血浆蛋白或血浆蛋白各部分的巴氏消毒方法

专利名称:血浆蛋白或血浆蛋白各部分的巴氏消毒方法
本发明涉及血浆蛋白或其各部分的巴氏消毒方法，其中只允许有非常限量的变性血浆蛋白。使用从人血浆中制备的蛋白或蛋白各部分治疗病人时，总具有传染疾病的危险，特别是传染肝炎，尽管这种危险可以通过谨慎地选择供体和广泛的试验而被减少。在连续施用血浆蛋白时，例如像治疗血友病所需要的那样，这种感染的危险就更应予以重视。
一段时间以来，人们在用加热方法处理这些血浆蛋白或其某些部分从而减少这种感染危险的方面做了大量工作。虽然清蛋白及热稳定的α-和β-球蛋白可在水溶液中配以某种预防措施而进行巴氏消毒，但是，对其它部分，例如免疫球蛋白，凝固因子，并且首先是因子Ⅷ浓缩物则是不行的，这一事实就造成了很大的困难。在加热过程中，它们实际上都完全变性了。
公认的，已经提出的各种稳定性填加剂是，糖类，糖醇类，氨基酸类，钙离子，钾或柠檬酸铵，羧酸盐或羟基羧酸盐(美国书第4297344号，美国书第4440679号，美国书第4327086号，美国书第4446134号，西德专利第3237512号，西德申请A3330770号，以及PCT专利申请WO83/04027号)，但是，其中的变性率均相当高。
美国书第4456590号和欧洲专利申请A0110407号已经提出，干血浆蛋白，例如冷冻干燥形式的，特别是含有因子Ⅷ的，均可在干态下进行巴氏消毒，且活性损失很小。这样，根据这些欧洲专利申请，应该能对因子Ⅷ制剂以65-75℃进行巴氏消毒，并使活性损失仅为20-10%。然而，这种干态加热处理实施起来则很困难，量大时则更困难，因为在这样的制剂中，热传导很差并且不均匀，会造成某一部分加热过度而另一部分加热不足的状况。所以无法永远保证病毒完全失活。
根据欧洲专利0112563号，所建议的消除传染病毒，特别是乙型肝炎，非甲非乙型肝炎病毒以及其它具有脂类结构的热源性物质的方法是，以脂肪溶解性溶剂进行萃取处理，例如可用氯仿，丙酮，二乙醚，苯，甲苯，二甲苯，甲醇，乙醇，异丙醇，正辛醇，四氢呋喃或它们的混合物，温度为0℃-20℃，优选2℃-10℃，历时1-8小时。据说血清蛋白可保留其原来活性的50-90%，但是，同时也明确指出，应当避免30℃以上的温度，因为这会使对血浆蛋白的损害进一步提高。这种方法具有这样的缺点，即只能消除那些具有脂类结构的感染物质，而那些具有不同结构的就无法消除。
在美国书第4490361号中，揭示了一种对血浆蛋白各部分加热而使病毒灭活的处理方法，其中包括，将蛋白部分的干粉混到有机液中形成一种悬浮液，以选定的温度及选定的时间对该悬浮液加热，使得任何伴随着生物材料的病毒灭活，并且同时基本上保留蛋白部分的生物学活性，然后，从悬浮液中回收蛋白部分。根据其公开内容，这一方法可以配以烷液进行，例如，己烷，庚烷，酮类，如丙酮，二乙酮，全氟化学品，例如全氟代三丙基胺，其中，当为AHF-粉末时，在60℃加热10小时，可使样品保留其加热前AHF活性的59.7-70.7%。
令人惊奇地是，现在已经发现对在有机液中的悬浮蛋白部分进行加热，有可能有效地进行巴氏消毒处理血浆蛋白各部分，并且蛋白部分的活性损失很小，条件是，用作热传导介质的有机液对血浆蛋白各部分具有“很轻微的变性作用”，而且与这种热传导介质形成的悬浮液的全部水含量不超过每体积的1%(重量)。根据本发明的方法，可以稳定第地得活性损失低于10%的结果，甚至对因子Ⅷ浓缩物也是一样。
本发明涉及对血浆蛋白或血浆蛋白各部分的巴氏消毒方法，其中包括将血浆蛋白或血浆蛋白各部分悬浮于其所不溶物的有机热传导介质中，血浆蛋白或血浆蛋白各部分是经过冷冻干燥后基本干燥形式的，所述的介质(1)为液态并且在进行巴氏消毒时的温度下不会分解，而且(2)被定为轻微变性级，因为在预先的试验中，因子Ⅷ浓缩物在其中以60℃加热2小时，保留了加热前生物活性的75%以上，或者悬浮于两种或两种以上前边所述的有机热传导介质的混合物中，条件为它们相互之间完全可混溶，而且，所选用的一种或多种热传导介质的水含量，它们对每单位重量的血浆蛋白或血浆蛋白各部分的数量，以及血浆蛋白或血浆蛋白各部分的水含量是这样选择的，即这样获得的悬浮液的全部水含量不超过每体积1%(重量)，并且在至少55℃的条件下以能够消灭任何所存在之病原体的时间对所获的悬浮液加热。
本发明基于这样一种令人惊奇地发现，即不是所有的有机溶剂或其它液体惰性物质在巴氏消毒温度下均对血浆蛋白有强烈的变性效应，这一点在EP-A0112563中已被证实，即使用30℃或更高的温度。相反，存在有这样一些有机溶剂，它们可以加热至常规的巴氏消毒温度，并且不使悬浮于其中的血浆蛋白受到明显程度的损害，假如所用的是基本上干燥的形式。将有机化合物定级为“轻微变性”(不超出本发明中的含义)的选择试验，按下述进行1克冷冻干燥的AHF粉末，其带有的最大水含量为1%(重量)并具有特异因子Ⅷ活性约为0.7单位/毫克蛋白，以100毫升待测的热传导介质将其保存于旋转蒸发器的旋转烧杯中，或保存于带有回流浓缩器的搅拌器中，时间为2小时，以水浴保持温度在60℃，分别进行旋转或搅拌。悬浮的蛋白用减压或不用减压过滤，并且用约50毫升高度挥发性的溶剂洗两次，该溶剂要能与所用的热传导介质完全混溶。在空气干燥和真空干燥后，对这样获得的制剂，根据Simone，ven der Heiden，Abilgaard，J.Lab-Clin.Med 69.706，1967所述，测定因子Ⅷ。
满足本试验要求的溶剂，优先发现于脂族烃，环脂烃或芳香烃，具2个碳原子以上的脂族单醇，和油性物质，如硅油和石蜡油中。
在大多数情况下，酸类不能满足该试验的要求。强极性溶剂，如二甲基甲酰胺和乙腈也同样适用。氯仿在本发明的意义之内也具有过大的变性效应。
以下给出的是经过上述方法试验的一些溶剂代表的变性值，它们满足获取至少75%活性的要求。所有这些溶剂，除了下边给出较高水含量的之外，均用于前期分析质量。
表1热传导介质 60℃加热2小时后的活性值以原活性的百分数表示环己烷(H2O低于0.01%) 99.1正庚烷(H2O低于0.01%) 99.5苯(H2O低于0.03%) 99.2高流动性石蜡油(根据USP) 99.7正丙醇(H2O低于0.2%) 98.0正辛醇(H2O低于0.1%) 81.7异丙醇(H2O低于0.2%) 96.02-丁醇(H2O低于0.2%) 97.8异丁醇(H2O低于0.2%) 93.0叔丁醇(H2O低于0.1%) 91.7相对比正丁醇(H2O约0.4%) 88.1正戊醇(H2O约0.4%) 78.0对甲苯，二甲苯，乙酸丁酯或二乙醇-甲醚这些溶剂也取得了同样好的结果。
相反，其它溶剂，例如以下给出的，在处理之后，得到的活性值均低于起始活性的75%，并且被定为不适宜的那一等级。
表2热传导介质 60℃加热2小时后的活性值以原活性的百分数表示甲醇(H2O低于0.2%) 完全变性乙醇(H2O低于0.2%) 69.8四氢呋喃(H2O低于0.1%) 71.2甲乙酮(H2O低于0.2%) 71.0乙酸乙酯(H2O低于0.2%) 73.7乙腈 67.7二甲基甲酰胺 46.4己酸 完全变性氯仿(H2O低于0.1%，用1%乙醇稳定) 46.5乙二醇 完全变性设想的作为本发明方法之热传导介质的溶剂应该尽可能的不含水，以保证所获得的悬浮液的水含量不超过1%(重量)。因为如果在巴氏消毒系统中有少量的超过重量1%的水，则会导致很大程度变性。例如，当用叔丁醇时，有超过约2%的水，则使变性效应达到这样的程度，即试验中的特征性数据仅为65.9%。
还应注意的是，也应使蛋白部分尽可能地干燥。实际上，蛋白部分的水含量不应超过重量的1%，以使得整个巴氏消毒系统中的水含量低，并且不必使用大量的热传导介质。例如，当1公斤水含量为1%(每单位重量)的蛋白部分悬浮于5升含水量为每单位体积0.01%的庚烷中，导致悬浮液的水含量为2.1克/升或每单位体积重量为0.21%。如果想使水含量减少到0.2%以下，应该对每公斤蛋白部分使用多于5升的热传导介质。
如果所用的热传导介质是不能与水相混溶的，就应该比使用可与水混溶的热传导介质时，对整个巴氏消毒系统中的水含量给予更多的注意，这样的话，大概就可以进一步避免直接作用于血浆蛋白。例如，当在悬浮液中有每单位体积仅为重量的0.2%水时，则正庚醇的变性效应就升高到这样的程度，即在上述试验中只保留了原活性的63.3%，相反，当使用正丙醇作为热传导介质时，如果在系统中每单位体积的水含量为0.2%(重量)，则仍有83.8%的原活性被保留，甚至对正丁醇和正戊醇来说，当水含量约为0.4%时，仍然可以满足试验的要求，正如表1所示。
一般而言，当使用可与水混溶的热传导介质时，每单位体积悬浮液的水含量最好不超过重量的0.5%，当使用不与水混溶的溶剂时，则建议使每单位体积悬浮液的水含量低于重量的0.2%。这些建议的系统中水容量的限度仅仅是指导性的数值，因为根据溶剂和所使用的血浆蛋白来讲，这些数值会有变化。然而，在任何情况下，均建议在使用一种溶剂之前，首先用上述的试验检定其适宜性，以避免不必要的失败。
如果所用的热传导介质在选定的巴氏消毒温度为挥发性的，那么就应以适当的方法，例如使用回流浓缩器，保证在巴氏消毒过程之中其体积保持基本恒定。
根据本发明所选择的热传导介质，如果是完全可以溶混的，则就可以单独使用及相互混合使用。
根据本发明的巴氏消毒的处理时间和温度，依据的是对血液各部分进行巴氏消毒的常规数据。当然还应该考虑热传导介质的沸点，一般建议使用55～65℃的温度和8～12小时的时间进行巴氏消毒，因为这可以使轻微变性的优点与有效地消灭传染物质相互结合起来。当然，在大多数情况下，使用上述时间和温度的处理，变性效应会升高，所以稍高的变性率是可以预见到的，但是，与先有技术的方法相比较，还是更为优选的。例如，当以正庚烷作为热传导介质并在98.4℃巴氏消毒2小时后，仍发现有53.2%的原活性。
一般而言，可以使用50～120℃的温度和2～20小时的巴氏消毒时间，但是，也可有另外的一些变化形式，例如，电击式地仅加热几秒钟的方式。在这种情况下，我们首先推荐使用高沸点的热传导介质，例如，高沸点的芳香烃，如甲苯，二甲苯，硅油及石蜡油。但先决条件是要能保证有效地消灭传染性物质。
根据本发明完全巴氏消毒后的混合物，其处理方法很简单。所使用的热传导介质可在减压或不减压的条件下过滤除去。
如果所用的热传导介质挥发性低或沸点高，则最好用挥发性高的并且能与所用传导介质混溶的溶剂，将所剩的血清蛋白洗一次，洗数次则更好，然后使制剂干燥。此后，还可用任何常规的生产血浆蛋白制剂的方法进一步处理，例如，溶于水中，与其他的添加剂混合，调至所规定的浓度。由于正己烷具有高度的挥发性，所以，已经证明是在很多情况下的特别适宜的清洗溶剂。
然而，其他的挥发性溶剂，例如二乙醚及丙酮也可使用。
另一种处理方法，是适用于使用了可与水混溶的热传导介质的情况，其包括，在完成了巴氏消毒之后，使悬浮液冷却，用水稀释，直至血浆蛋白已进入到溶液中。这样获取的溶液在大多数情况下均为乳光的，可用常规蛋白沉淀剂将血浆蛋白从其中沉淀出来，例如使用乙醇，聚乙二醇，甘氨酸，脱盐剂，例如NaCl，硫酸铵，以及将这些沉淀剂相结合使用，然后进行通常的最后处理。
用根据本发明的方法，可以对冷冻干燥的血浆蛋白成功地进行巴氏消毒。特别用于新鲜血浆，免疫血清球蛋白，均可用于静脉内和肌肉内注射，冷沉淀物，Cohn Ⅰ部分，因子Ⅷ浓缩物，因子Ⅸ浓缩物，凝血酶原复合物，血纤维蛋白原，粘连蛋白和抗凝血酶Ⅲ，它们都是以冷冻干燥状态应用的。这样，就达到了良好的预防传染的效果。
以下实施例进一步详细说明本发明的方法。在所有实施例中，所使用的蛋白部分的水含量都低于重量的1%，热传导介质均具有上述表1给出的质量。
实施例1新鲜血浆的冷冻干燥粉悬浮于热传导介质正庚烷中，每克新鲜血浆用100克热传导介质。然后将悬浮液在旋转蒸发器中以60℃巴氏消毒10小时。巴氏消毒后，将沉淀从正庚烷中过滤出来，然后用正己烷洗两次，先在空气中干燥，再用真空干燥之。
这一新鲜血浆中的各部分的生物学活性，达到下面的相对于巴氏消毒前起始数值的百分数。
因子Ⅷ 92.3%因子Ⅸ 93.2%因子Ⅱ 89.0%免疫球蛋白Ig G 97.0%Ig A 99.5%实施例2冷冻干燥的静脉内注射的免疫球蛋白按实施例1所述，在正庚烷中以60℃巴氏消毒10小时，并且按实施例1处理。巴氏消毒后，免疫球蛋白显示出以下的特征性数据1)用超速离心确定聚合物含量巴氏消毒前 巴氏消毒后聚合物及二聚体 8%(相对) 9.5%(相对)单聚体 92%(相对) 90.5%(相对)其中没有显著的变性。
2)抗补体的活性巴氏消毒前 巴氏消毒后对100%补体的百分数 16% 12%因而，作为巴氏消毒的结果，抗补体活性不仅没有升高，反而下降了。
3)放射性免疫扩散巴氏消毒前 巴氏消毒后Ig A 120mg/dl 115mg/dlIg G 4820mg/dl 4560mg/dl实施例3冷冻干燥的肌肉注射用免疫球蛋白，用正庚烷作为热传导介质，以60℃的温度按实施例1所述进行巴氏消毒10小时，然后按实施例1过滤和处理。巴氏消毒后的免疫球蛋白显示出以下数值用超速离心确定的聚合物含量巴氏消毒前 巴氏消毒后聚合物 1.9% 2.5%二聚体 15.1% 16.8%单体 83.0% 80.7%其中没有显著性地生成凝聚物。
实施例4冷冻干燥的凝血酶原复合物，按实施例1所述，用正庚烷作为热传导介质以60℃巴氏消毒10小时，然后按实施例1所述进一步处理。
其结果，因子Ⅸ的活性为90.3%，因子Ⅱ的活性为93.0%，因子Ⅹ的活性为97.3%。没发现有活化的因子。
实施例5冷冻干燥的血纤维蛋白原按实施例1所述，用正庚烷作为热传导介质，以60℃巴氏消毒10小时，并且按实施例1处理。
巴氏消毒前的可凝蛋白占总蛋白95%
巴氏消毒后的可凝蛋白占总蛋白93%超速离心检测沉降常数7.6s 13.4s 18.6s 21.3s巴氏消毒前(相对百分数) 76.2 16.8 4.4 2.6巴氏消毒后 77.0 15.8 4.7 2.5实施例6具有特异活性为0.7单位因子Ⅷ/毫克蛋白的冷冻干燥AHF粉(含有少量的柠檬酸盐，氯化钠和甘氨酸)，用下表给出的热传导介质，在60℃巴氏消毒10小时。按实施例1处理，在所有情况下均以正己烷作为洗液。活性结果总结于下表中表3热传导介质 活性结果%环己烷 93.2正庚烷 93.0苯 92.2石蜡油 87.2硅油 87.2实施例7将具有抗凝血酶Ⅲ活性为97国际单位的冷冻干燥抗凝血酶Ⅲ浓缩物的粉末50毫克悬浮于20毫升正庚烷中，以60℃巴氏消毒10小时。用减压过滤出固体，以正己烷洗，然后真空干燥。对这样获得的经巴氏消毒的抗凝血酶Ⅲ浓缩物，按J.Fareed，H.C.Messmore和J.U.Balis，Chromogenic Peptide Substrates，pages 183～195，Churchill-Livingstoe，Edinburgh 1979所述的方法来测定其活性。经巴氏消毒的产物在此显示出的活性为原始活性的93.6%。
实施例8具有特异因子Ⅷ活性约0.7单位/毫克蛋白的冷冻干燥AHF粉末0.5克悬浮于40毫升异丁醇中，在带有回流浓缩器的搅拌器内搅拌加热共16小时，同时用水浴加热至60℃，活性结果以占原始活性的百分数表示，是在规则的间隔时测定的。处理时，经巴氏消毒的蛋白以减压过滤从热传导介质中分离出来，然后用正己烷洗两次。产物在真空中干燥。所获的活性结果总结于下表中。
巴氏消毒的时间，小时， 活性结果0 100%2 93.0%4 87.8%8 81.7%10 77.7%16 69.5%
权利要求
1.一种对血浆蛋白或血浆蛋白各部分进行巴氏消毒的方法，其特征在于，将由冷冻干燥获得的基本干的血浆蛋白或血浆蛋白各部分悬浮于其所不溶的有机热传导介质中，所述的介质1)为液体并在巴氏消毒的温度下不分解，而且2)被定为轻微分解一级，因为在前面的试验中，因子Ⅷ浓缩物在其中以60℃加热2小时后，仍保留了其加热前生物学活性的75%以上，或悬浮于两种或两种以上的所述有机热传导介质的混合物中，条件是介质相互之间完全混溶，其中，所用的热传导介质的水含量，每单位重量的血浆蛋白或蛋白部分所用的介质量，血浆蛋白或蛋白各部分的水含量要这样选定，即此后所获的悬浮液的总水含量不能大于每体积1%(重量)，将所获的悬浮液加热到至少55℃，加热时间为足以消灭任何存在着的病原体的时间。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中悬浮液的体积在加热期间保持恒定。
3.根据权利要求
1所述的方法，其中所用的热传导介质是不与水混溶的，或者与水混溶的程度不大于体积的5%，并且以该介质制备的悬浮液的水含量低于每体积0.2%(重量)。
4.根据权利要求
1所述的方法，其中所用的热传导介质是与水混溶的程度超过体积5%的热传导介质，而且悬浮液的水含量不超过每体积0.5%(重量)。
5.根据权利要求
1所述的方法，其中包括将血浆蛋白或血浆蛋白各部分从已经加热过的悬浮液中过滤出来，用能与所用热传导介质混溶的高度挥发性溶剂洗，然后在温和条件下干燥。
6.根据权利要求
1所述的方法，其中所用的热传导介质是与水混溶的程度大于体积5%的热传导介质，加热完成后冷却悬浮液，在搅拌条件下加入水，加入的水量是足以使血浆蛋白或血浆蛋白各部分溶解于热传导介质和水组成的混合物中，用蛋白沉淀剂将血浆蛋白或血浆蛋白各部分沉淀下来，将沉淀的血浆蛋白或血浆蛋白各部分分离出来。
7.根据权利要求
1所述的方法，其中的加热是在55-65℃进行8-12小时。
8.根据权利要求
3所述的方法，其中所述的热传导介质是脂族烃。
9.根据权利要求
1所述的方法，其中所述的热传导介质是环脂烃或芳香烃。
10.根据权利要求
9所述的方法，其中所述的热传导介质是环己烷或苯。
11.根据权利要求
1所述的方法，其中所述的热传导介质选自具有至少3个碳原子的脂族单醇。
12.根据权利要求
11所述的方法，其中的热传导介质是具有3至8个碳原子的脂族单醇。
13.根据权利要求
1所述的方法，其中的热传导介质选自由石蜡油和硅油组成的组中。
专利摘要
粉末状的经冷冻干燥基本至干的血浆蛋白质的巴氏消毒方法，将其悬浮于有机热传导介质中，介质在巴氏消毒的温度下为液态并且不分解，对血浆蛋白具有“轻微的变性”效应。介质优先选自由脂族烃，环脂烃，芳香烃，具有至少3个碳原子的脂族单醇和油类物质组成的组中。将要进行巴氏消毒的悬浮液的水含量一定不能大于体积重量的1％。
文档编号A61L2/04GK86101774SQ86101774
公开日1987年10月7日 申请日期1986年3月19日
发明者沃特·多莱施尔, 海尔穆特·卡尔茨施米德 申请人:施瓦布有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan