裸花紫珠提取物在制备降脂药物中的应用的制作方法

本发明属于天然药物领域，具体涉及裸花紫珠提取物在制备降脂药物中的应用。

背景技术：

肥胖是机体能量代谢紊乱的表现，是导致ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、老年痴呆、甚至肿瘤等一系列疾病的主要风险因子，严重威胁全人类的健康。据世界卫生组织估计，目前有超过10亿人口体重超标(体重指数bmi>25)，典型肥胖症患者的人数超过3亿(bmi>30)；在美国，超过三分之二的成年人正在经历超重或者肥胖；在中国，高脂、高糖和高蛋白为代表的高热能膳食饮食结构，快节奏的工作和久坐不动，肥胖人群逐渐庞大，据2018年统计肥胖人数列全球第一。

其中脂肪一直被认为是导致肥胖的“罪魁祸首”：由体内脂肪细胞体积、数量增加，引起脂肪在局部过多的沉淀，从而致使体脂占体重的百分比异常增高，常见病理特征主要包括血糖升高、血脂异常、抗氧化能力降低以及炎症因子的浸润等。因此可见，脂肪在不同的肥胖相关代谢疾病中也扮演了重要的角色。

但对于不同类型的脂肪不能一概而论，有一类不但不会导致肥胖，相反还具有减肥的功效。所有哺乳动物(人类、小鼠等)体内一般均具有两种功能截然不同的脂肪：白色脂肪组织(whiteadiposetissue，wat)和棕色脂肪组织(brownadiposetissue，bat)。

wat以甘油三酯(tg)的形式储存能量，肥胖症及相关疾病与它们的超载有关，并且根据它们在体内的位置对健康产生不同的负面影响。bat中含有大量的线粒体，是一种天然耗能型脂肪，不仅可以在外界刺激下可以燃烧产生热量，而且也负责分解引发肥胖的白色脂肪，将后者转化成二氧化碳、水和热量。不过bat仅在人类幼年时期发挥作用(在儿童中作为“婴儿脂肪”普遍存在)，随着年龄增长，棕色脂肪活性逐渐降低，最终人体内只残存一些棕色脂肪细胞。研究表明，在寒冷刺激或β肾上腺激素受体激动剂处理后，小鼠皮下白色脂肪组织中会出现散在的棕色样脂肪细胞，称之为“米色脂肪”(beigeadipose)——介于两种常见脂肪之间，功能上接近棕色脂肪，可以嵌入白色脂肪组织，通过产热将化学能转化为热能耗散。对于人体而言，棕色类脂肪组织就是“天生减肥专家”可以应对肥胖及其相关代谢疾病，在维持体温和能量平衡中起着重要的作用。越来越多的数据表明，促进白色脂肪细胞的褐化，形成棕色脂肪组织并激活其功能，可以提高机体的能量代谢，起到有效消除多余脂肪的作用。因此，通过能量消耗(释放、转移)将是实现控制肥胖最有效的途径之一。

对于一般人群饮食控制和加强锻炼可作为减重的首选，但是具有肥胖遗传体质、体重超标增加了患病风险、或已发生代谢性疾病的人群，则迫切需要找到一种高效安全的减肥方法，通过干预与治疗肥胖症来避免其他代谢性疾病的发生。中药因其悠久的历史传承和安全有效的临床数据，以其多组分和多靶向的协同作用在体内发挥药效的特点，广泛被应用于肥胖及胰岛素抵抗、ⅱ-型糖尿病和非酒精性脂肪肝等相关并发症的预防和治疗，如黄连上清汤、升降散、四君子汤和清肠汤等。

裸花紫珠callicarpanudiflorahook.exarn.是马鞭草科紫珠属植物，以干燥叶入药，主要分布于我国的广东、海南和广西等省，并以海南五指山产为上品。始载于唐《本草拾遗》，入选《中国药典》2015年版新增中药品种。其味苦、微辛、性平；全年均可采收，根茎叶均可入药，有止血消炎、散瘀消肿、抗菌解毒等功效。作为为临床常备药物，裸花紫珠以单味药成药，剂型有胶囊、片剂、散剂和冲剂(口服为主)，尤其适用于止血恢复和炎症消退。通过急性毒性实验测试，在合理剂量浓度范围内安全无毒。综合文献报道，从裸花紫珠中发现的化学成分以黄酮类、苯丙素、环烯醚萜及三萜类为主；裸药理活性主要有止血、抗炎、抑菌、提高免疫、抗肿瘤等作用；整体而言裸花紫珠粗提物活性较单体化合物明显，研究范围更广，但尚未见有关其降脂减肥及改善其相关代谢疾病(高脂血症、非酒精性脂肪肝和胰岛素抵抗等)方面的报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供裸花紫珠在制备降脂药物、改善肝功能、降低肝损伤或抑制炎症的药物中的应用。

优选，所述的裸花紫珠是以裸花紫珠提取物的形式。

进一步优选，所述的裸花紫珠提取物是通过以下方法制备的：取干燥的裸花紫珠叶，使用甲醇或乙醇或其水溶液浸提，提取液去除不溶物后，冷冻干燥，得到裸花紫珠提取物。可以是，所述的提取液去除不溶物是将提取液冷却后，将提取液冷冻离心，静置，取上清液过微孔滤膜，将滤液冷冻干燥，得到裸花紫珠提取物。

具体的，所述的裸花紫珠提取物是通过以下方法制备的：取新鲜干燥的裸花紫珠叶，自然风干，粉碎过80目筛，按料液比2g/30ml，将裸花紫珠叶粉末和甲醇混合，于40℃超声浸提30min，用冰水冷却后，摇匀取提取液1.5ml，于10℃，12000rpm冷冻离心10min，静置1～2min，取上清液500μl过0.22μm微孔滤膜，将滤液冷冻干燥，得到裸花紫珠提取物。

所述的降脂药物是预防高脂饮食引起的肥胖症的药物。

本发明的第二个目的是提供一种降脂药物、改善肝功能、降低肝损伤或抑制炎症的药物，其特征在于，含有有效量的裸花紫珠为活性成分，以及药学上可接受的辅料。

所述的药物的剂型为散剂、胶囊、颗粒剂或片剂。

与现有技术相比，本发明的创新性和有益效果在于：

本发明证实，裸花紫珠(lhzz)lhzz可能是通过促进脂肪细胞中的脂肪酸氧化，提高脂肪细胞的能量代谢，从而发挥减少细胞内脂肪含量的作用lhzz可增强小鼠对葡萄糖的耐受性，改善小鼠对胰岛素的敏感性，显著增强小鼠对葡萄糖的代谢能力，lhzz可预防高脂饮食引起的肥胖症。lhzz通过促进小鼠iwat中脂肪分解基因hsl、mgll的表达，减少脂肪细胞大小，通过促进脂肪酸氧化基因、产热基因、氧化磷酸化基因的表达，促进wat的能量消耗，促进wat的褐变lhzz通过促进小鼠bat中脂肪分解基因hsl、mgll的表达，减少脂肪细胞大小，lhzz可促进bat中脂肪酸氧化基因、产热基因、氧化磷酸化基因的表达，恢复bat功能。lhzz可降低小鼠血清中tg、alt、ast、il-1、il-6、tnf-α的水平，具有降脂、改善肝功能、降低肝损伤，抑制炎症的效果，并通过降低脂肪生成因子srebp-1c、fas、acc的表达，抑制肝脏中脂肪酸的生物合成，lhzz通过降低脂肪生成因子的表达以及改善抗氧化和抗炎症状来预防高脂饮食条件诱导的代谢损伤。由此可见，裸花紫珠提取物无论在体外试验，还是小鼠在体试验均具有明显的降脂减肥效果，可应用于制备降脂药物，改善肥胖相关代谢疾病(高脂血症、非酒精性脂肪肝和胰岛素抵抗等)症状，具有良好的应用前景，且毒性小，安全性高，没有细胞毒性作用。

附图说明

图1是lhzz作用于脂肪细胞产生的降脂效果。(a)为cck-8法进行lhzz细胞毒活性测定结果，(b)为油红o染色进行3t3l1脂肪细胞脂含量测定结果，(c)为脂肪细胞中代谢相关基因表达情况检测结果。

图2是lhzz对高脂饮食引起小鼠肥胖症的预防效果。(a)为高脂饮食对照组(hfdcon)、高脂饮食lhzz治疗组(hfdlhzz)、正常饮食对照组(cwcon)、正常饮食lhzz治疗组(cwlhzz)小鼠8周的体重变化记录。(b、d)为hfdcon、hfdlhzz、cwcon、cwlhzz小鼠的葡萄糖耐量测试(gtt)结果。(c、e)为hfdcon、hfdlhzz、cwcon、cwlhzz小鼠的胰岛素耐量测试(itt)结果。

图3是lhzz对小鼠白色脂肪组织(wat)的影响。(a)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的腹股沟白色组织(iwat)占体重比。(b)为苏木精-伊红(he)染色观察各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的iwat中脂肪细胞大小(比例尺：100μm)。(c、d)为westernblot检测各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的皮下脂肪与能量代谢相关蛋白ampk、pgc-1α和磷酸化lipe(p-lipe)的表达。

图4是q-pcr分析各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的iwat中能量代谢相关基因的表达。(a)为q-pcr分析在高脂饮食中，hfdcon和hfdlhzz小鼠的iwat中能量代谢相关基因的表达。(b)为q-pcr分析在正常饮食中，cwcon和cwlhzz小鼠的iwat中mrna能量代谢相关基因的表达。

图5是lhzz对小鼠棕色脂肪组织(bat)的影响。(a、b)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠在冷刺激实验中的体温变化。(c)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的棕色脂肪(bat)占体重比。(d)为苏木精-伊红(he)染色观察各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的bat中脂肪细胞大小的变化(比例尺：100μm)。(e、f)为q-pcr分析各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的bat中能量代谢相关基因的表达。

图6是lhzz对小鼠肝脏中脂质合成和炎症反应的影响。(a)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠血清中tc、tg、alt、ast的浓度检测结果。(b)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠血清中炎性因子il-1、il-6、tnf-α的浓度检测结果。(c)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的肝脏重量。(d、e)为q-pcr分析各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠肝脏组织中糖脂代谢相关基因的表达。(f)为苏木精-伊红(he)染色观察各组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠肝切片的组织病理学改变(比例尺：100μm)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1裸花紫珠提取物的制备

裸花紫珠提取物(lhzz)是通过以下方法制备的：取新鲜干燥的裸花紫珠叶，自然风干，粉碎过80目筛，按料液比2g/30ml，将裸花紫珠叶粉末和甲醇混合，于40℃超声浸提30min，用冰水冷却后，摇匀取提取液1.5ml，于10℃，12000rpm冷冻离心10min，静置1～2min，取上清液500μl过0.22μm微孔滤膜，将滤液冷冻干燥，得到裸花紫珠提取物。

实施例2裸花紫珠提取物对脂肪细胞的体外降脂作用

1.1试剂和仪器

胎牛血清(serana)，青霉素，链霉素，dmem培养基，胰岛素，异丁基甲基黄嘌呤(sigma)，地塞米松(sigma)，细胞计数试剂盒-8(cck-8)(建城生物工程研究所，中国南京)，电子天平(赛多利斯)，氯仿、异丙醇、无水乙醇，qpcr逆转录试剂盒，pcr仪器(bio-rid)荧光定量pcr仪(thermofisher,usa)

1.2细胞培养及给药处理

(1)细胞培养：将小鼠3t3-l1(cl-173，atcc)前脂肪细胞在补充有10％v/v新生小牛血清(serana)，青霉素g(100iu/ml)和链霉素(100μg/ml)的dmem中培养。通过在10％v/v胎牛血清(fbs)存在下，用10μg/ml胰岛素，500μm异丁基甲基黄嘌呤(sigma)和1μm地塞米松(sigma)组成的脂肪形成混合物处理细胞，在37℃5％co2环境中诱导细胞分化。2天后，用补充有10μg/ml胰岛素的培养基更换含有脂肪形成混合物的培养基，并培养2天。每2天更换培养基直至分化开始后9天，得到用于给药处理的3t3-l1细胞。

(2)给药处理：

(1)cck-8法进行细胞毒活性测定：分别将裸花紫珠提取物(lhzz)加至含3t3-l1细胞的96孔板中使其浓度为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、3.2mg/ml，培养48h，并以未加lhzz的处理作为空白对照。使用细胞计数试剂盒-8(cck-8)(建城生物工程研究所，中国南京)测定处理后细胞的存活率，评估lhzz的细胞毒性；所有步骤均按照制造商的说明进行。

(2)油红o染色进行3t3l1脂肪细胞脂含量测定：使用浓度为0.8mg/ml的lhzz处理3t3-l1细胞2天，以未加lhzz的处理作为对照组。然后小心轻缓倒去培养液，用pbs轻缓漂洗，加10％中性甲醛固定30min，稀释油红储蓄液，油红：去离子水＝3:2体积比，滤纸过滤，室温放置10min，染色10min左右，加的体积覆盖住板底即可。脱色用75％异丙醇漂洗，除去多余的染料，复染，淡苏木染色1/5min，pbs漂洗。甘油明胶封片，显微镜下观察。

(3)脂肪细胞中代谢相关基因表达情况检测：使用浓度为0.8mg/ml的lhzz处理3t3-l1细胞2天，以未加lhzz的处理作为对照组。然后提取3t3-l1细胞的dna，采用荧光定量pcr分别检测脂肪酸氧化相关指标ppara、acadvl、acadl、acadm、acads、cpt2、cpt1b、fabp3、hsl、mgll、ucp1的mrna表达水平。

1.3实验结果

裸花紫珠提取物(lhzz)作用于脂肪细胞产生的降脂效果见图1所示。图1(a)为cck-8法进行lhzz细胞毒活性测定结果，图1(b)为油红o染色进行3t3l1脂肪细胞脂含量测定结果，图1(c)为脂肪细胞中代谢相关基因表达情况检测结果。

由图1(a)可知，不同浓度的lhzz作用于脂肪细胞，对其增殖均无明显影响，说明lhzz在设置浓度范围内安全无毒，对细胞的正常生长无抑制作用。

由图1(b)可知，油红o染色后细胞内出现大小不等的环形小脂滴，与对照组(con)相比，lhzz(0.8mg/ml)处理组的脂肪细胞中的脂肪含量明显减少。

由图1(c)可知，lhzz(0.8mg/ml)处理组的脂肪酸氧化相关基因ppara、acadvl、acadm和cpt1b的表达显著上升(^*p<0.05，^**p<0.01)。其中ppara是过氧化物酶体增殖物激活受体，主要参与转录因子表达的调控，在细胞分化、发育以及新陈代谢(糖、脂、蛋白质)和高等生物的肿瘤发生中起关键性的作用，尤其是细胞内外脂类代谢目的基因表达。因此经上述结果推测，lhzz可能是通过促进脂肪细胞中的脂肪酸氧化，提高脂肪细胞的能量代谢，从而发挥减少细胞内脂肪含量的作用。

实施例3裸花紫珠提取物的体内降脂减肥作用

1.1试剂和仪器

灌胃针，饲料、垫料，血糖试纸，血糖仪(aconbiotech，中国)，体温计，制冰机，-80℃超低温冰箱，自动生化分析仪(hitachi7080，日本)

1.2动物造模、分组给药、空腹血糖及空腹糖耐量检测

(1)动物造模与分组给药：6周龄的雄性野生型c57bl/6j(wt)小鼠购自广州中医药大学(中国广州)。将小鼠保持在20-22℃的受控温度下的动物室中，12小时光照/黑暗循环。c57bl/6小鼠一半喂食正常饲料(9％脂肪；实验室饮食)，另一半喂食hfd(60kcal％脂肪；researchdiets，usa)，随意饮水，直至实验结束，三个月后，将24只c57bl/6小鼠随机分为4组(每组6只)，即正常饮食对照组(cwcon)，正常饮食lhzz治疗组(cwlhzz，500mg/kg)，高脂饮食对照组(hfdcon)，高脂饮食lhzz治疗组(hfdlhzz，500mg/kg)，所有对照组灌胃给予纯水，给药组经灌胃给予500mg/kglhzz，给药8周。观察给药期间各试验组的小鼠日常活动情况，监测小鼠体温24小时内每小时的体温变化，每天定时称2次体重，早晚各一次，记录试验期间和结束时小鼠体重变化情况。

(2)小鼠空腹血糖及空腹糖耐量检测：给药8周后，对各试验组的小鼠进行葡萄糖耐受试验(gtt)、胰岛素耐受试验(itt)，检测小鼠空腹血糖及空腹糖耐量。对于葡萄糖耐量试验(gtt)，每组禁食16小时的小鼠接受腹腔内注射葡萄糖(1.5g/kg)。对于胰岛素耐量试验(itt)，每组禁食6小时的小鼠接受腹腔内注射人胰岛素(2iu/kg)。使用从尾静脉尖端收集的血液，用葡萄糖计(aconbiotech，中国)测定0、15、30、60、90和120分钟的血糖水平。统计数据，以毫克/分升计，并分析曲线下面积，对比每组小鼠之间的差异性。

(3)组织取材、冷冻保存及固定：各试验组小鼠完成gtt、itt检测后，称量体重，记录最后体重。眼球取血，断颈处死。用酒精擦拭小鼠身体，进行解剖。立即取小鼠背部棕色脂肪，及皮下白色脂肪，附睾脂肪，肝脏，大小肠，粪便，称量脂肪组织及肝脏的重量，拍照，并观察小鼠腹腔内有无异常。组织一半放入ep管中液氮冻存，一半放入装有4％多聚甲醛的ep管中浸泡。整个实验要尽量快速完成，放入液氮的组织在取材结束后转移到-80℃冰箱保存待用。将眼球取血得到的小鼠血液至于1.5mlep管中，静置半小时，收集血液，在4℃以2000×g离心15分钟制备血清，将血清置于-80℃冰箱保存待用。

1.3实验结果

裸花紫珠提取物(lhzz)对高脂饮食引起小鼠肥胖症的预防效果见图2所示。图2(a)为高脂饮食对照组(hfdcon)、高脂饮食lhzz治疗组(hfdlhzz)、正常饮食对照组(cwcon)、正常饮食lhzz治疗组(cwlhzz)小鼠8周的体重变化记录。图2(b、d)为hfdcon、hfdlhzz、cwcon、cwlhzz小鼠的葡萄糖耐量测试(gtt)结果。图2(c、e)为hfdcon、hfdlhzz、cwcon、cwlhzz小鼠的胰岛素耐量测试(itt)结果。

由图2(a)可知，与cwcon比较，hfdcon小鼠的体重极显著增加(^***p<0.001)；在高脂肪(hfd)和正常(cw)饮食条件下用lhzz(n＝6)处理8周的小鼠的体重相比于灌胃给予纯水的对照组均有所降低。在hfd条件，给予lhzz第4周小鼠体重就开始明显降低，与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠的体重显著降低(^*p<0.05)。在cw条件，给予lhzz小鼠的体重也有所降低，与cwcon比较，cwlhzz小鼠的体重降低。关于腹股沟白色脂肪组织(iwat)，附睾白色脂肪组织(ewat)和肝脏重量，我们观察到给予lhzz后，组织的重量有所减少。

由图2(b、d)可知，在gtt中，与hfdcon比较，hfdlhzz能明显抑制小鼠血糖的上升并保持血糖处于降低的平稳状态，增强小鼠对糖的代谢能力。而cwlhzz小鼠的血糖水平也略低于cwcon。

由图2(c、e)可知，在itt中，hfdlhzz小鼠的血糖水平显著低于hfdcon。而cwlhzz小鼠的血糖水平也略低于cwcon。

由图2(b-e)中的auc可知，lhzz有极显著的增强小鼠糖耐性及改善胰岛素敏感性的积极作用(^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001)，以上结果表明，lhzz可增强小鼠对葡萄糖的耐受性，改善小鼠对胰岛素的敏感性，显著增强小鼠对葡萄糖的代谢能力，lhzz可预防高脂饮食引起的肥胖症。

实施例4裸花紫珠提取物对白色脂肪组织中脂肪降解和脂肪酸氧化的影响

1.1试验材料

实施例3冷冻保存的各试验组小鼠腹股沟白色脂肪组织(iwat)；多聚甲醛固定的各试验组小鼠腹股沟白色脂肪组织(iwat)。

1.2实验方法

1.2.1蛋白表达分析的降脂作用机制研究

westernblot检测小鼠白色脂肪组织(wat)中能量代谢相关蛋白ampk、pgc-1α和磷酸化lipe(p-lipe)的表达。

将iwat在具有蛋白酶抑制剂的ripa缓冲液中裂解，均质化后，以12000rpm离心15分钟，吸出上清液并用bca试剂盒定量。将20-40μg蛋白质上样到10％sds-聚丙烯酰胺凝胶上，并将分离的蛋白质转移到pvdf膜上。电转移后，用溶解在tris缓冲盐水/吐温缓冲液(ph＝8.0，0.05％吐温20)中的5％脱脂乳封闭膜1小时。使用特异性抗体进行蛋白质印迹分析。将印迹在4℃下与抗pgc-1α，抗ampkα1(磷酸盐t183)+ampkα2(磷酸盐t172)抗体，抗p-lipe抗体(abcam，usa)的一抗孵育过夜。然后用tbst(0.5％吐温-20在tbs中)洗涤三次，每次10分钟。进一步与1:5000稀释的山羊抗兔igg二抗孵育80分钟，洗涤三次后，随后使用ecl方法(bio-rad，usa)显影。用chemidocxrs+(bio-rad，unitedstates)获得图像。

1.2.2病理检测

将固定的各试验组小鼠的iwat进行病理切片观察，具体的，取部分iwat，经生理盐水洗净，将iwat固定在4％多聚甲醛(pfa)中，包埋在石蜡中，并切成7μm切片。采用苏木精-伊红(he)染色观察各试验组小鼠iwat中脂肪细胞的变化。

1.2.3能量代谢通路基因的降脂作用机制研究

(1)q-pcr检测小鼠皮下脂肪中mrna能量代谢相关基因的表达；

从小鼠iwat中称取40mg进行低温细致研磨，加入1mltripurereagent(aidlab，china)冰上裂解，完成后加入200μl预冷的氯仿，混匀室温放置5min分层，漩涡震荡1min进一步混匀，立即用低温高速离心机，4℃×12000rpm/min离心15min，取上清大概400μl，加入500μl异丙醇，漩涡混匀1min，室温放置10min。4℃×12000rpm/min离心10min，小心吸去上清液保留白色沉淀。此沉淀用无rna酶水配制好的75％的酒精进行吹悬洗涤，4℃×12000rpm/min离心15min。弃去上清溶液，将ep管开口置于超净工作台使酒精自然挥发。用无rna酶水20μl对rna进行溶解，得到总rna，并通过用nanodrop2000分光光度计测量260和280nm处的od来定量分离的rna。根据hifiscriptcdna合成试剂盒(cwbio，china)，用2μg总rna合成cdna，在42℃下孵育15分钟，在85℃下孵育5分钟。在quantstudiotm6flex系统上使用poweruptmsybrtmgreenmastermix(thermofisher，usa)进行qpcr，分别对脂肪组织通用标记(adiponectin、ap2、pparg、cebpa)、脂肪分解(hsl、mgll)、脂肪酸氧化(ppara、acadvl、acadl、acadm、acads、cpt2、cpt1b、fabp3)、产热(sirt6、ppargc1a、ucp1、prdm16、adrb3、dio2、cidea)、氧化磷酸化(aco2、atp5al、cox5b、ndufb8、sdnb、uqcrc2、uqcrfsl)相关基因的表达进行检测。

1.3实验结果

裸花紫珠提取物(lhzz)对小鼠白色脂肪组织(wat)的影响见图3、4所示。

图3(a)为正常饮食对照组(cwcon)、正常饮食lhzz处理组(cwlhzz)、高脂饮食对照组(hfdcon)、高脂饮食lhzz治疗组(hfdlhzz)小鼠的腹股沟白色组织(iwat)占体重比。

图3(b)为苏木精-伊红(he)染色观察各组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的iwat中脂肪细胞大小(比例尺：100μm)。

图3(c、d)为westernblot检测各组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的皮下脂肪与能量代谢相关蛋白ampk、pgc-1α和磷酸化lipe(p-lipe)的表达。

图4为q-pcr分析各组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的iwat中能量代谢相关基因的表达。图4a为q-pcr分析在高脂饮食中，hfdcon和hfdlhzz小鼠的iwat中能量代谢相关基因的表达。图4b为q-pcr分析在正常饮食中，cwcon和cwlhzz小鼠的iwat中mrna能量代谢相关基因的表达。

由图3(a)可知，与cwcon比较，hfdcon小鼠的iwat占体重比显著增加(^**p<0.01)；在正常饮食中，cwcon和cwlhzz小鼠的iwat占体重比没有明显差异；在高脂饮食中，与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠的iwat占体重比显著降低(^*p<0.05)，表明lhzz可显著减少高脂饮食中小鼠的iwat，促进脂肪降解。

由图3(b)可知，与cwcon比较，cwlhzz小鼠iwat中的脂肪细胞缩小；与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠iwat中的脂肪细胞缩小，以上结果表明，无论在正常饮食还是高脂饮食，lhzz均可缩小小鼠iwat中的脂肪细胞，减少脂肪细胞的大小。

由图3(c、d)可知，在高脂饮食中，与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠iwat中ampk、pgc-1α、p-lipe的表达均明显增加，其中ampk、p-lipe的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05，^**p<0.01)；在正常饮食中，与cwcon比较，cwlhzz小鼠iwat中ampk、p-lipe的表达均增加，其中p-lipe的表达增加具有显著性差异(^**p<0.01)，以上结果表明lhzz可促进小鼠iwat中ampk、pgc-1α、p-lipe的表达。在高脂饮食条件下，lhzz处理促进小鼠的pgc-1α和ampk蛋白质表达。通过ampk活化诱导pgc-1α表达以调节脂肪酸氧化并促进皮下白色脂肪组织(wat)的能量消耗，促进wat的褐变。

由图4可知，在高脂饮食中，与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠iwat中脂肪分解相关基因hsl、mgll的表达均显著增加(^*p<0.05)，脂肪酸氧化相关基因ppara、acads、cpt2、cpt1b、fabp3的表达均明显增加，且ppara、acads、cpt2的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05)，产热相关基因sirt6、ppargc1a、ucp1、prdm16、adrb3、dio2、cidea的表达均明显增加，且dio2、cidea的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05)，氧化磷酸化相关基因aco2、atp5al、cox5b、ndufb8、sdnb、uqcrc2、uqcrfsl的表达均明显增加，且aco2、atp5al、ndufb8的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05)。

在正常饮食中，与cwcon比较，cwlhzz小鼠的iwat中脂肪分解相关基因hsl、mgll的表达明显增加，且hsl的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05)，脂肪酸氧化相关基因ppara、acadvl、acadl、acadm、acads、cpt2、cpt1b、fabp3的表达均明显增加，且ppara、acadvl、acadl、acads、cpt2的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05)，产热相关基因ucp1、prdm16、adrb3、dio2、cidea的表达均明显增加，且cidea的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05)，氧化磷酸化相关基因aco2、atp5al、cox5b、ndufb8、sdnb、uqcrc2、uqcrfsl的表达均明显增加。

以上结果表明，lhzz通过促进小鼠iwat中脂肪分解基因hsl、mgll的表达，减少脂肪细胞大小，通过促进脂肪酸氧化基因、产热基因、氧化磷酸化基因的表达，促进wat的能量消耗，促进wat的褐变。

实施例5裸花紫珠提取物对棕色脂肪组织中的产热基因表达的影响

1.1实验试剂与器材

氯仿、异丙醇、无水乙醇、tripurereagent(aidlab，china)，体温计，nanodrop2000分光光度计，hifiscriptcdna合成试剂盒(cwbio，china)，poweruptmsybrtmgreenmastermix(thermofisher，usa)。

1.2实验方法

(1)动物造模与分组给药：6周龄的雄性野生型c57bl/6j(wt)小鼠购自广州中医药大学(中国广州)。将小鼠保持在20-22℃的受控温度下的动物室中，12小时光照/黑暗循环。c57bl/6小鼠一半喂食正常饲料(9％脂肪；实验室饮食)，另一半喂食hfd(60kcal％脂肪；researchdiets，usa)，随意饮水，直至实验结束，三个月后，将24只c57bl/6小鼠随机分为4组(每组6只)，即正常饮食对照组(cwcon)，正常饮食lhzz治疗组(cwlhzz，500mg/kg)，高脂饮食对照组(hfdcon)，高脂饮食lhzz治疗组(hfdlhzz，500mg/kg)，所有对照组灌胃给予纯水，给药组经灌胃给予500mg/kglhzz，给药8周。

冷刺激实验：将cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz的小鼠按每只小鼠单笼单只放入低温(4℃)环境中6小时，每笼放入少量垫料，正常给与食物与水，记录小鼠每小时体温。

q-pcr检测小鼠棕色脂肪组织(bat)中mrna能量代谢相关基因的表达：将进行冷刺激实验后的各组小鼠处死，解剖，取出bat进行检测，具体步骤为：取30mgbat，使用tripurereagent(aidlab，china)提取总rna，并通过用nanodrop2000分光光度计测量260和280nm处的od来定量分离的rna。根据hifiscriptcdna合成试剂盒(cwbio，china)，用2μg总rna合成cdna，在42℃下孵育15分钟，在85℃下孵育5分钟。在quantstudiotm6flex系统上使用poweruptmsybrtmgreenmastermix(thermofisher，usa)进行qpcr，分别对脂肪组织通用标记(adiponectin、ap2、pparg、cebpa)、脂肪分解(hsl、mgll)、脂肪酸氧化(ppara、acadvl、acadl、acadm、acads、cpt2、cpt1b、fabp3)、产热(sirt6、prdm16、ppargc1a、ucp1、adrb3、dio2、cidea)、氧化磷酸化(aco2、atp5al、cox5b、ndufb8、sdnb、uqcrc2、uqcrfsl)相关基因的表达进行检测。

1.3实验结果

裸花紫珠提取物(lhzz)对小鼠棕色脂肪组织(bat)的影响见图5所示。

图5(a、b)为正常饮食对照组(cwcon)、正常饮食lhzz处理组(cwlhzz)、高脂饮食对照组(hfdcon)、高脂饮食lhzz治疗组(hfdlhzz)小鼠在冷刺激实验中的体温变化。

图5(c)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的棕色脂肪(bat)占体重比。

图5(d)为苏木精-伊红(he)染色观察各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的bat中脂肪细胞大小的变化(比例尺：100μm)。

图5(e、f)为q-pcr分析各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的bat中能量代谢相关基因的表达。

由图5(a、b)可知，在高脂饮食中，hfdlhzz小鼠的体温高于hfdcon，在正常饮食中，cwlhzz小鼠的体温低于cwcon，以上结果表明，在高脂饮食条件下，lhzz可促进小鼠产生更高的热量。

由图5(c)可知，在正常饮食中，与cwcon比较，cwlhzz小鼠的bat占体重比增加；在高脂饮食中，与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠的bat占体重比显著增加(^*p<0.05)，以上结果表明，无论在正常饮食或高脂饮食中，lhzz均可增加小鼠的bat。

由图5(d)可知，与cwcon比较，cwlhzz小鼠bat中的脂肪细胞缩小；与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠bat中的脂肪细胞缩小，以上结果表明，无论在正常饮食还是高脂饮食中，lhzz均可缩小小鼠bat中的脂肪细胞，减少脂肪细胞的大小。

由图5(e、f)可知，在高脂饮食中，与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠的bat中脂肪分解相关基因hsl、mgll的表达明显增加，且hsl的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05)，脂肪酸氧化相关基因ppara、acadvl、acadm、acads、cpt2、cpt1b、fabp3的表达均明显增加，产热相关基因sirt6、prdm16、ppargc1a、ucp1、adrb3、dio2、cidea的表达均明显增加，且sirt6、prdm16、ppargc1a、ucp1的表达增加具有显著性差异(^*p<0.05)，氧化磷酸化相关基因atp5al、cox5b、ndufb8、uqcrc2、uqcrfsl的表达均明显增加。

在正产饮食中，与cwcon比较，cwlhzz小鼠的bat中脂肪分解相关基因hsl的表达增加，脂肪酸氧化相关基因acadvl、acadm、acads、cpt2的表达增加，产热相关基因sirt6、prdm16、ppargc1a、ucp1、adrb3、dio2、cidea的表达增加，氧化磷酸化相关基因aco2、cox5b、ndufb8、sdhb的表达增加。

以上结果表明，lhzz通过促进小鼠bat中脂肪分解基因hsl、mgll的表达，减少脂肪细胞大小，lhzz可促进bat中脂肪酸氧化基因、产热基因、氧化磷酸化基因的表达，恢复bat功能。

实施例6裸花紫珠提取物对肝脏中脂质合成和炎症的影响

1.1试验材料

实施例3冷冻保存的各试验组小鼠肝组织、血清。多聚甲醛固定的各试验组小鼠肝组织。

1.2实验方法

1.2.1q-pcr检测在高脂饮食中，hfdcon和hfdlhzz小鼠肝脏组织中糖脂代谢相关基因的表达：取20mg小鼠肝脏组织，使用tripurereagent(aidlab，china)提取总rna，注意无酶过程。通过用nanodrop2000分光光度计测量260和280nm处的od来定量分离的rna。根据hifiscriptcdna合成试剂盒(cwbio，china)，用2μg总rna合成cdna，在42℃下孵育15分钟，在85℃下孵育5分钟。使用poweruptmsybrtmgreenmastermix(thermofisher，usa)在quantstudiotm6flex系统上进行qpcr，分别对肝脏中糖脂合成相关基因(srebp-1c、fas、acc、pgc-1α、pepck、g6pase、sirt6)的表达进行检测。

1.2.2血液生化相关指标检测：分别检测正常饮食对照组(cwcon)、正常饮食lhzz处理组(cwlhzz)、高脂饮食对照组(hfdcon)、高脂饮食lhzz治疗组(hfdlhzz)小鼠血清中的各项生化指标，以评价lhzz对小鼠血脂水平、肝功能、炎症反应的影响，相关指标为：1)血脂相关：甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)；2)肝功能相关：血浆丙氨酸转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)；3)炎症细胞因子相关：白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素6(il-6)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)。

使用自动生化分析仪(hitachi7080，日本)测定各试验组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶，天冬氨酸氨基转移酶，甘油三酯和总胆固醇(alt，ast，tg和tc)水平。alt，ast，tc和tg的检测方法为速率法、胆固醇氧化酶法和酶法。

使用elisa试剂盒(abclonal，china)，根据制造商的说明和指导，对血清炎性细胞因子(il-1、il-6、tnf-α)进行酶联免疫测定，将样品1:6稀释，结果以每个样品的pg/ml表示。

1.2.3病理检测

将固定的各试验组小鼠的肝组织进行病理切片观察，具体的，取部分肝组织，经生理盐水洗净，将肝组织固定在4％多聚甲醛(pfa)中，包埋在石蜡中，并切成7μm切片。采用苏木精-伊红(he)染色观察各试验组小鼠肝切片的组织病理学改变(比例尺：100μm)。

1.3实验结果

裸花紫珠提取物(lhzz)对小鼠肝脏中脂质合成和炎症反应的影响见图6所示。

图6(a)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠血清中tc、tg、alt、ast的浓度检测结果。

图6(b)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠血清中炎性因子il-1、il-6、tnf-α的浓度检测结果。

图6(c)为各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠的肝脏重量。

图6(d、e)为q-pcr分析各试验组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠肝脏组织中糖脂代谢相关基因的表达。

图6(f)为苏木精-伊红(he)染色观察各组(cwcon、cwlhzz、hfdcon、hfdlhzz)小鼠肝切片的组织病理学改变(比例尺：100μm)。

由图6(a)可知，与cwcon比较，hfdcon小鼠血清中的tc、tg水平增加，尤其是tc的增加幅度极为显著(^***p<0.001)，给予lhzz治疗可降低小鼠血清中的tg水平；与cwcon比较，hfdcon小鼠血清中alt、ast水平增加，给予lhzz治疗可降低小鼠血清中的alt、ast水平；在正产饮食条件下，与cwcon比较，cwlhzz小鼠血清中的ast水平显著降低(^*p<0.05)，在高脂饮食条件下，与hfdcon比较，hfdlhzz小鼠血清中的alt、ast水平均显著降低(^*p<0.05，^**p<0.01)。

由图6(b)可知，与cwcon比较，hfdcon小鼠血清中的il-1、il-6、tnf-α水平增加，且il-6、tnf-α水平增加具有显著性差异(^*p<0.05)；给予lhzz治疗可降低小鼠血清中的il-1、il-6、tnf-α水平，尤其在高脂饮食条件下，lhzz降低小鼠血清中的il-6、tnf-α水平更为明显，具有显著性差异(^*p<0.05)。

由图6(c)可知，无论在正常饮食，还是高脂饮食条件，给予lhzz治疗均可降低小鼠肝脏重量，尤其在高脂饮食条件下，lhzz降低小鼠肝脏重量的效果更为明显，具有显著性差异(^*p<0.05)。

由图6(d、e)可知，在高脂饮食条件，给予lhzz治疗小鼠肝脏组织中的脂肪生成因子srebp-1c、fas、acc的表达水平显著降低(^*p<0.05)，pgc-1α、pepck、sirt6的表达增加。在正常饮食条件，给予lhzz治疗同样观察到小鼠肝脏组织中的脂肪生成因子srebp-1c、fas、acc的表达水平降低。

由图6(f)可知，正常饮食组，cwcon和cwlhzz的肝组织病理切片无区别。但是在高脂组，hfdcon组，可以清晰的看到在油红染色后，出现了大量的空泡，是因为脂肪肝而引起。通过给予药物后，hfdlhzz组的肝组织得到明显修复，未看到脂肪油泡。说明lhzz可以修复脂肪肝，减低脂肪肝引起的肝组织病变。

以上结果表明，lhzz可降低小鼠血清中tg、alt、ast、il-1、il-6、tnf-α的水平，具有降脂、改善肝功能、降低肝损伤，抑制炎症的效果，并通过降低脂肪生成因子srebp-1c、fas、acc的表达，抑制肝脏中脂肪酸的生物合成，lhzz通过降低脂肪生成因子的表达以及改善抗氧化和抗炎症状来预防高脂饮食条件诱导的代谢损伤。

实施例7制剂方法

1.散剂：将新鲜裸花紫珠叶原料药材，挑拣，自然风干后，粉碎，过80目筛，罐装即得。

2.胶囊：将将新鲜裸花紫珠叶原料药材，挑拣，自然风干后，粉碎，过80目筛，用70％乙醇浸提，减压浓缩浸提液，再冷冻干燥，成粉末状。罐装胶囊。

3.颗粒剂：将新鲜裸花紫珠叶原料药材，挑拣，自然风干后，粉碎，过80目筛，用70％乙醇浸提，减压浓缩浸提液，再冷冻干燥，成粉末状。加淀粉、硬脂酸镁均匀混合，制成颗粒，干燥，罐装即得。

4.片剂：将新鲜裸花紫珠叶原料药材，挑拣，自然风干后，粉碎，过80目筛，用70％乙醇浸提，减压浓缩浸提液，再冷冻干燥，成粉末状。加淀粉、硬脂酸镁均匀混合，制成颗粒，干燥，压片，即得。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。