木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制药新应用的制作方法

本发明属于医药领域，特别是涉及木犀草素-7-o-葡萄糖苷和/或木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷在制备预防和治疗年龄相关性眼睛黄斑变性药物中的应用。

背景技术：

年龄相关性眼睛黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,amd)，又称老年性黄斑变性，是常见的老年性疾病，其患病率随年龄增长而增高，是当前老年人致盲的重要疾病。氧化应激是早期老年眼睛黄斑变性发病机制主要原因之一，其发生部位在视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,rpe)中。rpe细胞氧化应激反应有两个来源：一方面，在rpe细胞正常的生理活动中，长期进行着吸收光、保护光感受器免受光损伤，大量的物质传递和新陈代谢导致rpe细胞的耗氧水平远高于正常细胞；另一方面，大量的长链多不饱和脂肪酸，长期受到光的照射使rpe细胞极易产生氧自由基。过量产生的氧自由基一旦超出rpe细胞本身的抗氧化能力，就会对rpe细胞的核酸、磷脂、蛋白质以及细胞器例如线粒体等造成不可修复的损伤，引起rpe细胞的凋亡。因此，rpe细胞极易被过量氧自由基损伤并导致amd的发生。

木犀草素-7-o-葡萄糖苷和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷是黄酮类化合物，存在于多种药用植物中。文献报道该类化合物可以有效缓解心肌细胞受到的氧化应激水平，并减少低密度脂蛋白氧化。对于年龄相关性眼睛黄斑变性的预防及治疗作用未见报道。

技术实现要素：

发明目的：针对上述现有技术，本申请提供了木犀草素-7-o-葡萄糖苷、木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷的新的制药用途。

技术方案：本发明公开了木犀草素-7-o-葡萄糖苷在制备预防和治疗年龄相关性眼睛黄斑变性药物中的应用。

本发明还公开了木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷在制备预防和治疗年龄相关性眼睛黄斑变性药物中的应用。

本发明还公开了木犀草素-7-o-葡萄糖苷联合木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷在制备预防和治疗年龄相关性眼睛黄斑变性药物中的应用。

上述药物以木犀草素-7-o-葡萄糖苷和/或木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷为活性成分，与药学上可接受的载体或者辅料制备而成。

所述药物剂型可以根据实际情况调节确定。

本申请所述木犀草素-7-o-葡萄糖苷，cas:5373-11，分子式：c21h20o11，结构式如下：

本申请所述木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷，cas:29741-10-4，分子式：c21h18o12，结构式如下：

有益效果：本申请通过对双氧水诱导损伤人视网膜色素上皮细胞arpe-19损伤的体外药效学实验，证实木犀草素-7-o-葡萄糖苷和/或木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷具有预防及治疗年龄相关性眼睛黄斑变性的功效，可用于制备预防和治疗年龄相关性眼睛黄斑变性药物，为年龄相关性眼睛黄斑变性提供了新的治疗思路，具有临床应用前景。

附图说明

图1木犀草素-7-o-葡萄糖苷(a)和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷(b)对双氧水诱导人视网膜色素上皮细胞arpe-19损伤的药效实验结果(n＝3)，^##p<0.01vs对照组，^**p<0.01vs模型组；

图2木犀草素-7-o-葡萄糖苷对双氧水诱导人视网膜色素上皮细胞arpe-19损伤氧化应激的药效实验结果(n＝3)，^##p<0.01，^###p<0.001vs对照组，^**p<0.01，^***p<0.001vs模型组；

图3木犀草素-7-o-葡萄糖苷抑制arpe-19细胞因氧化应激引起的细胞凋亡实验结果；

图4木犀草素-7-o-葡萄糖苷对arpe-19细胞p-akt通路的调节作用结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作出详细说明。

物质来源：

木犀草素-7-o-葡萄糖苷，中国药品生物制品检定所对照品。

木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷，中国药品生物制品检定所对照品。

arpe-19细胞，中国广州金诺生物科技有限公司。

rpmi-1640低糖型细胞培养液成分：2g/ld-葡萄糖，0.3g/ll-谷氨酰胺，2g/l碳酸氢钠。

实施例1

木犀草素-7-o-葡萄糖苷和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷对双氧水诱导损伤人视网膜色素上皮细胞arpe-19的保护实验

arpe-19细胞接种于含10％胎牛血清和1％双抗(青-链霉素)的rpmi-1640低糖型细胞培养液中，每3d更换培养基一次，待用。取指数生长期细胞，按1×10⁴/ml浓度，每孔加入100μl完全培养基，在co2培养箱中培养24h。然后，分别加入终浓度为25、50、100μm的木犀草素-7-o-葡萄糖苷(a)和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷(b)，以100μm的n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)为阳性对照，进行6h预处理，然后用250μmh2o2培养24h。用mtt测定细胞活力。细胞处理后，每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，在co2培养箱中培养4h。然后用150μl二甲基亚砜(dmso)小心地替换96孔板中的溶剂，振动使其溶解结晶。用酶标仪在490nm处测定arpe-19细胞的吸光度，计算细胞存活率。

结果如图1所示，木犀草素-7-o-葡萄糖苷(图1a)和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷(图1b)在25～100μm浓度范围下细胞存活率分别在72.5～90.3％、及72.4～88.6％之间。与双氧水模型组(62.2±0.4％)相比，不同浓度的木犀草素-7-o-葡萄糖苷(a)和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷(b)药物组均具有显著差异(p<0.01)，具有浓度依赖关系，其中木犀草素-7-o-葡萄糖苷、和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷药物组(100μm)的药效效果优于阳性药nac(100μm))。结果表明，木犀草素-7-o-葡萄糖苷、和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷具有预防及改善双氧水诱导arpe-19细胞损伤药效活性。

实施例2

木犀草素-7-o-葡萄糖苷对双氧水诱导人视网膜色素上皮细胞arpe-19氧化应激的保护实验

将arpe-19细胞(1×10⁶细胞/孔)接种于6孔板上，按实施例1步骤培养。用荧光探针2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(h2dcfda)测定细胞内ros生成，该探针可检测活细胞中ros水平。用无血清培养基稀释dcfh-da，最终浓度为10mm。收集arpe-19细胞，悬浮于稀释的dcfh-da中，在co2培养箱中培养30分钟。然后用无血清培养基洗涤细胞三次，从细胞上除去dcfh-da，然后转移到96孔板上，用酶标仪进行荧光检测，激发波长488nm，发射波长525nm。

细胞培养步骤同上，培养后收集arpe-19细胞至ep管中，细胞内过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod)活性和谷胱甘肽(gsh)、丙二醛(mda)水平的检测采用南京建成生物技术有限公司相关的试剂盒检测。

结果如图2所示，如图2a所示，经h2o2处理apre-19细胞的ros与对照组相比有显著增加，木犀草素-7-o-葡萄糖苷可有效减轻ros。同时我们检测了其他氧化应激的指标(cat、sod、mda、gsh)。图2b，2c表明，经h2o2处理后的apre-19细胞中cat和sod的活性均明显下降，木犀草素-7-o-葡萄糖苷可以有效恢复apre-19细胞中sod和cat的活性。同样的，经木犀草素-7-o-葡萄糖苷作用后的arpe-19细胞中mda和gsh的水平则相对单独h2o2处理的apre-19细胞中的mda和gsh水平有所下降(图2d，2e)。以上结果均具有显著差异(p<0.01，p<0.001)。研究结果表明，木犀草素-7-o-葡萄糖苷可通过降低双氧水诱导人视网膜色素上皮细胞arpe-19氧化应激水平，发挥预防及治疗年龄相关性眼睛黄斑变性的功效。

实施例3

木犀草素-7-o-葡萄糖苷对双氧水诱导人视网膜色素上皮细胞arpe-19损伤的药效作用机制研究

将arpe-19细胞(1×10⁶细胞/孔)置于60mm规格的培养皿中培养36h后进行细胞保护实验，设置木犀草素-7-o-葡萄糖苷的药物浓度为100μm。h加入上样缓冲液将各实验组总蛋白调至相同浓度，沸水浴5分钟。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(sds-page)分离各实验组中的总蛋白质(5％的浓缩胶和12％的分离胶)，将目标蛋白所在位置的凝胶按maker指示裁剪下来并转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜上(半干转移法)。转膜完成后，将pvdf膜放入含有5％脱脂奶粉的tbs-t缓冲液(tbs缓冲液+吐温20)中孵育1.5h以封闭膜上的非特异性蛋白，再用cleaved-caspase-3、bcl-2和bax蛋白的一级抗体(1：800体积稀释)4℃孵育过夜；用β-actin蛋白作为western-blot实验的内参蛋白。一抗孵育完，用tbs-t缓冲液充分将膜上未接上的一抗清洗干净，再用二级igg-hrp抗体(1:3000体积稀释)孵育1小时，重复清洗步骤。目标蛋白通过显影剂处理后在化学发光免疫分析仪中观察显影强度，并用image-j软件对不同蛋白的谱带进行灰度分析。

利用western-blot实验检测arpe-19细胞中akt/p-akt蛋白的表达。将arpe-19细胞(1×10⁶细胞/孔)置于60mm规格的培养皿中培养36h后进行细胞保护实验，设置木犀草素-7-o-葡萄糖苷的药物浓度为100μm。然后提取细胞中的总蛋白并检测蛋白浓度，加入上样缓冲液将各实验组总蛋白调至相同浓度，沸水浴5分钟。用sds-page电泳技术分离各实验组中的总蛋白质，将目标蛋白所在位置的凝胶按maker指示裁剪下来并转移到pvdf膜上。转膜完成后，将pvdf膜放入含有5％脱脂奶粉的tbs-t缓冲液中孵育1.5h以封闭膜上的非特异性蛋白，再用akt和p-akt蛋白的一级抗体(1：800体积稀释)4℃孵育过夜；用β-actin蛋白作为western-blot实验的内参蛋白。一抗孵育完，用tbs-t缓冲液充分将膜上未接上的一抗清洗干净，再用二级igg-hrp抗体(1:3000体积稀释)孵育1小时，重复清洗步骤。目标蛋白通过显影剂处理后在化学发光免疫分析仪中观察显影强度，并用image-j软件对不同蛋白的谱带进行灰度分析。

此外，用pi3k/akt抑制剂ly294002结合木犀草素-7-o-葡萄糖苷共同给药的实验进一步验证木犀草素-7-o-葡萄糖苷对arpe-19细胞的抗氧化机制。将arpe-19细胞(1×10⁴细胞/孔)置于96孔板上，每孔加入100μl1640培养液，在co2培养箱中培养24h。共同加入100μm木犀草素-7-o-葡萄糖苷和10μmly294002，进行6h预处理。设置h2o2的浓度为250μmol/l，取50μl加入到实验组和对照组中，空白对照组加入相应培养液，培养箱中培养24h。然后进行mtt毒性实验检测细胞活性。

细胞受到氧化应激总是伴随着线粒体凋亡模式的产生。采用westernblot检测细胞凋亡相关蛋白(cleaved-caspase-3，bcl-2，bax)的表达，研究木犀草素-7-o-葡萄糖苷对氧化应激诱导的arpe-19细胞凋亡的调控机制。如图3a所示，可以显著的看出模型组中bax和cleaved-caspase-3蛋白条带明显深于空白组，而bcl-2蛋白条带相比空白组颜色较浅。利用image-j软件检测的蛋白条带灰度结果如图3b、3c所示。在h2o2处理下，cleaved-caspase-3(凋亡执行蛋白)在arpe-19细胞中的表达显著增加(219±3.4％)，而在木犀草素-7-o-葡萄糖苷预处理后，其表达有效降低(123±3.9％)。bcl-2和bax蛋白被认为是凋亡过程开始的标志。实验结果表明，bcl-2和bax蛋白的比值在双氧水处理下表现出显著的降低(33.0±0.8％)，而用木犀草素-7-o-葡萄糖苷预处理可以阻止bcl-2表达的降低，同时抑制bax的升高(图3c)。阳性对照组nac在500μm浓度下同样表现出抑制细胞凋亡的效果，但是其抗凋亡能力明显低于木犀草素-7-o-葡萄糖苷。上述结果表明，木犀草素-7-o-葡萄糖苷可以通过下调cleaved-caspase-3表达、阻止bcl-2的表达、抑制bax的升高，实现对人视网膜色素上皮细胞arpe-19凋亡的保护作用。

akt通路在保护细胞免受氧化应激中起着重要作用。因此，我们在arpe-19细胞中检测了木犀草素-7-o-葡萄糖苷的抗氧化活性对akt通路的影响(图4)。westernblot的结果表明，各组细胞内akt总量没有显著变化，只有不同实验组细胞中磷酸化的akt发生变化，说明木犀草素-7-o-葡萄糖苷影响的是akt的磷酸化而不是蛋白表达量(图4a)。图4b通过p-akt/akt的比值进一步显示arpe-19细胞内akt蛋白的磷酸化水平。结果表明经双氧水处理的arpe-19细胞中akt的磷酸化水平基本没有变化，而木犀草素-7-o-葡萄糖苷显著增强了apre-19细胞的akt磷酸化(0.618±0.007vs0.866±0.01)。图4c表明，pi3k/akt抑制剂ly294002与木犀草素-7-o-葡萄糖苷共培养的实验组与单独木犀草素-7-o-葡萄糖苷预处理的实验组相比，细胞活性有明显的下降(83.5±1.5％vs61.8±0.9％)。说明木犀草素-7-o-葡萄糖苷可以p-akt通路调节arpe-19细胞抗氧化能力。

综上所述，木犀草素-7-o-葡萄糖苷和木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷具有对双氧水诱导人视网膜色素上皮细胞arpe-19损伤的保护作用，适用于预防及治疗年龄相关性眼睛黄斑变性的功效。

以上实施例是对本发明进行的具体阐述的范例，但本发明并不仅限制于以上实施例，任何对本发明的等同修改和替代也都在本发明所包含的范围之内。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所做的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范畴之内。