的制备方法。

本发明所述一种具有ph响应的壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统的制备方法，包括以下步骤：

a、制备石墨烯量子点：将柠檬酸置于坩埚中，在马弗炉中加热一定时间即得石墨烯量子点；

b、配置石墨烯量子点溶液：将步骤a制备的石墨烯量子点冷却后用超纯水溶解即得浅黄色石墨烯量子点溶液；

c、制备石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体：将一定质量的n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到步骤b制备的石墨烯量子点溶液中，搅拌0.5h后再向石墨烯量子点溶液中加入一定量的阿糖胞苷，反应1h，用透析袋反复透析后冷冻干燥即得石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体；

d、制备壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统：将步骤c制备的石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体加入到一定浓度的壳聚糖溶液中进行搅拌，待溶液变澄清后用氢氧化钠调节ph至弱碱性，继续搅拌24h，反复透析后冷冻干燥，即得壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统；

e、将壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统在不同ph下进行阿糖胞苷的体外释放：配制ph分别为5.8、6.5和7.4的磷酸盐缓冲溶液，取30mg壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统置于透析袋中，并将透析袋悬浮于50ml的磷酸盐缓冲溶液中恒温37℃磁力搅拌进行药物体外释放，药物释放累计进行72h，前20h每隔30min取一次样，20～48h每隔6h取一次样，48～72h每隔12h取一次样，每次取样是从溶液中取出3ml溶液，测定释放出的阿糖胞苷的量，同时补充3ml新鲜的磷酸盐缓冲溶液。阿糖胞苷的浓度使用紫外分光光度计在271nm处测定，根据测定的阿糖胞苷的量计算出不同时间的释药累积百分数。

进一步地，所述步骤a中柠檬酸的质量为0.1～1g，加热温度为180～200℃，加热时间为0.5～6h。

进一步地，所述步骤b中得到的石墨烯量子点溶液浓度为5～20mg/ml。

进一步地，所述步骤c中使用的n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐质量相同，其用量为50～500mg，阿糖胞苷的用量为5～50mg，透析袋的截留分子量为500。

进一步地，所述步骤d中壳聚糖溶液是将壳聚糖粉末分散在0.1mol/l的盐酸中制备的，壳聚糖浓度为1～10mg/ml。

进一步地，所述步骤e中磷酸盐缓冲溶液浓度为0.05～0.2mol/l。

本发明的有益效果是：石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体制备简单，通过酰胺化即可得到；壳聚糖不仅能有效的抑制石墨烯量子点的团聚，提高石墨烯量子点的荧光稳定性，而且在阿糖胞苷释放过程中能有效抑制该药物的突释。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为实施例一中刚制备的石墨烯量子点(a)和在空气中暴露15天的石墨烯量子点(b)的透射电子显微镜图；

图2为实施例一中刚制备的石墨烯量子点(a)和在空气中暴露15天的石墨烯量子点(b)的粒径分布图；

图3为对比例一中刚制备的壳聚糖/石墨烯量子点(a)和在空气中暴露15天的壳聚糖/石墨烯量子点(b)的透射电子显微镜图；

图4为实施例一中刚制备的石墨烯量子点和在空气中暴露15天的石墨烯量子点在激发波长为360nm时荧光发射光谱图；

图5为对比例一中刚制备的壳聚糖/石墨烯量子点和在空气中暴露15天的壳聚糖/石墨烯量子点在激发波长为360nm时的荧光发射光谱图；

图6为实施例一中不同ph值条件下壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统的药物释放曲线图；

图7为对比例二中不同ph值条件下石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体的药物释放曲线图。

具体实施方式

现在结合具体实施例对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例一：

一种具有ph响应的壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统的制备方法，包括以下步骤：

(1)将1g柠檬酸放置于坩埚中，180℃条件下在马弗炉中加热3h即得石墨烯量子点。

(2)待步骤a制备的石墨烯量子点冷却后用50ml超纯水溶解即得浅黄色石墨烯量子点溶液。

(3)将100mg的n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到步骤b制备的石墨烯量子点溶液中，搅拌0.5h后再向石墨烯量子点溶液中加入50mg的阿糖胞苷，反应1h，用透析袋反复透析后冷冻干燥即得石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体；

(4)将步骤c中制备的石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体加入到50ml浓度为2mg/ml的壳聚糖溶液中，待溶液变澄清后用氢氧化钠调节ph至弱碱性，继续搅拌24h，反复透析后冷冻干燥，即得壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统；

(5)配制ph分别为5.8、6.5和7.4浓度为0.1mol/l磷酸盐缓冲溶液，取30mg壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统置于透析袋中，并将透析袋悬浮于50ml的磷酸盐缓冲溶液中恒温37℃磁力搅拌进行药物体外释放，药物释放累计进行72h，前20h每隔30min取一次样，20～48h每隔6h取一次样，48～72h每隔12h取一次样，每次取样是从溶液中取出3ml溶液，测定释放出的阿糖胞苷的量，同时补充3ml新鲜的磷酸盐缓冲溶液。阿糖胞苷的浓度使用紫外分光光度计在271nm处测定，根据测定的阿糖胞苷的量计算出不同时间的释药累积百分数。

实施例一中刚制备的石墨烯量子点和在空气中暴露15天的石墨烯量子点的透射电子显微镜图分别如图1a和图1b所示，通过观察可以发现，刚制备的石墨烯量子点分散性非常好且粒径大小非常均一，但是在空气中暴露15天的石墨烯量子点发生明显团聚并且形成的石墨烯量子点团簇尺寸明显增大。实施例一中刚制备的石墨烯量子点和在空气中暴露15天的石墨烯量子点的粒径分布图分别如图2a和图2b所示，刚制备的石墨烯量子点粒径主要集中在3nm左右，在空气中暴露15天的石墨烯量子点由于发生明显团聚并且形成团簇，其尺寸较刚制备的石墨烯量子点粒径有显著增大，主要集中于4～5nm。将实施例一中刚制备的石墨烯量子点和在空气中暴露15天的石墨烯量子点用水配成0.5mg/l的溶液，在360nm激发波长条件下用荧光分光光度计测其荧光发射光谱，如图4，在450nm处得到最大荧光发射波长，从荧光发射光谱图中可看出制备的石墨烯量子点和在空气中暴露15天的石墨烯量子点在450nm处的荧光强度数值分别为3.1×10³和1.7×10³，计算结果表明在空气中暴露15天的墨烯量子点的荧光强度明显下降，仅为刚制备的石墨烯量子点荧光强度的55％。

实施一中不同ph值条件下壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统的药物释放曲线图如图6所示。在图中，阿糖胞苷的累积释放量具有明显的ph敏感性，这是由于酰胺键的水解会受到ph的影响，酸性增强有利于酰胺键的水解进而导致药物释放，所以当阿糖胞苷在ph为5.8、6.5和7.4释放72h达到平衡时，累积释放量分别为75.6％，37.8％和16.6％。另外，在该药物缓释系统中，由于石墨烯量子点与阿糖胞苷之间的酰胺键发生水解导致石墨烯量子点表面重新形成羧基，由于羧基会发生电离形成羧酸根离子，和壳聚糖上质子化的氨基间产生静电吸引，从而可以维持药物阿糖胞苷的稳定释放时间长达72h。

对比例一：

一种具有荧光性能的壳聚糖/石墨烯量子点的制备方法，包括以下步骤：

将1g柠檬酸放置于坩埚中，180℃条件下在马弗炉中加热3h得石墨烯量子点，待石墨烯量子点冷却后溶于50ml水中配置成20mg/ml的溶液，取10ml加入到50ml浓度为2mg/ml壳聚糖溶液中，待溶液变澄清后用氢氧化钠调节ph至弱碱性，继续搅拌24h，反复透析后冷冻干燥，即得具有荧光性能的壳聚糖/石墨烯量子点。将刚制备的和在空气中暴露15天的壳聚糖/石墨烯量子点置于透射电子显微镜中进行观察，如图3。刚制备的石墨烯量子点粒径较小且在壳聚糖中分布较为均匀，在空气中暴露15天后，石墨烯量子点在壳聚糖中有少许团聚，但团聚程度较图1b中未加入壳聚糖的程度有显著改善。同时，将刚制备的和在空气中暴露15天的壳聚糖/石墨烯量子点用水配成0.5mg/l的溶液，在360nm激发波长条件下用荧光分光光度计测其荧光发射光谱，在450nm处得到最大荧光发射波长，如图5。从荧光发射光谱图中可看出刚制备的壳聚糖/石墨烯量子点和在空气中暴露15天的壳聚糖/石墨烯量子点在450nm处的荧光强度数值分别为2.5×10³和2.0×10³，计算结果表明在空气中暴露15天的壳聚糖/石墨烯量子点的荧光强度为刚制备的壳聚糖/石墨烯量子点荧光强度的80％，说明壳聚糖凝胶的加入会显著提高石墨烯量子点的荧光稳定性。

对比例二：

一种具有ph响应的石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体的制备方法，包括以下步骤：

将1g柠檬酸放置于坩埚中，180℃条件下在马弗炉中加热3h即得石墨烯量子点，待石墨烯量子点冷却后溶于50ml水中配置成20mg/ml的溶液，随后将100mg的n-羟基琥珀酰亚胺和100mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐加入到石墨烯量子点溶液中，搅拌0.5h后再向石墨烯量子点溶液中加入50mg的阿糖胞苷，反应1h，用透析袋反复透析后冷冻干燥即得具有ph响应的石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体。配制ph分别为5.8、6.5和7.4浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液，取30mg石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体，置于透析袋中，并将透析袋悬浮于50ml的磷酸盐缓冲溶液中恒温37℃磁力搅拌进行药物体外释放，药物释放累计进行42h，前20h每隔30min取一次样，20～42h每隔6h取一次样，每次取样是从溶液中取出3ml溶液，测定释放出的阿糖胞苷的量，同时补充3ml新鲜的磷酸盐缓冲溶液。阿糖胞苷的浓度使用紫外分光光度计在271nm处测定，根据测定的阿糖胞苷的量计算出不同时间的释药累积百分数。不同ph值条件下石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体的药物释放曲线如图7所示。在图中，前18个小时阿糖胞苷自石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体中的释放具有一个明显的突释现象，尤其是在ph为5.8和6.5的条件下此现象更为明显，这是由于在药物释放前期石墨烯量子点与阿糖胞苷之间的酰胺键的快速水解导致的，且酸性环境更有利于酰胺键的水解。石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体在ph为5.8、6.5和7.4条件下释放18小时的累积释药量分别为86.6％，43.8％和16.2％，随后药物的释放进入了一个平缓的阶段直至达到释放平衡，这是由于随着药物释放的进行，酰胺键逐渐水解完全导致的，最终在42h时药物释放就已达到平衡，石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体在ph为5.8、6.5和7.4条件下达到释放平衡时的累积释药量分别为90.8％，45.8％和18.3％。相较于对比例二制备的石墨烯量子点/阿糖胞苷药物前体在不同ph下进行的体外药物释放，实施例一制备的壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统在不同ph下进行的体外药物释放的药物释放速率有明显下降，且药物释放达到平衡的时间有明显延长(延长了30h)。说明壳聚糖/石墨烯量子点/阿糖胞苷药物缓释系统可以有效的抑制药物突释，具有良好的缓释性能。