一种不含有支架的组织工程血管构建系统的制作方法

本实用新型涉及生物组织工程技术领域，尤其涉及一种不含有支架的组织工程血管构建系统。

背景技术：

随着冠状动脉粥样硬化性心脏病、外周血管病变、慢性肾脏病(ckd)等发病率逐年上升，动静脉造瘘、冠脉搭桥术、血管置换术等治疗手段的应用日趋广泛。目前临床常用的血管有自体血管和膨体聚四氟乙烯(eptfe)人工血管，无论是自体血管还是人工血管，在实际应用上存在一定局限性，自体血管由于粥样硬化、钙化等影响可能使之无法满足移植的需求，而人工血管顺应性差，移植后易引起血栓形成及免疫反应，使用寿命有限。因此，目前认为组织工程血管是解决小口径血管的理想替代物，其研究成为组织工程研究领域的热点。

组织工程血管构建的三大要素包括种子细胞、支架材料及培养环境，目前成熟的组织工程血管化策略是在支架材料上接种种子细胞进行培养。常用的支架材料包括天然生物支架和人工支架，但目前常用的支架材料均不能很好地满足组织工程领域的要求。天然生物支架一般选择原生血管进行脱细胞处理后获得，但脱细胞的最佳程度难以衡量，脱细胞不完全可能导致植入体内后引起严重的宿主反应，脱细胞过于剧烈则会引起细胞外基质成分及力学性能的破坏；人工支架则一般以高分子材料制成，常用的高分子材料有：聚乙醇酸(pga)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚乙酰内酯(pvla)、聚己酸内酯(pcl)、聚-β-羟基丁酸(phb)等，但在此类材料上细胞难以形成特异性黏附，另外随着时间延长其降解的酸性产物会影响、抑制细胞的生长及分泌功能，而且还可能产生局部的炎症反应、免疫排斥反应，并非是理想的支架材料。另外，含有支架材料的组织工程血管由于其支架材料的降解不完全，将影响细胞外基质(extracellularmatrixc,ecm)的成分，限制了其作为ecm的研究及应用。

总而言之，目前已知的支架材料均不能为组织工程血管构建提供一个理想的生长支架，一定程度上限制了组织工程血管的构建，同时由于支架材料的降解存在个体差异性使得研究结果较难在研究中得到重复。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本实用新型的目的是：提供一种不含有支架的组织工程血管构建系统，在构建组织工程血管的过程中可以不使用支架材料，在动态培养过程中提供一定张力促进血管重构。

为了达到上述目的，本实用新型采用如下技术方案：

一种不含有支架的组织工程血管构建系统，包括脉动式生物反应器、动力装置、储液袋；脉动式生物反应器上安装有内硅胶管，组织工程血管套在内硅胶管上，组织工程血管位于脉动式生物反应器的内部，动力装置的一端通过硅胶管连接在储液袋的其中一个出入口，动力装置的另一端通过第一硅胶管连接在内硅胶管的一端，内硅胶管的另一端通过第二硅胶管连接在储液袋的另一个出入口，储液袋高于脉动式生物反应器；

脉动式生物反应器包括玻璃反应器、盖住玻璃反应器的硅胶盖、从硅胶盖插入玻璃反应器内部的换气管和换液管；内硅胶管贯穿玻璃反应器，组织工程血管位于玻璃反应器的内部，内硅胶管的一端通过变径直通接头与第一硅胶管连接，内硅胶管的另一端通过变径直通接头与第二硅胶管连接。

进一步的是：动力装置可提供不同的收缩压、舒张压、频率以及周向应力，设置的收缩压范围为50～300mmhg，舒张压-50mmhg～0mmhg，频率范围为20次/分～120次/分，在脉动式生物反应器培养7周，每周更换脉动式生物反应器里一半的培养基。

进一步的是：变径直通接头由聚丙烯材料制成。

进一步的是：换气管有三根，换液管有一根。

总的说来，本实用新型具有如下优点：

(1)种子细胞均匀接种于柱形环模具的柱形凹槽内并形成均匀的组织血管环，更接近于生理状态下的血管；

(2)构建过程中避免了使用支架材料，减少了支架材料对组织生长的抑制作用及产生的免疫反应和炎症反应；减少支架材料对组织工程血管成品的影响。

(3)所培养的组织工程血管的内径大小与柱形凸柱的直径大小相匹配，可以通过调整柱形凸柱的直径大小来构建不同内径大小的血管；

(4)静态培养得到的组织工程血管，支架经过加压培养后可刺激细胞、组织的分泌及表型转化等，从而获得更好的力学性能，更符合临床上血管置换手术所需求的缝合张力、爆破张力等力学条件。

(5)动态培养在培养过程中提供一定张力促进血管重构。

附图说明

图1是圆柱体模具的立体图。

图2是琼脂糖模具的立体图。

图3是柱形环模具的立体图。

图4为培养得到组织血管环串联于硅胶管上。

图5是组织工程血管加载于培养系统中进行动态培养。

图6是脉动式生物反应器的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式来对本实用新型做进一步详细的说明。

为了便于统一查看说明书附图里面的各个附图标记，现对说明书附图里出现的附图标记统一说明如下：

1为圆柱体模具，2为底板，3为侧板，4为圆柱体，5为圆柱孔，6为琼脂糖模具，7为柱形环模具，8为柱形凹槽，9为柱形凸柱，10为动力装置，11为硅胶管，12为储液袋，13为脉动式生物反应器，14为内硅胶管，15为第一硅胶管，16为第二硅胶管，17为玻璃反应器，18为硅胶盖，19为换气管，20为换液管，21为变径直通接头，22为磁力搅拌子。

一种不含有支架的组织工程血管构建方法，包括以下步骤：

结合图1所示，圆柱体模具的构建：

利用无生物毒性材料加工获得圆柱体模具，圆柱体模具包括一体成型的槽型框和均匀分布在槽型框内的多个圆柱体，圆柱体具有圆柱孔；圆柱体模具是由3d打印制成的，槽型框由一体成型的底板和设置在底板四周的侧板组成，圆柱体的圆柱孔内径的范围为2～10mm，深度为6mm，圆柱体的横截面直径为9.5～17.5mm，高度为6mm。本实用新型，圆柱孔的直径为5mm，在使用圆柱体模具前，应用环氧乙烷气体对圆柱体模具进行消毒。

结合图2、图3所示，柱形环模具的构建：

使用环氧乙烷气体对圆柱体模具进行消毒，将融化的2％琼脂糖溶液(2％琼脂糖溶液由2g琼脂糖溶于100mldmem培养基中配成)置于高温高压环境中灭菌消毒，采用高温高压锅提供高温高压环境，待其冷却至温度不低于50℃后，即高于50℃，将其均匀倒入圆柱体模具中，使琼脂糖溶液没过圆柱体，静置约15min后，待琼脂糖溶液凝固后得到琼脂糖模具，小心将琼脂糖模具和圆柱体模具分离开，再将琼脂糖模具均匀分割成多个相同的柱形环模具，使得每个柱形环模具具有柱形凹槽和位于柱形凹槽内的柱形凸柱，然后再将柱形环模具放置在培养孔板的培养孔内，再向培养孔内加入细胞培养基，且细胞培养基位于柱形环模具的外部，即细胞培养基没有倒入柱形凹槽内，然后再将培养孔板置于培养箱中孵育，细胞培养基为79％dmem培养基+10％20胎牛血清+1％青霉素，培养箱内的温度是32℃，培养箱内含有5％co2，培养箱孵育培养孔板的时间为15min。得到的柱形环模具中，柱形凹槽深度为6mm，柱形环模具宽度为3.75mm，柱形凹槽内含有柱形凸柱，根据需要柱形凸柱直径可设计为2mm至10mm。

种子细胞的培养、传代、消化：

种子细胞培养、传代、消化后配成细胞悬液是通过以下步骤实现的：

在超净台内将人的主动脉在dmem培养基中漂洗数次，将主动脉的内膜及外膜剥去，得到组织块，然后用含100u/ml青、链霉素的生理盐水反复冲洗后，在胰酶、抗生素混合液中用眼科剪将组织块剪碎，再加入0.25％胰酶于孵箱中消化组织块1min，终止消化后，用吸管吹打组织块，再将组织块均匀铺于25cm²细胞培养瓶中，组织块贴壁约1.5h后加入dmem/f12培养基，使dmem/f12培养基覆盖组织块，dmem/f12培养基含20％fbs、1％青霉素及链霉素，然后置于培养箱中培养，一般7天左右待有细胞从组织块边缘爬出，当爬出的细胞在密集成层后即进行细胞分散、传代，并转移至新的培养瓶中继续培养，待细胞增殖至80-90％融合时用胰酶消化并配成细胞悬液，细胞浓度为0.6x10⁷/ml。种子细胞为内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、干细胞、干细胞来源的内皮细胞、干细胞来源的平滑肌细胞或干细胞来源的成纤维细胞；本实用新型采用的种子细胞为平滑肌细胞(培养时间是7天左右)，根据种子细胞的不同，培养时间为7-21天不等。待细胞增殖至80％时，用胰酶将种子细胞消化并悬浮于细胞培养基中，根据柱形环模具内径大小配成不同浓度细胞悬液，柱形环模具的内径为2mm-10mm，对应种子细胞数量为0.6-3x10⁶，将细胞悬液加入柱形环模具的柱形凹槽内后，于培养箱中静置24小时，随后每两天更换培养基，培养后得到组织血管环。

组织血管环的构建：

将种子细胞培养、传代、消化后配成细胞悬液，然后向柱形环模具的柱形凹槽内均匀加入细胞悬液500ul，再将培养孔板放于培养箱中静置培养设定的时间(24小时)，随后每两天更换细胞培养基，每次向柱形环模具加入的细胞培养基完全没过柱形环模具，待培养7天后，组织血管环培养出来后(基本成熟)，用镊子将组织血管环取出。

结合图4所示，组织工程血管的培养：

将若干个(本实用新型采用9个组织血管环)组织血管环逐一套入硅胶管(直径为4.8mm)上，用镊子使所有的组织血管环相互依次紧贴，然后将硅胶管的两端固定于培养皿中，并使组织血管环悬在培养皿内，然后加入细胞培养基使之完全没过组织血管环，静态培养设定时间(7天)，得到管状结构的组织工程血管。

结合图5所示，组织工程血管的动态培养：

将得到的组织工程血管连同硅胶管(该硅胶管即下文所说的内硅胶管)从培养皿中卸下来，然后安装于脉动式生物反应器中，再使用培养系统对组织工程血管进行动态培养。培养系统也即是构建系统。

一种不含有支架的组织工程血管构建系统，包括脉动式生物反应器、动力装置、储液袋；脉动式生物反应器上安装有内硅胶管，组织工程血管套在内硅胶管上，组织工程血管位于脉动式生物反应器的内部，动力装置的一端通过硅胶管连接在储液袋的其中一个出入口，动力装置的另一端通过第一硅胶管连接在内硅胶管的一端，内硅胶管的另一端通过第二硅胶管连接在储液袋的另一个出入口，储液袋高于脉动式生物反应器。

结合图6所示，脉动式生物反应器包括玻璃反应器、盖住玻璃反应器的硅胶盖、从硅胶盖插入玻璃反应器内部的换气管和换液管；内硅胶管贯穿玻璃反应器，内硅胶管贯穿玻璃反应器后，内硅胶管和玻璃反应器的交界处应当保持密封性，组织工程血管位于玻璃反应器的内部，内硅胶管的一端通过变径直通接头与第一硅胶管连接，内硅胶管的另一端通过变径直通接头与第二硅胶管连接。变径直通接头由聚丙烯材料制成，具有强度高、耐高温、抗腐蚀、无毒、耐磨等特点。换气管有三根，换液管有一根。整个培养系统除了换气管给平滑肌细胞供氧(连接有过滤器)以外，其他部分均与外界隔绝，玻璃反应器上方为连接紧密的硅胶盖，硅胶盖上开有4个孔分别连接3个换气管和1个换液管。玻璃反应器内设有磁力搅拌子，用于搅拌玻璃反应器内的溶液。

在组织工程血管动态培养的步骤中，动力装置可提供不同的收缩压、舒张压、频率以及周向应力，设置的收缩压范围为50～300mmhg，舒张压-50mmhg～0mmhg，频率范围为20次/分～120次/分，在脉动式生物反应器培养7周，每周更换脉动式生物反应器里一半的培养基。本实用新型中，动力装置提供收缩压250mmhg，舒张压-10mmhg，频率100bpm的脉动式压力以提供周向应力。

动态培养目的是培养过程中提供一定张力促进血管重构。在经过上述培养的步骤后，将得到的组织工程血管从硅胶管中分离出来，并对组织工程血管进行力学检测、组织学检测、生物学检测或进一步用于动物实验。

下面介绍一下经过上述步骤得到的组织工程血管可进行的检测或实验有如下：

一、石蜡切片染色

用小剪刀将标本(组织工程血管)含内硅胶管(维持环状结构)剪下，长度5mm，用滤纸将表面残留培养基吸干后，置于1ml冻存管中，然后加入4％多聚甲醛4℃固定过夜，用于石蜡包埋，切片后行he、masson、evg染色。

二、扫描电镜

用小剪刀将标本(组织工程血管)含内硅胶管(维持环状结构)剪下，样本约3mm，用滤纸将表面残留培养基吸干后，置于1ml冻存管中，加入2.5％戊二醛溶液中4℃固定2～4h；弃去固定液，pbs漂洗样品3次，每次15min；乙醇梯度(包括30％、50％、70％、85％、90％、100％、100％)脱水处理各15min；乙酸异戊酯置换乙醇2次，20min/次；将标本分别在-20℃、-40℃、-80℃冷冻12h，于冷冻干燥仪中干燥12h，制备好扫描电镜标本备用。

三、力学性能检测

采用静水压测试血管爆破张力，组织工程血管的一端用50ml注射器连接，组织工程血管的另一端连接高精度压力传感器，用注射器向血管内缓慢匀速注入pbs，使血管膨胀直至破裂，结合ni数据采集系统对压力信号进行高频、准确捕捉爆破时的压力。

四、ecm成分的研究

将得到的样本(组织工程血管)做荧光染色、westernblot、rt-pcr、rna序列等检测，根据研究方向对ecm成分进行研究。

上述实施例为本实用新型较佳的实施方式，但本实用新型的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本实用新型的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本实用新型的保护范围之内。