一种明胶-III型胶原蛋白水凝胶以及制备方法和应用与流程

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种明胶-iii型胶原蛋白水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

皮肤是人体最大的组织器官，具有很多功能，如：调节体温、感觉的传递、防止微生物、化学物质侵入及物理刺激的屏障。所以，皮肤受创后尽快愈合创面至关重要。创伤愈合是指组织、器官受机械性外力作用或病变的破坏造成组织损伤或断裂后，由其周围组织经再生而修复闭合的过程。创伤愈合包括渗出、吸收、吞噬和搬运等创腔净化与组织新生修复2个过程，它是以再生修复为基础的修复性病变。创面愈合过程包括急性炎症期、细胞增殖期和瘢痕形成期，其中角质形成及成纤维细胞在创面愈合过程中发挥重要的作用。炎性渗出后，成纤维细胞和毛细血管内皮细胞逐渐大量增殖，形成肉芽组织，新生的上皮组织逐渐填补创口，直至创面愈合。

水凝胶类创面敷料性状与细胞外基质相近，具有三维网状立体结构，透气性好，能够快速吸水、锁水，早期可吸收创面渗液，后期为创面提供湿润的修复环境，加快创面愈合速度，被视为临床应用价值较高的材料。

明胶是胶原蛋白的水解产物，具有优异的生物相容性和亲水性，低免疫原性，还可以被生物降解吸收且降解产物无毒副作用；并且还能通过表面的特异受体同细胞相互作用，促进细胞的增殖、黏附、迁移活动以及胞外基质的产生等。因此，明胶被广泛用于医药和生物化工领域，诸如止血创伤敷料、血管支架、药物载体、组织工程置入支架、涂层材料等。

近些年来，随着皮肤组织工程在生物材料方面上取得的巨大进展，以及增材制造技术的快速发展，让人们在修复皮肤创伤方面提出了更高的标准和要求。理想的组织工程用生物材料应该满足如下条件，具有优异的生物相容性、适宜的生物降解性以允许胞外基质和天然组织的替代、适合的孔径和孔隙率便于氧气、养分和代谢废物的交换扩散、和皮肤组织相似的机械性能、无毒无免疫原性、可塑性强便于加工塑形。

技术实现要素：

为了满足目前人们在修复皮肤创伤方面提出的更高的标准和要求，本发明提供一种明胶-iii型胶原蛋白水凝胶及其制备方法和应用。

本发明是采用如下方案实现的：

本发明提供一种明胶-iii型胶原蛋白水凝胶，所述水凝胶的结构为三维多孔互通结构；制备所述水凝胶采用的原料包括明胶和iii型胶原蛋白。三维多孔互通结构能够给细胞提供广泛的粘附微店和增殖、迁移空间；且有利于营养物质的交换和细胞代谢废物的排出；iii型胶原蛋白不仅能够提升水凝胶的生物相容性，而且还能够促进诱导皮肤再生。

本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的改进点在于，所述三维多孔互通结构上具有褶皱；这些褶皱能够为细胞提供丰富的附着表面积，有助于细胞增殖、粘附、迁移等活动。

本发明还提供了一种上述的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法，该方法包括如下步骤：

将明胶粉溶解于超纯水或去离子水中，搅拌，得到明胶溶液；

将iii型胶原蛋白加入到所述明胶溶液中混合，得到混合溶液；

向所述混合溶液中加入转谷氨酰胺酶进行交联，搅拌，得到明胶-iii型胶原蛋白水凝胶。

本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法的改进点在于，向所述混合溶液中加入转谷氨酰胺酶进行交联，搅拌，得到明胶-iii型胶原蛋白水凝胶，还包括：

向所述混合溶液中加入转谷氨酰胺酶进行交联，搅拌，按照设定的打印模型进行3d打印，得到明胶-iii型胶原蛋白水凝胶。

通过3d打印制备明胶-iii型胶原蛋白水凝胶，一方面能够根据实际需要制备得到所需形状的水凝胶，设计性较强；另一方面能够使明胶-iii型胶原蛋白水凝胶具有较多的，均匀的空隙结构，以为细胞的增殖提供更多的增殖位点。

本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法的改进点在于，所述打印模型的丝间距为1.2mm～1.7mm，层高为0.23mm～0.27mm；即在具体的实施例中，打印模型的丝间距可以为1.2mm，可以为1.7mm，也可以为1.2mm～1.7mm之间的任意一个数值；在具体的实施例中，打印模型的层高可以为0.23mm，可以为0.27mm，也可以为0.23mm～0.27mm之间的任意一个数值；优选的，丝间距为1.5mm，层高为0.25mm。

本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法的改进点在于，所述打印模型为长方体结构，其长度为18mm～22mm，宽度为18mm～22mm，高度为1mm～5mm；在具体实施例中，长度可以为18mm，可以为22mm，也可以为18mm～22mm之间的任意一个数值；宽度可以为18mm，可以为22mm，也可以为18mm～22mm之间的任意一个数值；高度可以为1mm，可以为5mm，也可以为1mm～5mm之间的任意一个数值；优选的，长度为20mm，宽度为20mm，高度为3mm。

本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法的改进点在于，所述明胶与所述转谷氨酰胺酶的重量比为1：(0.08～0.12)；在具体实施例中，明胶与转谷氨酰胺酶的重量比可以为1：0.08，可以为1：0.12；也可以为1：(0.08～0.12)之间任意一个比值；优选的，明胶与转谷氨酰胺酶的重量比可以为1：0.1；

转谷氨酰胺酶又称转谷氨酰胺酶(tg酶)是由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质，其可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间发生共价交联，从而改善蛋白质的结构和功能，对蛋白质的性质如：发泡性，乳化性，乳化稳定性，热稳定性、保水性和凝胶能力等效果显著。tg酶在40～45℃、ph6-7的条件下，只需添加0.1-0.3％的量，即可达到明显的效果。

本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法的改进点在于，所述明胶与所述iii型胶原蛋白的质量比为1：(0.001～10)；在具体实施例中，明胶与iii型胶原蛋白的质量比可以为1：0.001，可以为1：10，也可以为1：(0.001～10)之间的任意一个比值。

本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法的改进点在于，所述明胶与所述iii型胶原蛋白的质量比为1：(0.05～0.2)；在具体实施例中，明胶与iii型胶原蛋白的质量比可以为1：0.05，可以为1：0.2，也可以为1：(0.05～0.2)之间的任意一个比值；优选的，明胶与iii型胶原蛋白的质量比可以为1：1。

本发明还提供了上述明胶-iii型胶原蛋白水凝胶在皮肤组织工程方面的应用；优选的，明胶-iii型胶原蛋白水凝胶在在皮肤创伤修复方面的应用。

与现有技术相比，本发明的明胶-iii型胶原蛋白(gelatin/coliii)水凝胶具有良好的生物相容性、较高的孔隙率和适宜的孔径大小，具有三维多孔相互连通的结构；体内降解实验显示，明胶-iii型胶原蛋白水凝胶在体内的降解速度要明显高于明胶水凝胶，而且其产生的炎症反应也相对较轻，说明iii型胶原蛋白的加入提升了明胶水凝胶的降解性能以及生物相容性。gelatin/coliii水凝胶与nih-3t3细胞复合共培养，显示coliii具有较好的促进nih-3t3细胞增殖的作用，并且能够和细胞表面可以较为紧密地结合。动物实验结果也显示，gelatin/coliii水凝胶对大鼠皮肤的损伤修复具有非常好的效果。

所以本发明的gelatin/coliii水凝胶不仅有利于细胞的培养，而且还能够应用于皮肤组织工程方面，作为一种皮肤组织工程材料。

另外，本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法操作简单，便于工业化生产。

附图说明

图1是将本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶材料植入大鼠皮下过程图；

图2是将本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶材料植入大鼠皮下4周后取材过程图；

图3a是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶被冻干前的形态图；

图3b是是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶被冻干后的形态图；

图4a是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶被放大50倍后的大体观电镜图；

图4b明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶被放大1000倍后的微观电镜图；

图5a是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的含水率的柱状图；

图5b是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的孔隙率的柱状图；

图5c是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的溶胀性能的变化趋势图，*p＜0.05；

图6是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的红外光谱图；

图7是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶被植入大鼠皮下4周后的降解情况图；

图8是明胶水凝胶和各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的体内降解实验组织切片以及炎症因子分析图；

图9a是nih-3t3细胞分别与明胶水凝胶，以及各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶复合后的cck-8细胞增殖趋势图；

图9b是nih-3t3细胞分别与明胶水凝胶，以及各组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶复合后的死活细胞染色图，(图中标尺我500μm)；

图10是空白对照组，明胶组(即明胶水凝胶)，以及两组明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的皮肤缺损修复的大体观测图；

图11是采用空白对照组，明胶组(即明胶水凝胶)，以及两组明胶-iii型胶原蛋白水凝胶进行皮肤修复，在第7天和第14天的皮肤修复组织的he染色图；

图12是采用空白对照组，明胶组(即明胶水凝胶)，以及两组明胶-iii型胶原蛋白水凝胶进行皮肤修复，在第7天、第14天、第21天的皮肤修复组织的massin染色图；

图13是采用空白对照组，明胶组(即明胶水凝胶)，以及两组明胶-iii型胶原蛋白水凝胶进行皮肤修复，在第14天的皮肤修复组织的免疫荧光染色图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点等，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

在本发明的具体实施例中，采用的试剂与仪器如下：

dmem培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶(gibco公司，美国)；明胶(sigma公司，美国)；iii型胶原蛋白(江苏悦智生物医药有限公司，胶原含量＞90％)；转谷氨酰胺酶(bomei公司，中国)；cck-8试剂盒、死活细胞染色试剂盒(dojindo公司，日本)；电子秤(fangrui公司，中国)；真空冷冻干燥机(北京四环公司，中国)；电子万能试验机(suns公司，中国)；细胞培养箱(thermo公司，美国)；高速冷冻离心机(eppendorf公司，德国)；恒温水浴锅(上海精宏公司，中国)；荧光显微镜(leica公司，德国)扫描电子显微镜(tescan公司，捷克)；酶标仪(thermo公司，美国)；3d生物打印机cpd1(上普博源公司，中国)。

一、明胶-iii型胶原蛋白水凝胶以及明胶水凝胶的制备

(一)明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备

利用3d生物打印机构建明胶-iii型胶原蛋白(gelatin-coliii)水凝胶，通过明胶(gelatin)的温度敏感性以及生物酶双交联进行成胶。

首先，通过cad软件设计需要打印的模型，转换成stl格式文件导入cpd1打印机软件。其次，通过调整打印模型上的相关参数，设置模型的丝间距为1.5mm，层高为0.25mm，模型为长方体结构，其长×宽×高为20mm×20mm×3mm。

先将gelatin及coliii经co60辐射灭菌，待用；

将1ggelatin粉末溶于10ml超纯水中，加热至40℃搅拌30min，配置得到10％的明胶溶液；

将一定重量的coliii加入到明胶溶液中，混合，得到混合溶液；

将转0.1g谷氨酰胺酶粉末溶解于1ml超纯水中，得到10％的交联剂溶液；

向混合溶液中加入交联剂溶液进行生物酶交联，反应5min，然后通过cpd1三维打印机制作打印出3d多孔gelatin-coliii水凝胶，大小为20mm×20mm×3mm，4℃保存备用。

(二)明胶水凝胶的制备

利用3d生物打印机构建明胶-iii型胶原蛋白(gelatin-coliii)水凝胶，通过明胶(gelatin)的温度敏感性以及生物酶双交联进行成胶。

首先，通过cad软件设计需要打印的模型，转换成stl格式文件导入cpd1打印机软件。其次，通过调整打印模型上的相关参数，设置模型的丝间距为1.5mm，层高为0.25mm，模型为长方体结构，其长×宽×高为20mm×20mm×3mm。

先将gelatin经co60辐射灭菌，待用；

将1ggelatin粉末溶于10ml超纯水中，加热至40℃搅拌30min，配置得到10％的明胶溶液；

将转0.1g谷氨酰胺酶粉末溶解于1ml超纯水中，得到10％的交联剂溶液；

向明胶溶液中加入交联剂溶液进行生物酶交联，反应5min，然后通过cpd1三维打印机制作打印出3d多孔明胶水凝胶，大小为20mm×20mm×3mm，4℃保存备用。

表1明胶组与明胶-iii型胶原蛋白水凝胶组的原料的组分及配比

二、水凝胶的性能测试

(一)孔隙率

将水凝胶用真空冷冻干燥机冻干48h后，用电子天平称量支架干重m0。将比重瓶装满无水乙醇称重，记为m1。将冻干的支架浸没于装有无水乙醇的比重瓶，真空箱抽至支架无气泡溢出，待无水乙醇充分充盈支架间隙后，加满比重瓶中的无水乙醇，称量其质量记为m2；取出充满无水乙醇的支架，称量其质量记为m3。利用以下公式计算支架材料孔隙率。每组重复3个样品。

p(％)＝(m3-m0)/(m1-m2+m3)×100％

(二)含水率测定

将水凝胶从培养皿中取出，用滤纸轻轻吸干材料表面液体，使用电子天平称量此时水凝胶支架的湿重(m4)。再将支架材料置于真空冷冻干燥机冻干48h至恒重，取出支架，用电子天平称量冻干支架的干重(m5)，按一下公式计算支架的含水率(moisturecontent)。每组重复测量3个样。

mc＝(m4-m5)/m4×100％

(三)溶胀性能

水凝胶经冻干机冻干48h后称量支架干重，记为wd。再将冻干支架浸没于37℃的去离子水中，分别于不同时间点取出，用滤纸轻轻擦干支架表面残留的液体，用电子天平称量此时支架的湿重，记录为ww。根据以下公式计算支架的溶胀率(esr)。每组重复测量3个样品。

esr＝(ww-wd)/wd×100％

(四)红外光谱分析

将水凝胶用真空冷冻干燥机冻干48小时。然后，切取适宜大小的干燥后的支架样品置于红外光谱仪中测定材料的红外吸收特征。

(五)扫描电镜观察

切取4mm×4mm×3mm的水凝胶样品，用2.5％戊二醛溶液固定，之后按50％、70％、80％、90％、95％、100％的梯度浓度的乙醇溶液脱水，再用醋酸异戊酯置换；接着将支架样品置于真空冷冻干燥机冻干48h，然后将支架样品喷金镀膜后，再通过扫描电镜观察。

三、水凝胶的体内相容性测试

(一)水凝胶植入大鼠皮下进行评估

将大鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/公斤体重)麻醉。sd大鼠由广东省动物实验中心购买，由深圳市第二人民医院(深圳大学附属第一医院)动物实验中心和伦理委员会审查批准。麻醉后背部消毒后切开约2cm切口，植入长度约1cm，厚度约3mm的无菌立方体水凝胶，切口用4-0缝线缝合。(图1所示)植入4周后麻醉处死大鼠，背部水凝胶和周围组织一起取出，(图2所示)用4％多聚甲醛固定。脱水后石蜡包埋，切成病理切片，切片进行苏木精和伊红(he)染色和cd68、il-10、tnf-α等炎症因子免疫组化染色。

(二)石蜡切片制作步骤

(1)取材：新鲜组织用固定液固定24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

(2)脱水浸蜡：将脱水盒依次进行梯度酒精脱水。

梯度脱水顺序时分别依次为：75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇i30min，无水乙醇ii30min，醇苯5-10min，二甲苯i5-10min，二甲苯ii5-10min，65°融化石蜡i1h，65°融化石蜡ii1h，65°融化石蜡iii1h。

(3)包埋与切片：常规方法包埋后，切片厚度8μm并转移到45℃水浴锅中。用载玻片捞起切片，37℃过夜烤干。

(三)he染色步骤

(1)石蜡切片常规脱蜡水化。

(2)苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

(3)伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

(4)脱水封片：75％乙醇1min，85％乙醇1min，95％乙醇i2min，95％乙醇ii2min，100％乙醇i2min，100％乙醇ii2min。二甲苯透明5分钟，2次。中性树胶封固(避免产生气泡)，通风橱柜中吹风干燥。

(5)显微镜镜检，图像采集分析。

(四)炎症因子免疫组化染色步骤

(1)切片脱水：切片依次放入二甲苯ⅰ15min，二甲苯ⅱ15min，二甲苯iii15min，无水乙醇ⅰ5min，无水乙醇ⅱ5min，85％酒精5min，75％酒精5min，蒸馏水洗。

(2)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(ph6.0)的修复盒放于有一定量水的高压锅内，电磁炉加热至气孔开始喷气，停止加热，释放压力，将切片置于修复盒内，电磁炉加热至气孔开始喷气，5min后关闭电磁炉，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

(3)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

(4)血清封闭:去除组织周围水分，用免疫组化笔在组织周围画圈。5％山羊血清室温封闭30分钟，血清用pbst稀释。

(5)去除封闭液，按1:200用2.5％山羊血清稀释一抗opn，sox9，typeiicollagen，tenc，irs1和nox4。每张切片加50μl一抗，4℃过夜。

(6)去除一抗，pbst洗涤三次，每次5分钟。每张切片加1滴二抗(hrp标记)，室温孵育15分钟。

(7)去除二抗，pbst洗涤三次，每次5分钟。每张切片加50μl新鲜配制的dab溶液，室温放置3-5分钟。

(8)去除多余的dab溶液，自来水稍冲洗，苏木素复染10秒，自来水冲洗返蓝后，用1％盐酸酒精分化1秒。

(9)自来水冲洗返蓝，95％乙醇脱水5分钟，2次。

(10)100％乙醇脱水5分钟，2次。

(11)二甲苯透明5分钟，2次。

(12)中性树胶封固。

(13)显微镜镜检，图像采集分析。

四、水凝胶的体外(细胞外)相容性测试

(一)nih-3t3细胞复苏

(1)从液氮或干冰中取出冻存管迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。

(2)吸出细胞，1000g/min离心5分钟，弃上清，加入适量完全培养液重悬细胞后接种于25cm²培养瓶中，置37℃，5％co2细胞培养箱中培养；其中完全培养液包括dmem，10％小牛血清bovinecalfserum和双抗，其中双抗包括青霉素和链霉素。

(二)nih-3t3细胞传代

(1)当细胞长到80％～90％融合时，弃去培养上清，用pbs(不含钙、镁离子)洗细胞1～2次。

(2)加2ml0.05％trypsin-edta于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1～2分钟，当细胞大部分变圆并脱落时，加入1ml完全培养液终止消化。

(3)轻轻吹打后吸出细胞，1000g/min离心5分钟，弃上清，加入适量完全培养液重悬细胞后按1：3比例接种于25cm²培养瓶中，置37℃，5％co2细胞培养箱中培养。

(4)隔2～3天换液一次，待细胞融合达到90％时继续后续实验，或冻存备用。

(三)水凝胶复合nih-3t3细胞

(1)将制备水凝胶的材料置于超净工作台中紫外灯光消毒，消毒时间为1h。

(2)制备长度约1cm，厚度约3mm的立方体水凝胶，浸泡于1ml生理盐水中置于细胞培养箱3d，每日用生理盐水冲洗水凝胶并更换浸泡生理盐水，除去残留单体。接种前1天，用dmem完全培养基浸泡水凝胶，放入细胞培养箱24h，接种前将培养基吸干。

(3)将nih-3t3细胞悬液滴入水凝胶表面，密度约1×10³/cm²，放入细胞培养箱6h待细胞完全贴壁，加入dmem完全培养基完全浸没水凝胶，置于细胞培养箱培养，每2-3d更换培养基1次。

(四)cck-8细胞增殖试验

(1)配制cck-8与dmem培养基体积比为1:10混合液，避光4℃保存备用。

(2)nih-3t3细胞接种到水凝胶1、3、5、7d后，吸干原有培养基，加入500ul配制的混合溶液完全浸没水凝胶，避光在细胞培养箱孵育4h。

(3)4h后每组水凝胶取100μl悬液加入96孔板，共5孔，将96孔板置于酶标仪测量各孔在450nm吸光度，组间比较吸光度值绘制细胞增殖率柱状图。每组水凝胶重复实验3个样品。

(五)死活细胞染色检测

(1)染色液的配制：取10μl1mmol/l的calcein-am储备液和15μl1.5mmol/l的pi储备液至5mlpbs(-)中配制成染色溶液，避光0℃冻存备用。

(2)nih-3t3细胞接种到水凝胶1、3、5、7d后，吸干原有培养基，更换100ul配制好的pi/ca染色溶液完全浸没水凝胶，避光在细胞培养箱20min。

(3)20min后生理盐水冲洗水凝胶2-3遍洗净染色液，在荧光显微镜下观察细胞数量及状态。通过转换荧光信号观察死活细胞，绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞。每组水凝胶重复实验3个样品。

五、动物实验研究

(一)动物实验分组及大鼠皮肤创伤造模

利用大鼠烧伤模型进行研究分4组(每组n＝6)，a组：空白对照组；b组：明胶水凝胶组；c组：明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组，即试验组2；d组：明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组，即试验组4。

具体实验方案：将体重为180-220g的成年雄性sd大鼠喂养并饲养在保持在22-25℃的干净笼中。在实验开始时，通过腹膜内注射10％(w/v)水合氯醛(每只动物0.5ml)麻醉24只大鼠。将背部皮肤剃毛并用碘伏(0.2％w/v)清洁。然后通过外科手术操作背部皮肤以在每只动物的上背部切除1个全厚度皮肤贴片(直径2cm²)。在0d、7d、14d三个时间点拍摄皮肤伤口愈合的照片。观察皮肤愈合的情况。

(二)动物标本提取及相关检测

每组植入准备好的样品(每组的每个时间点做一个重复)，在0d、7d、14d四个时间点，每组处死2只大鼠并收集包括与伤口相邻的完整皮肤的全层皮肤样品，伤口边缘和上皮化伤口并制备成组织切片。然后进行he染色，masson染色以及免疫荧光分析表皮修复效果，对各个组织切片染色效果评分。

六、统计学分析

采用spss19.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示；若各组数据服从正态分布及方差齐性，则组间比较采用单因素方差分析；如果各组数据不满足正态分布以及方差不齐时，采用kruskal-wallis检验；当p＜0.05时，则认为差异有统计学意义。

七、结果与讨论

(一)明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的形态

明胶水凝胶和明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的尺寸如图3所示。图3-a为各组冻干前的水凝胶形态，从图3-a中可以清晰的看出水凝胶具有明显的孔隙；图3-b是各组冻干后的水凝胶形态，将图3-b与图3-a比较可知，无论是明胶水凝胶，还是明胶-iii型胶原蛋白水凝胶，冻干前后的形态规则，孔径大小规整；且冻干后的孔隙变化小，形态维持好。

如图4-a所示，无论是明胶水凝胶，还是明胶-iii型胶原蛋白水凝胶，孔隙分布均匀，且大小均匀；将明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的孔隙进行比较，发现随着明胶-iii型胶原蛋白水凝胶中iii型胶原蛋白含量的增加，水凝胶的孔隙也随着略微增加，但仍保持孔隙的大小仍保持均匀。

如图4-b所示，从在高倍镜下观察可以看到各组的支架内部均形状不规则、有凸起的小褶皱，这些小褶皱可以为细胞提供丰富的附着表面积，有助于细胞的增殖、粘附、迁移等活动，并且三维多孔的结构也有利于营养物质的交换和细胞代谢废物的排出。

(二)水凝胶的含税率、孔隙率和溶胀性能

如图5-a含水率测试结果表明iii型胶原蛋白的加入对试验组的明胶-iii型胶原蛋白(gelatin-coliii)水凝胶的含水率有一定的影响，gelatin-coliii水凝胶的含水率要高于对照组的明胶(gelatin)水凝胶。

图5-b孔隙率的测试结果表明iii型胶原蛋白的加入对gelatin-coliii水凝胶的孔隙率有一定的影响，iii型胶原蛋白含量越高，水凝胶孔隙率越大。溶胀是高分子聚合物在溶剂中吸收溶剂分子后发生体积膨胀的现象。

从图5-c中，我们可以发现gelatin水凝胶比gelatin-coliii水凝胶的吸水溶胀能力要强；并且无论是gelatin水凝胶，还是gelatin-coliii水凝胶均在4小时左右达到溶胀平衡。其中gelatin水凝胶比gelatin-coliii水凝胶的溶胀率要大。说明coliii的加入会使水凝胶的溶胀率降低。

(三)红外光谱分析

从图6中可以发现各组水凝胶的红外光谱图均具有蛋白质的特征振动模式，分别在3290cm^-1和3300cm^-1左右可见酰胺a带，说明氢键的存在。并且酰胺ⅰ带分别出现在1638cm^-1和1633cm^-1左右，表明c＝o键的伸缩振动，间接表明明胶材料中多肽的二级结构存在。而酰胺ⅱ带分别出现在1550cm^-1和1541cm^-1左右，表明c-n键伸缩振动或者n-h键弯曲振动。酰胺ⅲ带则分别出现在1239cm^-1和1238cm^-1左右，是c-n的吸收带，说明水凝胶中还保持有明胶分子的三螺旋结构。除此之外，这五组水凝胶的红外光谱均在1450cm^-1处有一组较强的吸收峰，表示存在肽键的顺式结构，进一步证明了明胶的存在。

同时通过红外光谱可以发现，含iii型胶原蛋白的水凝胶中的红外光谱在1024cm^-1附近有很强的丝氨酸侧基c-o伸缩振动吸收峰，是iii型胶原蛋白的特征峰。

(四)水凝胶的体内降解实验分析

1、体内降解四周后的取材分析

如图7所示，动物皮下植入实验发现，gelatin-coliii(0.2g)水凝胶组4周后在体内基本降解。其他各组均存在不同程度的降解。结果显示，iii型胶原蛋白含量越高，水凝胶降解越完全。

2、体内降解4轴后he切片以及炎症因子分析

如图8所述，无论是对照组的明胶水凝胶，还是试验组的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶在皮下置入均出现一定的炎症反应。而对照组的明胶水凝胶明显存在水凝胶的材料残留，明胶-iii型胶原蛋白水凝胶组1——gelatin-coliii(0.05g)，以及明胶-iii型胶原蛋白水凝胶组2——gelatin-coliii(0.1g)这两组的组织血管化不佳；明胶-iii型胶原蛋白水凝胶组3——gelatin-coliii(0.15g)，以及明胶-iii型胶原蛋白水凝胶组4——gelatin-coliii(0.2g)这两个组的组织显得更厚实，而gelatin-coliii(0.2g)组的he显示单核细胞与巨噬细胞数量较少，且il-10，tnf-α，cd68免疫组化显示阳性率较少，因此gelatin-coliii(0.2g)组的炎症反应较轻。可能是iii型胶原蛋白含量较多更能修复创面的原因，说明iii型胶原蛋白具有促进创面修复的作用，本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶能够应用在皮肤组织工程，特别是皮肤床面修复方面。

(五)cck-8实验，死活染色实验结果分析

通过cck-8细胞增殖试验可以分析水凝胶的体外生物相容性，从图9-a中可以看出nih-3t3细胞在五组水凝胶上均可增殖生长，而且细胞在水凝胶上的吸光度随着时间的延长而不断增高，说明nih-3t3细胞在三维水凝胶上是不断增殖的。五组水凝胶上细胞的增殖速度基本一致，均呈现一个上升趋势，说明五组水凝胶材料均具有良好的细胞相容性，相对而言，含coliii的水凝胶组的细胞增殖的速度比明胶组要稍快一点，说明coliii具有促进nih-3t3细胞增殖的作用，这就说明本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶能够应用细胞培养方面，特别是nih-3t3细胞培养方面。

如图9-b可见，在接种细胞的第1天，五组水凝胶支架上黏附的细胞数量均较少，且形态多呈现圆形，细胞主要聚集在3d打印水凝胶的孔内，只有少量的细胞黏附在支架的孔径边缘上。到了第4天，各组水凝胶上黏附增殖的细胞增多，且仍以附着在孔周边缘为主，部分细胞迁移、贴附在下层的支架上，呈现条状分布，但在孔周边缘附着分布情况不如明胶的均匀。第7天时，各组水凝胶上的活细胞数量都比之前明显增多，并且细胞逐渐向支架内部迁移、增殖；其中含coliii水凝胶组的细胞密度比明胶组要高，并且分布也比较均匀，综合来看，五组水凝胶均有良好的生物相容性，均有助于细胞的增殖、迁移及黏附等活动，而相对而言，含coliii水凝胶组的细胞增殖更显著，说明coliii具有促进nih-3t3细胞增殖的作用。

(六)动物试验结果分析

1、皮肤修复的大体观分析

通过图10的皮肤大体观修复图可以看到，在第7天，各组的皮肤缺损组织愈合不明显。在第14天，各组的皮肤缺损组织均出现不同程度的愈合，明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组和明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组的愈合程度要明显高于对照组和明胶组，在第21天，对照组和明胶组没有完全愈合，存在部分增生，明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组愈合达到90％，而明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组的愈合达到100％。很明显，iii型胶原蛋白具有较好的促进皮肤缺损修复的作用。

2、组织切片结果分析

(1)he染色结果

如图11所示，对照组的he染色：第7天损伤处可见痂块形成，坏死组织凝聚，未见表皮、毛囊、血管等结构生成。第14天损伤处可见痂块形成，坏死组织凝聚。未见表皮、毛囊等结构生成。可见少量新生胶原纤维形成，排列紊乱。

明胶组he染色：第7天损伤处可见痂块形成，坏死组织凝聚，少量表皮、毛囊、血管等结构生成。第14天损伤处可见痂块形成，坏死组织凝聚。少量表皮、毛囊、新生血管等结构生成。可见新生胶原纤维形成，瘢痕形成，排列紊乱。

明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组：第7天损伤处可见痂块形成，坏死组织凝聚，少量胶原纤维增生，排列紊乱，可见表皮、毛囊、血管等结构生成。第14天损伤处可见新生表皮层形成，真皮层大量胶原纤维增生，排列紊乱，可见新生毛囊、毛细血管结构。

明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组：第7天损伤处可见新生表皮层形成，真皮层大量胶原纤维增生，排列稍紊乱，可见新生毛囊、毛细血管结构。第14天损伤处可见新生表皮层形成，真皮层大量胶原纤维增生，排列较为整齐，可见新生毛囊、毛细血管结构。

综上所述：对照组和明胶组：组织松散，结构紊乱，可能与瘢痕增生挛缩密切相关。明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组和明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组：结构致密，排列整齐，角质层明显。与皮肤物理性能密切相关，角质层更耐磨损，创面愈合质量更加。iii型胶原蛋白具有较好的促进创面愈合的作用。

(2)masson染色结果

masson染色是指用两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一。

如图12所示，第7天：对照组和明胶水凝胶组，明显红色染色，即创面以纤维渗出。明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组和明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组的红染轻于前两组，并且可见蓝色染色(胶原沉积)。

第14天：对照组和明胶水凝胶组，仍可见明显纤维，同时出现较多蓝色染色(较7天的时候)。明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组和明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组明显蓝染，胶原沉积，红色染色局限于表皮层。

第21天：对照组、明胶和明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组均可见胶原沉积。明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组胶原纤维呈致密沉积，且胶原网络间未见纤维沉淀。结合天狼星红结果，胶原沉淀以iii型胶原为主，伤口瘢痕挛缩和硬化可能更轻。

(3)免疫荧光结果分析

通过免疫荧光染色观察创面胶原沉积情况，比masson更直观(只染色胶原)，并且在偏振光显微镜观察下，i型胶原呈橘黄色，iii型胶原呈亮绿色。

如图13所示，免疫荧光染色显示所有组别的胶原含量均随着创面愈合过程呈增加趋势，对照组和明胶水凝胶组以i型胶原为主，iii型少见，两组差异不大。明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组，可见胶原沉积，i型为主，明显胶原含量大于对照组和明胶水凝胶组，且可见iii型胶原沉积。明胶-iii型胶原蛋白(0.2g)组，可见明显胶原沉积，iii型为主，胶原含量大于对照组和明胶水凝胶组，且可见iii型胶原沉积，iii型胶原比例大于明胶-iii型胶原蛋白(0.1g)组。

通过上述分析可知，本发明的明胶-iii型胶原蛋白(gelatin/coliii)水凝胶具有良好的生物相容性、较高的孔隙率和适宜的孔径大小，具有三维多孔相互连通的结构；体内降解实验显示，明胶-iii型胶原蛋白水凝胶在体内的降解速度要明显高于明胶水凝胶，而且其产生的炎症反应也相对较轻，说明iii型胶原蛋白的加入提升了明胶水凝胶的降解性能以及生物相容性。gelatin/coliii水凝胶与nih-3t3细胞复合共培养，显示coliii具有较好的促进nih-3t3细胞增殖的作用，并且能够和细胞表面可以较为紧密地结合。动物实验结果也显示，gelatin/coliii水凝胶对大鼠皮肤的损伤修复具有非常好的效果。

所以本发明的gelatin/coliii水凝胶不仅有利于细胞的培养，而且还能够应用于皮肤组织工程方面，作为一种皮肤组织工程材料。

另外，本发明的明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法操作简单，便于工业化生产。

实施例1

本实施例提供了一种明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法，该方法包括如下步骤：

将明胶和iii型胶原蛋白经co60辐射灭菌；

将1g明胶粉溶解于10ml超纯水中，加热至40℃，搅拌30min，得到10％的明胶溶液；

将0.001giii型胶原蛋白加入到明胶溶液中，搅拌混合，得到混合溶液；

将0.08g的转谷氨酰胺酶溶解在1ml的超纯水中，得到10％的交联剂溶液；

将交联剂溶液全部加入到混合溶液中，交联反应5min后，得到待打印的溶液；

将待打印的溶液按照设定的打印模型，通过cpd1三维打印机制作打印出3d多孔gelatin-coliii水凝胶，大小为20mm×20mm×3mm，4℃保存备用。

其中打印模型的丝间距为1.5mm，层高为0.25mm。

实施例2

本实施例提供了一种明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法，该方法包括如下步骤：

将明胶和iii型胶原蛋白经co60辐射灭菌；

将1g明胶粉溶解于10ml超纯水中，加热至40℃，搅拌30min，得到10％的明胶溶液；

将5giii型胶原蛋白加入到明胶溶液中，搅拌混合，得到混合溶液；

将0.1g的转谷氨酰胺酶溶解在1ml的超纯水中，得到10％的交联剂溶液；

将交联剂溶液全部加入到混合溶液中，交联反应5min后，得到待打印的溶液；

将待打印的溶液按照设定的打印模型，通过cpd1三维打印机制作打印出3d多孔gelatin-coliii水凝胶，大小为20mm×20mm×3mm，4℃保存备用。

其中打印模型的丝间距为1.2mm，层高为0.23mm。

实施例3

本实施例提供了一种明胶-iii型胶原蛋白水凝胶的制备方法，该方法包括如下步骤：

将明胶和iii型胶原蛋白经co60辐射灭菌；

将1g明胶粉溶解于10ml超纯水中，加热至40℃，搅拌30min，得到10％的明胶溶液；

将10giii型胶原蛋白加入到明胶溶液中，搅拌混合，得到混合溶液；

将0.12g的转谷氨酰胺酶溶解在1ml的超纯水中，得到10％的交联剂溶液；

将交联剂溶液全部加入到混合溶液中，交联反应5min后，得到待打印的溶液；

将待打印的溶液按照设定的打印模型，通过cpd1三维打印机制作打印出3d多孔gelatin-coliii水凝胶，大小为20mm×20mm×3mm，4℃保存备用。

其中打印模型的丝间距为1.7mm，层高为0.27mm。

在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表达不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的母体特征、结构、材料或特点可以在任何一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。