人工血管支架及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种人工血管支架及其制备方法和应用，属于医用植入材料领域。
背景技术：
：静电纺丝技术是组织工程中用于制备人工血管支架的常用方法，此方法制备的人工血管支架的比表面积大、孔隙率高，纳米纤维直径与体内许多细胞直径相当，能够诱导细胞黏附、增殖和分化，对于体外细胞培养、模拟细胞外基质具有特殊的优势。目前，利用静电纺丝技术制成的大直径人工血管支架已成功应用于较大血管的替换移植中，但由于对小直径血管(内径＜6mm)的生物相容性和抗凝血的要求远高于大直径人工血管，其应用仍不理想，主要原因表现在移植后的血栓形成、支架闭合、炎性反应等造成小直径血管的闭塞或狭窄。目前，体外血管内皮化的方法主要是通过将内皮细胞种植到人工血管支架的表面，待培养一段时间后再移植到体内。此方法虽简便易行，但由于种植细胞时易出现管壁细胞分布不均、管腔内外均是同一种细胞粘附，这就造成构建的人工血管内皮化程度低，且不能在结构和功能上模拟天然血管壁的三层结构。专利申请文件cn105999415a提供了一种跨尺度血管及其3d打印方法。该跨尺度血管自内至外依次包括：内衬层，以中空纤维形式螺旋卷绕而成的内管壁，以中空纤维形式螺旋卷绕而成的外管壁。该跨尺度血管利用含有平滑肌细跑的内层打印材料进行3d打印，以中空纤维形式螺旋卷绕形成内管壁；利用含有成纤维细胞的外层打印材料进行3d打印，以中空纤维形式螺旋卷绕在内管壁上形成外管壁；对内、外管壁进行固化处理，再利用含有血管内皮细胞的内衬材料在内管壁里面形成内衬层。该跨尺度血管的构建过程复杂，且机械强度较低，内衬细胞分布不均。专利文件cn109009561a提供一种人造血管及其制备方法。人造血管由血管支架和接种细胞构成，所述血管支架依次由紧密连接的内层支架、中间层支架和外层支架构成，所述内层支架是由聚丁二酸乙二醇酯和抗凝剂构成的一层多孔纤维圆管状结构；所述中间层支架是由水凝胶类材料、生物陶瓷材料、生长因子构成的一层多孔纤维圆管状结构，所述中间层支架的孔隙内粘附填充所述接种细胞；所述外层支架是由聚丁二酸丁二醇酯构成的一层多孔纤维圆管状结构。该人造血管的结构与真实血管的结构差异较大，且机械强度较低，中间层支架接种的细胞分布不均，并且构建的人造血管内皮化程度较低。技术实现要素：发明要解决的问题鉴于传统的体外种植内皮细胞来获得的人工血管支架的内皮化程度低且分布不均匀；所获得的人工血管支架的内外层均为同一种细胞，不能在解剖结构上模拟天然血管壁的三层结构等问题，本发明首先提供了一种人工血管支架。本发明的人工血管支架的内皮化程度高，分布均匀，且具有良好的机械性能，又有利于细胞的粘附和生长。进一步地，本发明还提供一种人工血管支架的制备方法，其原料易于获取，且制备方法简单易行。用于解决问题的方案[1]、一种人工血管支架，其包括：基体，其为通过空腔壁形成的具有空腔的柱形体，且所述空腔壁包括由纤维丝相互搭接形成的交错结构；水凝胶层，其形成于所述空腔壁的外表面；以及内皮细胞层，其存在于所述空腔壁的内表面；其中所述空腔壁的外表面为远离所述空腔的表面，所述空腔壁的内表面为形成所述空腔的表面。[2]、根据[1]所述的人工血管支架，其中，所述空腔壁具有多个孔结构，所述空腔壁的平均孔径为0.5～10μm，优选1～5μm；和/或孔隙率为50～99％，优选80～95％；和/或单根所述纤维丝的平均直径为100～1500nm，优选300～900nm。[3]、根据[1]或[2]所述的人工血管支架，其中，所述纤维丝的材料源自于高分子聚合物或其衍生物中的一种或两种以上的组合，优选包括合成高分子聚合物和天然高分子聚合物；更优选地，所述合成高分子聚合物与天然高分子聚合物的质量比为1:1～4:1。[4]、根据[1]-[3]任一项所述的人工血管支架，其中，所述水凝胶层的材料源自于可降解的天然高分子聚合物，优选包括明胶、海藻酸钠、透明质酸、丝素蛋白中一种或两种以上的组合。[5]、根据[1]-[4]任一项所述的人工血管支架，其中，所述空腔壁的壁厚为0.1～0.2mm；和/或所述水凝胶层的厚度为0.1～0.3mm；和/或内皮细胞层的厚度为1～80μm。[6]、根据[1]-[5]任一项所述的人工血管支架，其中，所述水凝胶层的表面经交联处理，优选利用含钙离子的溶液进行所述交联处理；和/或，所述水凝胶层还包含有成纤维细胞。[7]、根据[1]-[6]任一项所述的人工血管支架，其中，所述人工血管支架的内径为小于6mm。[8]、一种根据[1]-[7]任一项所述的人工血管支架的制备方法，其包括将基体、水凝胶层以及内皮细胞层复合成型的步骤。[9]、根据[8]所述的人工血管支架的制备方法，包括以下步骤：基体制备步骤：配制纺丝溶液，利用静电纺丝技术获得基体；成型步骤：配制水凝胶溶液和内皮细胞悬液，利用生物打印技术使所述空腔壁的内表面形成内皮细胞层，所述空腔壁的外表面形成水凝胶层，获得成型体。[10]、根据[9]所述的人工血管支架的制备方法，其中，所述纺丝溶液中，高分子聚合物或其衍生物的质量体积比为75～150mg/ml；优选地，合成高分子聚合物的质量体积比为50～100mg/ml；天然高分子聚合物的质量体积比为25～50mg/ml。[11]、根据[9]或[10]所述的人工血管支架的制备方法，其中，所述水凝胶溶液中，可降解的天然高分子聚合物的质量体积比为5～20mg/ml。[12]、根据[9]-[11]任一项所述的人工血管支架的制备方法，其中，所述水凝胶溶液中还包含有成纤维细胞，所述成纤维细胞的含量为1×106个/ml～5×106个/ml；和/或，所述内皮细胞悬液中，内皮细胞含量为0.5×107个/ml～1×107个/ml。[13]、根据[9]-[12]任一项所述的人工血管支架的制备方法，其中，所述生物打印技术为同轴打印技术，使得在所述空腔壁的内表面形成所述内皮细胞层的同时，在所述空腔壁的外表面形成所述水凝胶层。[14]、根据[9]-[13]任一项所述的人工血管支架的制备方法，其中，所述制备方法还包括：将所述成型体置于含钙离子的溶液中进行交联的步骤，所述交联的时间为1～3分钟；其中，所述含钙离子的溶液优选为氯化钙溶液；更优选地，所述氯化钙溶液中，所述氯化钙的质量体积比为10～30mg/ml。[15]、根据[9]-[14]任一项所述的人工血管支架的制备方法，其中，所述制备方法还包括：将所述成型体置于含血清的培养基中进行培养的步骤。[16]、一种根据[1]-[7]任一项所述的人工血管支架或者[8]-[15]任一项所述的人工血管支架的制备方法制备得到的人工血管支架在血管修复制品中的应用。发明的效果本发明的人工血管支架的内皮化程度高，分布均匀，且具有良好的机械性能，又有利于细胞的粘附和生长。进一步地，本发明的人工血管支架的制备方法，其原料易于获取，且制备方法简单易行，且能够大批量生产。附图说明图1示出了本发明实施例1的人工血管支架的结构示意图；图2示出了本发明的同轴打印装置的照片(左)及结构示意图(右)；图3中的1示出了本发明的同轴打印装置的外壳的照片；图3中的2示出了本发明的同轴打印装置的内芯的照片；图4示出了本发明实施例1的成型体的内皮细胞层的染色图；图5示出了本发明实施例1的人工血管支架的内皮细胞层的染色图；图6示出了对比例的人工血管支架的内皮细胞层的染色图；图7示出了本发明的实施例1的聚乳酸/明胶复合纳米纤维基体的照片；图8示出了本发明的实施例1的聚乳酸/明胶复合纳米纤维基体扫描电镜图；图9示出了本发明的实施例1的人工血管支架外表面的水凝胶层扫描电镜图。具体实施方式以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。如无特殊声明，本发明所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。本文所述“质量体积比”，又称“质量浓度”，其含义是溶质的质量与所形成的溶液的体积之比。第一实施方式本发明的第一实施方式提供了一种人工血管支架，其包括：基体，其为通过空腔壁形成的具有空腔的柱形体，且所述空腔壁包括由纤维丝相互搭接形成的交错结构；水凝胶层，其形成于所述空腔壁的外表面；以及内皮细胞层，其存在于所述空腔壁的内表面；其中所述空腔壁的外表面为远离所述空腔的表面，所述空腔壁的内表面为形成所述空腔的表面。所述人工血管支架的内径为小于6mm，拉伸强度为1～10mpa，优选2～8mpa；例如：3～7mpa、4～6mpa、5mpa等，缝合强度为0.5～8mpa，优选1～5mpa，例如：1.5～4.5mpa、2～4mpa、2.5～3.5mpa、3mpa等。本发明的人工血管支架可以最大程度的模拟真实血管壁的三层结构并促进人工血管支架管腔的内皮化程度，从而提高人工血管移植后的生物相容性和抗凝血性。具体而言：<基体>本发明的基体为通过空腔壁形成的具有空腔的柱形体，且所述空腔壁包括由纤维丝相互搭接形成的交错结构。本发明的空腔壁可以由纤维丝交织而成。本发明使用基体代替平滑肌细胞，作为血管支撑来支撑内外层细胞。通过使用基体，既保持了良好的机械性能，又有利于细胞的粘附和生长。本发明的纤维丝的材料可以是本领域中各种常用纤维原料。如可以选自合成高分子纤维、天然高分子纤维、无机纤维中的一种纤维或一种以上的混合纤维。本发明的纤维丝的原料可以选自高分子聚合物或其衍生物中的一种或两种以上的组合，可以包括合成高分子聚合物和/或天然高分子聚合物。在发明中，合成高分子聚合物可以是聚丙烯腈、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸、聚酰亚胺、聚乙烯醇等。天然高分子聚合物包括：明胶、海藻酸钠、壳聚糖、丝素蛋白等。本发明以上的纤维具有良好的降解性或者生物相容性，当作为人体组织修复支架，尤其是人工血管支架时，能够较好的促进人体组织的愈合或修复，同时也不会有产生不良作用的担忧。作为优选，本发明的纤维丝的原料包括合成高分子聚合物和天然高分子聚合物。通过使用两种原料的组合，可以进一步使纤维丝具有优异的机械性能，并且又有利于细胞的粘附和生长。更优选地，使用聚乳酸与明胶的组合作为制备纤维丝的原料。进一步，所述合成高分子聚合物与天然高分子聚合物的质量比为1:1～4:1。本发明中通过将上述纤维的原料经静电纺丝以得到连续纤维。静电纺丝的原理是在静电纺丝过程中，对聚合物液体施加高电压，使电荷引入液体。当液体中的电荷聚集到一定量的时候，液体会在喷头形成泰勒锥，在外加电场力的作用下克服表面张力形成液体射流，然后射流在静电斥力、库伦力(coulomb)和表面张力的共同作用下，聚合物射流沿不规则螺旋状轨迹运动。射流在极短时间内被牵引拉伸，随着溶剂挥发或者热量散失，聚合物射流固化形成微米/纳米纤维。静电纺丝过程中，很多参数会对最终静电纺丝纤维产生影响，通过控制过程参数，可以制备获得不同尺寸、形态和不同结构的微米/纳米纤维。本发明中，只要能够满足制成纤维直径的要求，就对于静电纺丝的方式没有特别的要求，可以是本领域中常用的静电纺丝方式，具体而言，本发明中将反应原料或高分子材料溶于合适的溶剂中，制备成一定浓度的溶液。采用静电纺丝技术将原料溶液纺制成纤维聚集体，并且可以直接形成具有空腔的柱形体。在本发明中，所述空腔壁具有多个孔结构，所述空腔壁的平均孔径为0.5～10μm，例如：2～8μm，3～7μm，4～6μm等，优选1～5μm；和/或孔隙率为50～99％，例如：55～90％，60～85％，65～80％，70～75％等，优选80～95％；和/或单根所述纤维丝的平均直径为100～1500nm，例如：150～1400nm，200～1200nm，250～1100nm等，优选300～900nm。优选地，所述空腔壁的壁厚为0.1～0.2mm。<水凝胶层>本发明的水凝胶层(如图9所示)均匀的分布于所述空腔壁的外表面。作为优选，本发明的水凝胶层的材料可以源自于对细胞无毒、可降解、组织相容性良好的天然高分子聚合物，本发明的水凝胶层的天然高分子聚合物与基体中纤维丝的天然高分子聚合物可以相同，也可以不同。优选地，水凝胶层的材料可以包括明胶、海藻酸钠、透明质酸、丝素蛋白等一种或两种以上的组合，优选为海藻酸钠。在本发明中，可以对水凝胶层的表面进行交联处理。作为优选，可以用含钙离子的溶液进行交联处理。例如：利用氯化钙溶液进行交联处理。通过交联处理可以增强水凝胶的机械强度，促使交联后的水凝胶层包裹基体的外表面，这样不仅可以得到与真实血管壁相仿的解剖学结构，还可以提高管腔内部的内皮细胞浓度。在本发明中，所述水凝胶层的厚度为0.1～0.3mm。本文中所述的“交联”与“交联改性”具有相同或相似的含义，在“交联”的过程中，可以附带有“改性”的一些特点，本发明中为了简便，可以使用“交联”代替“交联改性”。在本发明中，所述水凝胶层还包含有成纤维细胞，在含有成纤维细胞时，会使得本发明的水凝胶层的表面具有一些凸起结构(如图9所示)。本发明添加成纤维细胞可以使本发明的人工血管支架更好的模拟血管壁的结构。<内皮细胞层>本发明的内皮细胞层存在于所述空腔壁的内表面。本发明的内皮细胞层中的内皮细胞可以均匀分布于空腔壁的内表面，从而可以提高人工血管支架内部的内皮化程度。本发明的人工血管支架的基体可以被水凝胶完全包裹，空腔壁的内表面的内皮细胞的浓度较高，可以获得高效的内皮化率，从而有利于减少体内移植后管腔的血栓形成及闭塞，可以提高人工小直径血管支架移植后的长期通畅率。本发明的人工血管支架与真实血管壁具有相仿的解剖学结构。另外，本发明的人工血管支架的生物相容性好，机械强度优异。在本发明中，内皮细胞层的厚度为1～80μm，优选5～50μm，更优选10～30μm。第二实施方式本发明的第二实施方式提供了一种第一实施方式的人工血管支架的制备方法，包括将基体、水凝胶层以及内皮细胞层复合成型的步骤。具体地，本发明的人工血管支架的制备方法，包括以下步骤：基体制备步骤：配制纺丝溶液，利用静电纺丝技术获得基体；成型步骤：分别配制内皮细胞悬液和水凝胶溶液，利用生物打印技术使所述空腔壁的内表面形成内皮细胞层，所述空腔壁的外表面形成水凝胶层，获得成型体。<基体制备步骤>预先准备用于形成纤维的原料，如将第一实施方式中的纤维丝的原料溶于合适的溶剂中，制备成一定浓度的纺丝溶液。所述纺丝溶液优选可以在剪切力的作用下形成，如可以使用常规的搅拌设备，更典型地如使用磁力搅拌设备。对于形成纺丝溶液的溶剂种类的具体浓度没有特别的限定，只要是能够满足后续静电纺丝工艺的要求即可。举例而言，形成纺丝溶液的溶剂可以是有机溶剂，例如可以是六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、丙酮中的一种或几种的混合溶剂，优选六氟异丙醇。采用静电纺丝技术将纺丝溶液纺制成为纤维聚集体。静电纺丝过程中可以通过调节纺丝参数(如进料速率、施加电压和接收距离等)、溶液参数(粘度和表面张力等)、接收工具和纺丝环境等制备所需的纤维或纤维聚集体。在本发明中，所述静电纺丝工艺参数可以为：电压为10～20kv，电场接收距离为15～20cm，纺丝速度为2～6ml/h。在所述纺丝溶液中，高分子聚合物或其衍生物的质量体积比为75～150mg/ml；优选地，合成高分子聚合物的质量体积比为50～100mg/ml；天然高分子聚合物的质量体积比为25～50mg/ml。通过使用合成高分子聚合物和天然高分子聚合物的组合，可以进一步提高空腔壁的强度。<成型步骤>配制水凝胶溶液，所述水凝胶溶液中，制备水凝胶的材料的质量体积比为5～20mg/ml，优选地，制备水凝胶的材料为可降解的天然高分子聚合物。在本发明中，制备水凝胶溶液的溶剂可以是水，例如：去离子水、超纯水、双蒸水、蒸馏水、纯净水等。进一步，在配制水凝胶溶液时，可以添加成纤维细胞。具体地，将收集的成纤维细胞混匀于水凝胶溶液中，得到细胞浓度为1×106个/ml～5×106个/ml的水凝胶溶液。配制内皮细胞悬液，血管内皮细胞可以使用dmem高糖培养基重悬，得到细胞浓度为0.5×106个/ml～1×107/ml的内皮细胞悬液。利用生物打印技术，使所述空腔壁的内表面形成内皮细胞层，所述空腔壁的外表面形成水凝胶层，获得成型体。本发明的内皮细胞可以均匀分布于空腔壁的内表面；水凝胶中的成纤维细胞可以均匀分布于空胶壁的外表面。在本发明中，所述生物打印技术优选为同轴打印技术，使得在所述空腔壁的内表面形成所述内皮细胞层的同时，在所述空腔壁的外表面形成所述水凝胶层。从而可以同步构建人工血管支架的水凝胶层和内皮细胞层，可以最大程度的模拟了天然血管壁的三层解剖结构。本发明的同轴打印技术是利用同轴打印装置(图2)实现的。同轴打印装置由外壳和内芯两部分组成(图3)，外壳的直径为1.0～6.5mm，内芯的直径为0.5～5.8mm，实际使用的外壳和内芯的直径随嵌入的基体的直径可以进行选择调整。具体地，在进行打印时，在外壳中加入壳液，在内芯中加入芯液。其中，壳液为水凝胶溶液，芯液为内皮细胞悬液。将基体嵌入同轴打印装置的外壳和内芯之间，外接微量注射泵，将内芯缓慢旋入外壳，进行打印，以获得本发明的成型体。另外，在本发明中，壳液的流速是5～10ml/h，芯液的流速是3～7ml/h。进一步，同轴打印结束后，将成型体置于含钙离子的溶液(例如：含钙离子的水溶液)中进行交联的步骤，所述交联的时间可以为1～3分钟。其中，所述含钙离子的溶液优选为氯化钙溶液(例如：氯化钙水溶液)；更优选地，所述氯化钙溶液中，所述氯化钙的质量体积比为10～30mg/ml。在本发明中，所述制备方法还可以包括：将所述成型体置于含血清的培养基中进行培养的步骤。作为优选，所述培养基可以是dmem高糖培养基，其中，以所述dmem高糖培养基的总质量计，血清的含量为5～20％，优选8～15％。经培养基培养一段时间后可以实现内皮细胞完全覆盖空腔壁的内表面。具体地，交联结束后，将成型体放入装有dmem高糖培养基的离心管中，置于摇床1～3小时，其中，摇床转速可以是15～20转/分钟。第三实施方式本发明的第三实施方式提供了一种根据本发明第一实施方式的人工血管支架和根据本发明第二实施方式的人工血管支架的制备方法得到的人工血管支架，在血管修复制品中的应用。实施例下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1将0.75g聚乳酸和0.25g明胶分别加入到六氟异丙醇溶液中，并定容到10ml。常温搅拌直至溶解，制成纺丝溶液；将纺丝溶液加入注射器中，注射器前端加上延长管并连接规格为20g的针头，针头垂直于直接为1mm的圆形接收杆，设置注射泵的速度(即纺丝速度)为5ml/h，待有纺丝溶液从针头喷出时，在针头上施加15kv的电压，电场接收距离为15cm，此时喷出的纳米纤维被接收杆收集，待收集合适的厚度后，以无水乙醇浸润接收杆，完整取出内径为1mm的具有空腔的聚乳酸/明胶复合纳米纤维基体，辐照灭菌后备用，其中，基体的空腔壁的壁厚为0.2mm。将0.2g无菌海藻酸钠溶于超纯水中，并定容到10ml，得到质量体积比为20mg/ml海藻酸钠溶液。体外培养人脑微血管内皮细胞和人成纤维细胞，待每种细胞处于对数生长期时，将收集的人成纤维细胞混匀于海藻酸钠溶液，得到细胞含量为2×106个/ml的水凝胶溶液，即壳液。将人脑微血管内皮细胞以含量为1×107个/ml的培养基重悬，得到内皮细胞悬液，即芯液。将基体嵌入同轴打印装置的外壳和内芯之间，外接微量注射泵，进行同轴打印。其中壳液的流速是10ml/h，芯液的流速是5ml/h，获得含有水凝胶层和内皮细胞层的成型体，其中，水凝胶层的厚度为0.3mm，内皮细胞层的厚度为25μm。同轴打印结束后，将成型体浸入质量体积比为30mg/ml的无菌氯化钙溶液中3分钟以交联成型体表面的海藻酸钠。交联结束后，将静电纺丝人工血管支架放入装有dmem高糖培养基(其中，以dmem高糖培养基的总质量计，血清含量为10％)的15ml离心管，置于摇床2小时(摇床转速为15转/分钟)，得到人工血管支架。实施例2将0.8g聚乳酸加入到六氟异丙醇溶液中，并定容到10ml。常温搅拌直至溶解，制成纺丝溶液；将纺丝溶液加入注射器中，注射器前端加上延长管并连接规格为20g的针头，针头垂直于直接为2mm的圆形接收杆，设置注射泵的速度(即纺丝速度)为6ml/h，待有纺丝溶液从针头喷出时，在针头上施加15kv的电压，电场接收距离为17cm，此时喷出的纳米纤维被接收杆收集，待收集合适的厚度后，以无水乙醇浸润接收杆，完整取出内径为2mm的具有空腔的聚乳酸纳米纤维基体，辐照灭菌后备用，其中，基体的空腔壁的壁厚为0.17mm。将0.15g无菌海藻酸钠溶于超纯水得到，并定容到10ml，质量体积比15mg/ml的海藻酸钠溶液。体外培养人脑微血管内皮细胞和人成纤维细胞，待每种细胞处于对数生长期时，将收集的人成纤维细胞混匀于海藻酸钠溶液，得到细胞含量为4×106个/ml的水凝胶溶液，即壳液。将人脑微血管内皮细胞以含量为5×106个/ml的培养基重悬，得到内皮细胞悬液，即芯液。将基体嵌入同轴打印装置的外壳和内芯之间，外接微量注射泵，进行同轴打印。其中壳液的流速是7ml/h，芯液的流速是4ml/h，获得含有水凝胶层和内皮细胞层的成型体，其中，水凝胶层的厚度为0.25mm，内皮细胞层的厚度为17μm。同轴打印结束后，将成型体浸入质量体积比为20mg/ml的无菌氯化钙溶液中3分钟以交联成型体表面的海藻酸钠。交联结束后，将静电纺丝人工血管支架放入装有dmem高糖培养基(其中，以dmem高糖培养基的总质量计，血清含量为10％)的15ml离心管，置于摇床2小时(摇床转速为15转/分钟)，得到人工血管支架。实施例3将0.75g聚己内酯和0.25g海藻酸钠分别加入到二氯甲烷溶液中，并定容到10ml。常温搅拌直至溶解，制成纺丝溶液；将纺丝溶液加入注射器中，注射器前端加上延长管并连接规格为20g的针头，针头垂直于直接为1mm的圆形接收杆，设置注射泵的速度(即纺丝速度)为5ml/h，待有纺丝溶液从针头喷出时，在针头上施加15kv的电压，电场接收距离为20cm，此时喷出的纳米纤维被接收杆收集，待收集合适的厚度后，以无水乙醇浸润接收杆，完整取出内径为1mm的具有空腔的聚己内酯/海藻酸钠复合纳米纤维基体，辐照灭菌后备用，其中，基体的空腔壁的壁厚为0.15mm。将0.2g无菌海藻酸钠溶于超纯水中，定容到10ml，得到质量体积比20mg/ml海藻酸钠溶液。体外培养人脑微血管内皮细胞和人成纤维细胞，待每种细胞处于对数生长期时，将收集的人成纤维细胞混匀于海藻酸钠溶液，得到细胞含量为2×106个/ml的水凝胶溶液，即壳液。将人脑微血管内皮细胞以含量为1×107个/ml培养基重悬，得到内皮细胞悬液，即芯液。将基体嵌入同轴打印装置的外壳和内芯之间，外接微量注射泵，进行同轴打印。其中壳液的流速是10ml/h，芯液的流速是5ml/h，获得含有水凝胶层和内皮细胞层的成型体，其中，水凝胶层的厚度为0.28mm，内皮细胞层的厚度为21μm。同轴打印结束后，将成型体浸入质量体积比25mg/ml的无菌氯化钙溶液中3分钟以交联成型体表面的海藻酸钠。交联结束后，将静电纺丝人工血管支架放入装有dmem高糖培养基(其中，以dmem高糖培养基的总质量计，血清含量为10％)的15ml离心管，置于摇床2小时(摇床转速为15转/分钟)，得到人工血管支架。对比例将0.75g聚己内酯和0.25g明胶分别加入到二氯甲烷溶液中，定容到10ml。常温搅拌直至溶解，制成纺丝溶液；将纺丝溶液加入注射器中，注射器前端加上延长管并连接规格为20g的针头，针头垂直于直接为1mm的圆形接收杆，设置注射泵的速度(即纺丝速度)为5ml/h，待有纺丝溶液从针头喷出时，在针头上施加15kv的电压，电场接收距离为15cm，此时喷出的纳米纤维被接收杆收集，待收集合适的厚度后，以无水乙醇浸润接收杆，完整取出内径为2mm的具有空腔的聚己内酯/明胶复合纳米纤维基体，辐照灭菌后备用，其中，基体的空腔壁的壁厚为0.15mm。体外培养人脑微血管内皮细胞，待细胞处于对数生长期时，将人脑微血管内皮细胞以含量为1×107个/ml的dmem高糖培养基+10％血清培养基重悬，得到内皮细胞悬液，将静电纺丝人工血管支架放入装有内皮细胞悬液的15ml离心管，置于摇床2小时(摇床转速为15转/分钟)，得到传统种植内皮细胞人工血管支架。性能测试1.拉伸强度测试将内径为2mm，厚度是0.1mm的样品裁剪成长度为1cm的试样，将试样的两端分别装夹在拉伸机的上、下夹头上，试样的长轴方向应与上、下夹具的中心连线重合。以200mm/min的拉伸速度进行试验，记录试样剪切破坏的最大负荷，结果如下表1所示。表1实施例拉伸强度(mpa)实施例13.08实施例24.41实施例34.60由表1可以看出，本申请的人工血管支架的拉伸强度优异，适合作为血管修复制品。2.缝合强度测试将内径为2mm，厚度是0.1mm的样品裁剪成长度为1cm的试样，用4-0号缝合线从距离支架边缘1cm处穿过，缝合成一半环，以200mm/min的拉伸速度将缝合线从支架中拉出，记录缝合线从支架中拉出或者是支架损坏时的拉力大小，结果如下表2所示。表2实施例缝合强度(mpa)实施例11.89实施例22.63实施例31.85由表1可以看出，本申请的人工血管支架的缝合强度优异，适合作为血管修复制品。3.基体表明形貌表征使用扫描电镜观察基体的表面形貌并拍照，基于各个纤维样本的sem图像，采用imagej图像分析软件来测量纤维的平均直径。采用pmi孔径测试仪(泡点法)来检测基体的孔径大小。通过浸渍法来测定基体的孔隙率。表34.内皮细胞染色实验将实施例1的成型体、实施例1的人工血管支架以及对比例的人工血管支架剪开，暴露出内壁的内皮细胞层，用磷酸盐缓冲液清洗上述三个支架三遍，加入dpai染液(4'6-二脒基-2-苯基吲哚)，室温避光孵育10min，再以磷酸盐缓冲液清洗一遍，荧光显微镜下观察并拍照，结果如图4-6所示。其中，图4示出了本发明实施例1的成型体的内皮细胞层的染色图；图5示出了本发明实施例1的人工血管支架的内皮细胞层的染色图。图6示出了对比例的人工血管支架的内皮细胞层的染色图。由图4-6可以看出，本发明的人工血管支架的内皮细胞层中的内皮细胞可以均匀分布于空腔壁的内表面，从而可以提高人工血管支架内部的内皮化程度。本发明的成型体内皮细胞层中的内皮细胞由于未进行细胞培养，因此内皮细胞略少。而对比例的人工血管支架中内皮细胞非常少，内皮化程度低且分布不均匀。5.内皮细胞层中的内皮细胞密度基于人工血管支架内壁内皮细胞层的细胞核染色图像，选择200倍视野下内皮细胞分布最密集的区域拍照，采用imagej图像分析软件来计算内皮细胞个数。内皮细胞密度＝内皮细胞个数/200倍视野下实际视场面积(0.74mm2)，结果如下表5所示。表5实施例内皮细胞密度(个/mm2)实施例1503实施例2429实施例3574对比例103由表5可以看出，本申请实施例1-3的人工血管支架内壁内皮细胞层中的内皮细胞个数远大于对比例，因此，本申请的人工血管支架的内皮化程度更高。以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12