专利名称：雏鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡痘鹌鹑化物毒三联活疫苗的制造方法
技术领域：
本发明是一种预防雏鸡新城疫(简称ND)、鸡传染性支气管炎(IB)和鸡痘(AP)的弱毒三联活疫苗的制造方法，属于鸡流行病的预防范畴。
鸡新城疫(ND)是鸡的一种急性传染病，世界各地都广泛流行，其中亚洲地区流行最广泛。我国民间简称“鸡瘟”。该病传播快，尤其易感雏鸡，死亡率可高达90-100%，对养鸡业危害极大。鸡传染性支气管炎也是一种急性、高度接触性传染病，主要发病在气管的下三分之一处。本病在美国、加拿大、英国和日本传播得很广泛，危害是影响母鸡产蛋量。鸡痘(AP)也是一种由病毒引起的接触性传染病，世界各地都有发生，发病时在皮肤或口腔和喉部粘膜上发生特殊的痘疹，发生在皮肤的称皮肤型鸡痘，发生在口腔和喉部的称白喉型鸡痘。该病传播快，死亡率较高，严重地威胁着养鸡业的发展。
目前对这三种鸡病无特效药物治疗，最好的方法是用接种疫苗预防。而疫苗的制造，目前国内外均为单价或二联弱毒的混合冻干活疫苗。鸡新城疫的单价苗主要有鸡新城疫Ⅰ系、Ⅱ系、F系和Lasota系弱毒疫苗。鸡传染性支气管炎的单价苗是鸡传染性支气管炎弱毒疫苗，鸡痘疫苗主要是鸡痘弱毒疫苗、鸽痘弱毒疫苗和鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗。二联弱毒的混合冻干活疫苗主要是鸡新城疫和鸡传染性支气管炎的混合冻干活疫苗以及鸡新城疫和鸽痘的用于预防鸡新城疫和鸡痘的二联弱毒混合冻干活疫苗。目前国内外未见有预防鸡病的任何三联弱毒疫苗的报导。
上述单价疫苗的基本制造方法是将毒种接种于10-11日龄的发育良好的鸡胚绒毛尿囊膜或尿囊上，在37℃孵化箱孵育一定时间(如鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗需96-120小时，鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗为5天，而鸡传染性支气管炎弱毒疫苗需30-36小时)后收获鸡胚液或绒毛尿囊膜制苗。二联弱毒混合冻干活疫苗则是将单价苗按一定比例充分混匀后制成。单价苗和二联混合苗的主要优点是制造工艺相对简单，但不足之处是接种预防操作时，因使用的是单价苗或二联苗，所以在接种刺种时，每只鸡需三针(至少二针)点刺，才能完成操作工序。给实际操作人员带来了麻烦，浪费了人力，增加了劳动强度。而且，单价苗的收获量较低，平均为8-10毫升/蛋，耗费鸡蛋较多。同时作为单价苗使用时，给包装、运输和预防注射带来不便。
本发明的目的在于找出毒力相当且无干扰的毒株，使鸡新城疫和鸡痘两种病毒被同时接种于一个鸡胚内，并使其同步繁育后收获全胚，制造出二联弱毒活疫苗，然后加鸡传染性支气管炎弱毒疫苗制苗材料制成三联弱毒活疫苗，从而达到大幅度节约制苗材料和一针就能预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡痘这三种传染病的预期效果。
本发明的技术特征是以鸡新城疫Ⅱ系株与鸡痘鹌鹑化弱毒稀释后，两者等量混合，接种于孵育发育良好的鸡胚上，经孵化后，收获全胚制成一蛋苗;将鸡传染性支气管炎毒种稀释后，接种于鸡胚上经孵化后收取全胚，将收获的上述两种全胚按比例制成三联弱毒疫苗。
下面结合实施例具体说明制造三联弱毒疫苗的操作步骤及其检验方法一、毒种及毒种继代毒种为鸡新城疫Ⅱ系(NDⅡ系)、鸡传染性支气管炎H120系(IB H120)及鸡痘鹌鹑化弱毒(AP)，都是弱毒力毒种，均由由中国兽药监察所鉴定、保管和供给，复壮后的毒力标准及继代、保存等方法必须符合中华人民共和国农牧渔业部部颁标准NY33-84、NY34-84和NY107-84方可使用。
二、疫苗制造及冻干1、鸡蛋的选择和孵化鸡蛋采用受精率较高，确为健康鸡群所产的新鲜鸡蛋，清洗蛋壳外污物，并用4%碘酒消毒，然后置38.5-39℃孵化箱内孵化，其相对湿度最好保持在60-70%。
2、毒种接种以NDⅡ系株150倍稀释与AP鹌鹑化弱毒100倍稀释，两者等量混合的毒种0.4ml，接种于孵育11日龄发育良好的鸡胚尿囊腔，接种后，封死针孔，置37℃继续孵化，此后可不翻卵。为一蛋苗。
将IB H120毒种10倍稀释，以0.1毫升接种于10-11日龄鸡胚尿囊内，接种后，将卵壳外的钻孔用蜡封闭，放置于37℃孵化箱孵化30-36小时，弃去死胚，气室向上放4℃冷却4-24小时。
3、收获一蛋苗鸡胚接种后96小时以前死亡者弃去不用，96小时后4-8小时照蛋一次，取出死胚放4℃冷冻保存(96-144小时死胚，经培养无菌，绒毛尿膜鸡痘病变明显者亦可用于制苗)，接种后144小时将全部活胚收获，气室向上放4℃冷却4-24小时致死。用无菌手术取有水肿增厚或有痘斑的整个绒毛尿膜，置灭菌容器内结冻保存。同时吸出全部鸡胚尿液(勿使卵黄破裂，凡混有卵黄的黄色鸡胚液一律弃去不用)，将胚液、胚膜分组置于灭菌瓶中，分组时凡死胚液为一组，活胚液为一组。活胚组HA价应达640倍以上才用，将以上收获合格的胚液、尿膜分别按每毫升加入庆大、卡那及双抗各1000微克单位，置4℃处理，作无菌检查，无菌者为ND、AP制苗成分。
收获IB H120鸡胚，用无菌手术收获鸡胚液(注意勿使卵黄破裂)，同时收获绒毛尿膜，分别编组，按每毫升加入庆大、卡那及双抗各1000微克单位，放4℃条件处理后作无菌检查，HA为阴性，作为制苗的第三种成分。吸取鸡胚液和绒毛尿膜时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败弃去不用，一蛋苗的鸡胚液常有呈乳白色者，视为正常，而IB鸡胚液混浊者应弃去不用，IB鸡胚的绒毛尿膜无增厚病变者不用。而一蛋苗的绒毛尿膜呈鸡痘典型病变者使用。
4、制配疫苗(1)将合格一蛋苗的绒毛尿膜称重后，加一倍量一蛋苗鸡胚液(即每1克膜加胚液2毫升)与庆大、卡那及双抗各1000微克单位，进行磨制，用120目铜丝布滤过，除去陈渣，并按陈渣量补足一蛋苗鸡胚液，作无菌检查，放4℃冷藏备用。
(2)将二份IB H120合格的鸡胚液，与一份IB H120绒毛尿膜进行磨制，除渣，过滤，补足鸡胚液，加抗，无菌检查均同以上方法，该滤液应无任何细菌生长，为本苗第三份。
5、分装及冻干将以上收获的绒毛尿膜滤液及鸡胚液，按以下比例混匀。(即1份一蛋苗绒毛尿膜滤液，1份IB绒毛尿膜滤液加1份一蛋苗鸡胚液)，按适当比例加入无菌5%蔗糖牛奶保护剂，为了避免在配苗、分装、冻干对毒价的损失，可加微量鸡胚液(微量指不超过配苗量的1/5)，立即分装冻干。
三、疫苗检验1、无菌检验及病原性鉴定按《成品检验的有关规定》进行。
2、安全检验将三联干苗用生理盐水按原量还原，作5倍稀释后点眼并翅膜皮肤划痕接种10只1-7日龄非特异健康敏感雏，每只约0.1ml，观察14天，观察期间有2只以上的雏由于非特异性死亡应重作安检。接种疫苗后雏应无任何反应，或仅有1只雏出现非特异性死亡，判合格。
3、效力检验(1)、用雏检将三联干苗用生理盐水按原量还原，并作100倍0.1ml皮下翅膜接种免疫7-14日龄非特异性健康敏感雏10只，10-14天后连同对照雏10只，每只雏用10倍稀释的IBVM系强毒滴眼2滴，观察10天免疫雏保护率应在80%以上，对照组发病不低于80%，疫苗判合格，若死亡超过此数且证明死亡是由非特异性死亡可重检一次。
将IB效检耐过的雏，攻APV系强毒102株E4冻干毒复壮的鸡胚绒毛尿膜1000倍稀释液1毫升肌肉注射，观察10天，免疫组不应发全身痘及其他反应，并全活;对照组3只同龄雏鸡，应发局部痘肿乃至全身痘或死亡，疫苗判为合格。否则另选非特异性健康雏鸡10只，对照组3只重检1只。
再将AP效检耐过的雏鸡挑选5只(若不足5只时应重复新免疫，剂量方法同上)与另外3只同龄无ND免疫力的对照雏鸡，同时肌肉注射1-5万倍NDV系强毒1毫升，观察10-14天免疫组全部健活，对照组全部发病或部分死亡，疫苗判为合格。否则，可重检1次。
(2)、用鸡胚检将疫苗用无菌生理盐水还原后，作10-3稀释分别放入3个试管中，每管1毫升，第1管加入等量抗IB和ND高免血清，第2管放入等量抗ND和AP高免血清，第3管加入等量抗IB和AP高免血清，放24-30℃中和1小时后，中间摇2次，测ND的HA价为0倍。
第一管继续稀释至10-5，用11-12日龄非特异鸡胚5个，分别接种0.3ml(其中实含AP弱毒0.1ml)于绒毛尿囊膜上，接种后96-144小时判定，全部鸡胚绒毛尿膜水肿，增厚或痘斑，疫苗的AP成份判为合格，否则可重检1次。
第二管继续稀释至10-6，尿囊内接种10日龄非特异鸡胚5个，每个0.3ml(其中实含IB H120弱毒0.1ml)，观察6天，接种鸡胚应在2-6天死亡，或至6天时存活的鸡胚中部分出现胎儿失水、卷缩、发育小(接种胎儿比对照中最轻胎儿重量低2克以上，作为参数据)，死胚数和胎儿出现非特异病痕在总和应在50%以上，则IB成份判为合格，不合格时可重检一次。
第三管再继续作10-6、10-7、10-8三组，每组接种非特异鸡胚5个，每个胚接种0.3ml(其中实含NDⅡ系弱毒0.1ml)，48小时前死亡的鸡胚不计，随时取出48-120小时死亡的鸡胚，收获鸡胚液，同组等量混合，至120小时取出活胚逐个收获鸡胚液，分别测HA价，1∶160以上判为感染，计算EID50应≥10-7/0.1ml，ND成份判为合格。不合格可重检一次。
(3)、效力检验和毒种继代用鸡胚来源，应来自未感染过ND、IB、AP及未经预防注射的健康敏感雏鸡。
四、疫苗的保存和使用1、疫苗保存25℃不超过15天，4℃不超过1年，-16℃不超过1年半。
2、疫苗使用疫苗适用于7日龄以上健雏(在疫区亦可用于1日龄雏)。将疫苗作100倍稀释，在翅膜皮内侧无血管处注射0.1ml，亦可每雏点眼两点，并同时在翅膀内侧无血管处刺种两针。若用于喷雾免疫，可用10%甘油水将苗稀释100倍，每只雏按喷足0.5ml剂量使用。为了加强免疫力，第一次注苗后，隔20天按以上使用方法补种一次。
本发明制造的疫苗，将三种不同的疫苗成分联合在一起，不仅相互无干扰，而且还具有以下的积极效果1、用本发明方法制造三联弱毒疫苗，尽管制造工艺稍微复杂一些，但用料比单价苗节省得多，即一个鸡蛋经接种弱毒后，除卵黄外，都可利用，比单价苗节省材料一倍以上。而且收获量较高，平均为12-15毫升/蛋，提高了使用率，降低了制苗成本，其经济效益十分显著。
2、用本发明的方法制造的三联弱毒疫苗，经三年九批的研究证明ND、IB弱毒接种雏鸡彼此间干扰甚微，在六个鸡场对不同品系、不同年龄、不同性别的15万羽肉用、蛋用、商品和种鸡的实际应用，证明本苗100%安全，保护率85%以上。
3、本疫苗在效检上，采用了用一只鸡攻三种强度的方法，既切合实际，又节省了效检材料。
4、用本发明的方法制造的三联弱毒疫苗，打一针即可有效地预防鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡痘等三种传染病，从而减少预防注射次数，省工、省时，提高了工作效率和预防效果。
权利要求
1.一种用于预防雏鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)和鸡痘(AP)的弱毒疫苗制造方法，所用毒种为鸡新城疫Ⅱ系、鸡传染性支气管炎H120系(IBH120)及鸡痘鹌鹑化弱毒毒种，其特征在于将鸡新城疫Ⅱ系弱毒毒株与鸡痘鹌鹑化弱毒毒种同时接种于孵育发育良好的鸡胚上，经孵化后，收获全胚制成一蛋苗，并与鸡传染性支气管炎弱毒疫苗制苗材料按比例混合制成三联弱毒疫苗。
2.根据权利要求1所述的疫苗制造方法，其特征在于接种时，将鸡新城疫Ⅱ系弱毒作200倍稀释(对非免疫受精卵)或作150倍稀释(对免疫受精卵)，鸡痘鹌鹑化弱毒作100倍稀释，进行等量混合。
3.根据权利要求1所述的疫苗制造方法，其特征在于接种鸡胚为11日龄发育良好的鸡胚，接种处为鸡胚尿囊腔，最佳接种量为每胚接种0.4毫升。
4.根据权利要求1所述的疫苗制造方法，其特征在于对接种后120小时不死的鸡胚，可以延长至144小时收胚。
5.根据权利要求1所述的疫苗制造方法，其特征在于收获的全胚包括接种孵化后96-144小时的死胚和接种后144小时的全部活胚，分别收获其鸡胚液和绒毛尿膜。
6.根据权利要求1所述的疫苗制造方法，其特征在于制三联弱毒疫苗的成分配比为1份一蛋苗绒毛尿膜滤液、1份含有鸡传染性支气管炎弱毒的绒毛尿膜滤液及1份一蛋苗鸡胚液。
7.根据权利要求1和6所述的疫苗制造方法，其特征在于，一蛋苗绒毛尿膜滤液可由一蛋苗绒毛尿膜加一倍量的一蛋苗鸡胚液制成，含有鸡传染性支气管炎弱毒的绒毛尿膜滤液可由IBH120绒毛尿膜加一倍的IBH120鸡胚液组成。
8.根据权利要求1所述的疫苗制造方法，其特征在于，进行疫苗雏鸡效力检验时，可以使用7-14日龄雏鸡。
9.根据权利要求1或8所述的疫苗制造方法，进行疫苗雏鸡效力检验时，可以在同一接种免疫过的鸡上每隔10-14天分别用IBV、APV和NDV强毒攻毒。
全文摘要
本发明涉及雏鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡痘弱毒疫苗的三联弱毒疫苗制造方法，属于鸡病预防领域。本发明以鸡新城疫II系、鸡痘鹌鹑化弱毒毒种两者等量混合，同时同步接种在同一鸡胚上孵育，收获全胚制成一蛋苗。再与鸡传染性支气管炎弱毒混合配制成含有上述三种成分的三联弱毒疫苗。本苗可以一针预防鸡的三种流行病鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡痘。采用本苗预防简化了操作工序，减轻了劳动强度，节省了制苗材料。
文档编号A61K39/275GK1046851SQ8910285
公开日1990年11月14日 申请日期1989年5月4日 优先权日1989年5月4日
发明者梁圣译 申请人:梁圣译