专利名称：非肠道使用的稳定组份及其制备方法
美国专利U.S.No.4，837，381披露了一种适宜于非肠道使用的、由脂肪或蜡或其混合物和生物活性的蛋白质、肽或多肽组成的微球状组份。该专利披露了在非肠道使用中组份缓慢释放出蛋白质、肽或多肽的应用，还披露了数量在被处理动物的血液中得以用较长的时间提高和维持生长激素增量级的方法，由于该发明的组份的使用，从而增加了哺乳动物的产奶量和动物的重量收益率。
在开发能持久释放出含生物活性大分子药用的组份中，产生一些专门问题，问题起因于大分子的大小和复杂性，尤其是蛋白质和制药用的赋形剂混和时，对加工和贮存时的化学变化和结构变化甚为敏感。这些问题为现有技术的制药配方的熟练人员所周知，可归结为化学稳定性问题。由大分子的结构的不可逆变化导致的不合适的制药组份的化学稳定性以及其与赋形剂的相互作用可能使得组份失活或使组份不能提供出所需要的生物响应的数量。
制药配方中的另一类问题是物理稳定性。一个明显的例子是在加工、包装或贮存时片剂的损耗或注入时的损耗。另一个例子是乳油、糊或凝胶物理性分离而成为各个成分，这将导致活性成份的不均匀分布和稠度变化。配方中的物理性变质的结果将使易于使用的特点荡然无存，对病人用药剂量也无法指明。在制药配方中不太明显的物理变化还包括赋形剂的结晶或显微组织的各种变化。这类变化将导致活性物质释放时的明显改变。应予指出的是，药用剂量在物理稳定性上的改变既可在口服时形成也可在非肠道使用时形成，而最有问题的乃是配料的持久释放。持久释放出活性的药用剂量在商业上是至关紧要的，这些药用剂量在整个批量生产和经长时间的存放后仍保持着释放特性。药用剂量的物理稳定性是用来说明加工性能，例如硬度、流动性、或粘度的恒定性以及药理功能的恒定性。
本发明的一个目的是为非肠道使用提供各种稳定的组份，本发明的另一个目的乃是提供制备这些稳定组份的新颖方法。还有一个目的是提供一种微球状组份，它能作为随时可以用配方加以包装，具有良好存贮性，通过对本发明的说明将使这些目的清晰起来。
本发明关于非肠道使用的意想不到的稳定的微球状组份，按重量计，本组份含约30%至95%脂肪、蜡或其混合物，约2%到70%生物活性的蛋白质、肽或多肽，以及约1%至30%油、半软脂肪、脂肪酸衍生物或其混合物。
本发明还关于在环境温度中制备高稳定组份的方法。使人吃惊的是，已经发现，在造粒之前，将少量油、半软脂肪和/或脂肪酸衍生物加入到脂肪和/或蜡以及生物活性的蛋白质、肽或多肽的混合物中将加速从α晶体结构到β晶体结构的转变。因为β晶体稳定得多，因此本发明的组份显示出稳定性有所增加。令人尤为惊讶的是，本发明认为，在现有技术的组份中作为赋形剂使用的某些油，在造粒后，并不能导致晶体转变的加速。
对推荐实施例的说明本组份适用于动物的非肠道使用。生物活性的蛋白质、肽或多肽包括生长激素、生长调节素，生长因子，和其它的生物活性生成物或其衍生物。
本发明还提供了一种微球状组份，它能够作为即用配方来包装，由于稳定性增加而具有良好的贮存能力。
本发明组份中使用的蜡或脂肪一般其熔点高于40℃。本发明中的蜡可以是Hawley's The Condensed Chemical Dictionary(简明化学辞典)第十一版中提出的蜡，是低熔点的有机混合物或是高分子量的化合物，在室温下是固体，除了不含甘油酯外，在组成上类似脂肪或油类。其中一些是烃，另一些是脂肪酸酯和醇酯。这些化合物包括饱和和不饱和的长链C10-C24脂肪酸、醇，酯，盐，醚或其混合物。它们按类酯来分类。蜡是热塑性的，但它们不是高聚物，因此它们不归入塑料类。共性是防水性、光滑的质地、无毒，无令人不悦气味和颜色。它们是可燃的，有良好介电特性。它们溶解在大多数有机溶剂中，不溶于水。主要种类如下Ⅰ天然1.动物蜡(蜂蜡、羊毛脂蜡、紫胶蜡、中国蜡)2.食物蜡(巴西棕榈蜡、小烛树蜡、月桂子蜡、甘蔗蜡)3.矿物蜡(a)化合蜡或地蜡(地蜡、纯地蜡，褐煤蜡)(b)石油蜡(石蜡，微晶蜡)(疏松石蜡或鳞状蜡)Ⅱ合成蜡1.乙烯聚合物和多醇醚酯(聚乙二醇，山梨醇)2.氯化萘(卤蜡(β氯代萘))3.经Ficher-Tropsch合成的烃类蜡本发明的脂肪可以是Hawley's的简明化学辞典，第十一版中提出的，是较高脂肪酸，例如硬脂酸和棕榈酸的甘油酯。这些酯和其混合物在室温下是固体，显示晶体结构。猪脂和牛脂是其例子。在脂肪和油之间没有化学差别，唯一区别是室温下脂肪是固体，油是液体。术语“脂”(fat)通常是特指三酸甘油酯，而“类脂”(lipid)却包括所有酯。
脂最好是长链C10-C24脂肪酸的单、双、或三甘油酯。单酸、双酸或三酸甘油酯极大部分是由硬脂酸酯、棕榈酸酯、月桂酸酯，亚油酸酯、亚麻酸酯、油酸酯和其残余物或混合物所构成，最好熔点大于50℃。三硬脂酸甘油酯是最值得推崇的脂。此外，脂肪酸的亲脂盐，例如硬酯酸镁及其类似物也都适用。
本发明中的油、半软脂肪或脂肪酸衍生物都是一些能溶解在熔化硬脂中的介质，当溶化硬脂或蜡被造粒后，在室温或接近室温下，它能够使硬脂晶体及一种不大稳定的状态到更稳定的状态的物理转变得以加速。油或半软脂最好包括短链到中链长度脂肪酸，例C2至C18的单、双或三甘油酯的混合物或较纯的构成。半软脂指的是熔点在室温或近室温的甘油酯。脂肪酸衍生物包括短链到中链长的脂肪酸、醇、酯、醚、盐或其混合物。因为，甘醇油和半硬脂是躯体生理组分以及其生物相容性和生物降解性之故而更为适用。
本发明的微球体是分散在制药和药理上可接受的液体中，以获得一种非肠道使用的可缓慢释出的组份，赋形剂可以是水缓冲系统或油系统。油系统可以是动物油或植物油的衍生物或经合成制得。赋形剂最好包括中性的单酸、双酸或三酸甘油酯液体或其混合物。中性油是不含残留酸的油。适宜于本发明组份中使用的赋形剂包括含水系统，(例如缓冲盐水)、有机溶剂(如甘醇和醇类)以及和水不混溶的液体(例如油)，具体使用哪一种取决于使用的活性成份的溶解度。
适宜于本发明组份中使用的生物活性的蛋白质，肽和多肽包括生长激素、生长调节素、生长因子、和其它的生物活性生成物及其衍生物。推荐的蛋白质包括牛、羊、马、猪、鸡和人的生长激素，而蛋白质意指包括天然、合成、重组体或生物合成不源的蛋白质。此外，与生物活性蛋白质、肽和多肽缔合的金属或金属化合物，以及酸盐、衍生物和配合物以及防水合剂等都适于并用在本发明的组份中。
稳定剂、防腐剂、表面活性剂、盐、缓冲剂或其混合物都可有选择地包括在本发明的组份中。推荐的稳定剂包括脱氢乙酸、N-水杨酰苯胺、山梨酸、硼酸、苯甲酸、和其盐类;亚硝酸钠和硝酸钠。根据需要，适于用在本发明中的所述物质的量，按重量计，应在0.1%至20%的范围。
用在本发明的组份中所推荐的表面活性剂含有生物活性大分子，且在性质上是非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯单油酸山梨醇酯(20克分子乙氧基化)，和环氧乙烷以及环氧丙烷的嵌段共聚物。适宜于在本发明中使用的表面活性剂的量，按重量计，约为0.1%至10.0%。
独特的是，已经发现，可以获得生长激素在血液中渐增的含量并使之长期保持下去，由此可通过对哺乳动物注射本发明中含有适当赋形剂的组份而提高哺乳动物的重量收益率和产奶量。血液中生物活性蛋白质、肽和多肽含量的提高一般可以收益的效果和/或治疗效果的结合而观察到。这些效果包括哺乳动物的重量收益率，生长率提高，奶产量增加，联系到培育被处理动物的后代而获得的增产奶量，增加了肌肉的大小，提高了饲料效率，降低了躯体脂肪，提高了瘦肉脂肪比。将血液中含量的提高保持下去则表明活性成份在慢慢的释放。例如奶产量提高，增长率提高，饲料效率提高和瘦肉率的提高的特性，一般都是由于保持在血液提高了的活性成份而观察到的。本发明包括了组份的应用，由于增加和保持了动物血液中激素的含量而提高了产奶量，提高了增长率，提高了饲料效率和提高了瘦肉率。
本发明的实施例包括了生物活性的蛋白质、肽和多肽掺杂在脂或蜡微球体中，而经选用的油或半软脂也含有上面提到的赋形剂的部分或全部，然后将它们都分散在赋形剂中。微球体，最好是脂微球体，直径在1000微米以内，重体平均尺寸范围是25至300微米，将这种大小的微球体用在非肠道使用的配方中，含70%以内的生物活性的蛋白质、肽和多肽的微球体根据活性成份的溶解度和蜡或脂，表面活性剂，缓冲剂和所使用的赋形剂的性质而在各个时间段内显示出其持久的释放能力。
广义地讲，本发明涉及缓慢释放的组份，组份由脂或蜡或其混合物，生物活性蛋白质、肽或多肽药物以及油、半软脂、脂肪酸衍生物或其混合物(都分散在制药和药理可接受的赋形剂中)等加以混合所构成。微球体和涂复的蛋白质粒子可以存在于缓慢释放的组份中。组份可以是溶解在脂或蜡的蛋白质，也可以是活性成份对脂或蜡的疏水相互作用或键合到脂或蜡上。为使用激素，组份含有按重量计，约1%至70%生长激素，生长调节素，生长因子或生物活性生成物或其衍生物，其重体平均粒度最好小于20微米;约5%至60%最好是10%至48%的脂、蜡或其混合物;约1%到30%最好是5%到20%油;任选的赋形剂约15%，例如表面活性剂、稳定剂、防腐剂、盐或缓冲剂或其混合物，并含有足够量的制药和药理可接受的液体赋形剂，总量为100%。赋形剂又是上面提到的水性缓冲系统或油系统。
为了生长激素，(例如牛生长激素)的非肠道使用，按重量计，微球体含5%至40%固体激素，其重体平均粒径最好小于20微米，含有上面提到的约20%其它赋形剂，赋形剂在约40%至95%脂或蜡或其混合物中;其重体平均粒径为25至300微米，这样的微球体使激素持久的释放出来并使奶牛的产奶量增加到约2周。这些推荐的组份显现出奶产量有所增加，增加的奶量可与每天注射牛生长激素所增加的量相匹敌。
为了使用含有水溶性蛋白质、肽或多肽的组份，例如牛生长激素，较好的是用和水不混溶液体，最好是用油或液脂以及和水不混溶的醇和甘醇及其混合物。所选的赋形剂要能够将微球体混合物分散开来并加以涂复，还能够提供可接受的注射混合物的粘度，利用HLB值(亲水亲油平衡值)和粘度值作为选用的标准。
根据这一点，在环境温度下呈液体的脂肪酸甘油酯包括合成油;植物油，(例如橄榄油、麻油、花生油、葵花油、豆油、棉仔油、玉米油、红花油、棕榈油、菜油和椰子油);动物油(如鱼油、鱼肝油、鲸油);或其衍生物及其混合物，其HLB值的范围1至5，粘度的范围为10至1000厘泊，粘度用Brookfield粘度仪RTV＃1锭加以测定，找到本发明的组份中使用的赋形剂。
本发明的微球体系将具有符合粒度要求的活性成份和其它赋形剂与熔脂、蜡或其混合物加以掺合，再与油、半软脂和/或脂肪酸衍生物加以混合，再将形成的混合物用各种办法，例将混合物乳化或雾化(或造粒)后形成球体，或将各组份和熔脂，蜡或其混合物加以混合，进行机械加工和利用离心盘加以冷却后形成微球体。此外，将活性成份、赋形剂脂、蜡和其混合物、和油加以混合且经过冷却获得固态物质，再将其用粉碎、研磨和类似方法进行加工。
适于注射用的本发明的混合物易于制备，即将蛋白质、肽或多肽，赋形剂、脂，蜡或其混合物和油在提高温度下直接分散在赋形剂中并加以冷却制得。
大多数脂和脂和/或蜡的混合物通过热熔产生的颗粒的喷淋雾化制得微球体，热熔产生的颗粒用DSC分析证实其结晶种类大多数是很不稳定的α型。例如三硬脂酸酯和三棕榈酸酯一类的硬脂，经喷淋化雾，在典型的室温下贮放几个月之后仍维持α晶态。令人惊奇的是，硬脂与液脂的混合物在熔融掺混和喷淋雾化而形成粒子或微球体时，显示出室温下的从α晶态向β晶态的加速转变，物理稳定性明显提高，使药用的非肠道使用的组份获得意外的成功。根据混合物中成份，这种转变在几小时至几天内基本上完成。硬脂和液脂的合适组份如下99至70份硬脂，硬脂是脂肪酸的单一、双一，或叁甘油酯，脂肪酸主要是链长C10至C22饱和烃，最好是C14至C18，以及1至30份的油，油是烃链长C2至C10的脂肪酸的单一、双一、或叁甘油酯。
用硬脂和液脂以及具有或没有活性物质制成的微球体，其晶体结构自发加速转变的结果是当微球体悬浮在赋形剂中，在典型的室温下贮存或在典型的冷冻柜温度下贮存时，粘度的增加相当慢。链长C2至C12的脂肪酸的液体甘油酯因其优良的生物相容性和生物降解性特别适宜于用作制药的赋形剂。这样产生的微球体一方面能从不稳定的α晶态迅速转变成热动力学上更为稳定的β晶态，另一方面还有下述特性其粉未显示出良好流动性、低粘滞、贮存时低结快性、密度增加、以及物理加工时的更大韧性。此外，这些改进了的微球体配方用于蛋白质、肽或多肽物质的非肠道持久释放，用于保持血中提高的激素含量其目的在于改善和提高美国专利U.S.P4，837，381中披露的重量收益率和/或产奶量。最后，这些微球体在物理加工和稳定性上的提高使得它能够生产出商业上可以接受的即时使用配方并加以包装，这些配方具有良好的贮放性能。本发明再用下面的实施例加以说明，实施例并不仅限于已提到的几个。
实施例1-7微球体在中性油赋形剂中的物理稳定性这些实施例说明了通过掺合2-15%油、半软脂或其混合物的组份而明显地稳定的微球体组份的范围，物理稳定的测量是将微球体悬浮在中性的三甘醇油赋形剂中，并对悬浮液施加了测试条件、测试条件模似了悬浮液贮存在热环境条件，即30℃(86°F)或38℃(100°F)下的条件。在本实施例的测试中，将3克微球体悬浮在7.5毫升的中性三甘醇油中，使悬浮液在不变的温度下慢慢旋转(2-6转/分)，直到悬浮液不再在容器中流动，凝胶时间大致上与悬浮液不再流动所耗去的时间相当。结果列在下表1中。当不能观察到正确的凝胶时间时表1给出了凝胶时间的大致范围。凝胶时间以小时计，除非另有说明。每一批量、来源或类型的硬脂不都是稳定到同一程度。确切地说，凝胶时间与所选用的硬脂的种类、加到微球体组份的油或半软脂的量和种类而有不同。然而，如结果所示，对每一特定批量、来源或种类的硬脂来说，油或半硬脂的加入大大增加了凝胶时间，将微球体的老化时间也列在下表的括弧内，因为它是凝胶时间的重要的决定因素，因为晶态从不大稳定的α态转变到比较稳定的β态的时间与其有关。
表 1凝胶时间，小时脂 油或半软脂 微球体的老化(天)在30℃ 在38℃GTS11.a. 无 1.5(1)b. 无 6-24(14) 10分(29)c. 10%Miglyol2812 ＞168(1) 6(15)d. 5%GDS 6-24(21)2.a. 无 7分(1)b. 10%Miglyol 812 1(1)c. 10%Miglyol 812 2(80)3.a. 无 ＜1(1)b. 无 1.3(6) 7分(39)c. 2%Miglyo 812 2(8)d. 5%Miglyol 812 1.3(8) 12分(22)e. 10%Miglyol 812 6-24(8) 1(29)f. 15%Miglyol 182 24(1)g. 2%GDS ＜2(1)h. 5%GDS 3(21) 7分(39)i. 10%GDS 1.3(1)j. 5%Triacetin 8-24(1) 1.25(8)k. 2%GDS和 8-24(1)10%Miglyol 812
4.a. 无 1.6(1)b. 10%Miglyol 812 24(1)5.a. 无 6-24(21)b. 10%Miglyol 812 ＞168(1)6.a. 无 5分(1)b. 10%Miglyol 812 6-24(1)7.a. 无 1.1(120)b. 10%Miglyol 812 2(0)1.例1-5乃是用Huls of America，商品牌号为Dynasan 118的GTS(三硬脂酸甘油酯)的不同批量来做的。
例6是用Pfaltz & Bauer生产的物料做的。
2.Miglyol 812 购自Huls of America公司，是一种中性三甘醇油。
3.物料来源Gattefosse，商品牌号Gelucire 64/02。
实施例8经制备的不稳定的三硬脂酸甘油酯(GTS)微球体配方和稳定GTS微球体配方具有如下组成不稳定的微球体 28% 牛生长激素2% 苯甲酸钠0.14% Pluronic F68 70% 三硬脂酸甘油酯稳定的微球体 28% 牛生长激素2% 苯甲酸钠0.14% Pluronic F68 63% 三硬脂酸甘油酯7% Miglyol 812 两种微球体配方都是悬浮在同样量的中性油赋形剂中并贮存在25℃或4℃。定期从贮存中取出配方试样，在测量粘度(用Brookfield粘度计T(Viscometer T)锭子C(Spindle C)，100转/分测量)前将试样加热到室温(22-25℃)。列于下表2中的结果表明，在典型的贮存条件下，稳定过的配方其粘度在整个时间内增加明显放慢。
1.Pluronic F68R是BASF公司生产的环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物。
表 2未稳定和已稳定的GTS微球体配方的粘度比较在25℃测得的粘度(厘泊)在25℃贮存 在4℃贮存时间 未稳定 已稳定 未稳定 已稳定0 66 66 66 661天 452 - 168 -5天 2300 - 159 -1周 7300 119 159 702周 - 195 159 714周 - 442 - 798周 - 1971 164 8213周 - 2629 270 7426周 - 2629 624 7039周 - 5280 741 71实施例9牛奶产量比较和分析制备了如实施例8中未稳定和稳定微球体相同组成的微球体，并用乳牛作了试验以评定产奶功效。为进行注射将微球体悬浮在Miglyol 812 中即中性的三甘醇油中。此实施例中，疗程在二次二一周注射之后跨越进行，即，B组牛在周1(即第1周)和周3开始注射4周不稳定配方，在图5、7和9开始这些牛改用稳定配方注射。C组牛在周1(即第1周)和周3开始起注射稳定配方，在周5，7和9开始改用不稳定配方注射。这些实验的结果列于下面表3。通过确定每组用不稳定配方注射的牛的平均奶产量和用稳定配方注射时的平均奶产量之间的平均差来进行两种配方的统计比较。在第5周和第6周期的奶产量不计入统计分析中，因为在这段时间内两种配方间会进行相互作用。平均差是-0.9±4.7%，没有统计学上的意义，P＞0.05。结论是两组配方的奶产量几近相同。
表 3奶产量的比较和分析不稳定对稳定的微球体持久释放配方牛奶的百分增加率两周-＞ 1 2 3 4 5 差＊组 牛 配方1 配方2B 1 18.5 24.2 24.6 15.5 15.4 5.92 12.4 15.3 7.3 9.7 6.3 5.93 5.6 14.3 13.8 9.9 9.8 0.24 6.4 2.7 12.9 7.3 12.2 -5.25 0.9 4.5 12.8 7.9 8.1 -5.36 -4.5 8.3 8.1 8.0 13.9 -9.07 8.5 31.9 33.4 21.7 24.4 -2.98 4.7 10.9 4.5 7.9 9.9 -1.19 7.4 16.7 16.4 14.3 14.3 -2.310 18.5 19.2 23.5 21.3 22.3 -3.0
C 1 -6.9 5.3 12.3 3.5 6.2 5.72 4.0 6.5 -3.2 3.0 5.0 -1.23 3.1 4.6 8.2 7.1 8.7 4.04 4.3 10.5 15.4 9.9 12.3 3.75 2.9 15.4 19.5 16.9 11.7 5.26 4.9 4.8 9.8 -6.9 -13.0 -7.47 2.9 4.9 7.7 2.5 -3.1 -4.28 7.7 11.7 12.7 9.1 11.9 1.69 9.9 14.1 18.1 6.0 6.3 -5.810 13.3 20.4 23.1 13.5 15.6 -2.6平均偏差 -0.9+/-标准偏差 +/-4.7＊差是指每头牛的，是指B组1和2两周中或是C组4和5两周中用配方1(未稳定)时的平均奶产量和B组4和5两周中或C组1和2两周中用配方2(稳定)时的平均奶产量之间的差值。由于疗程横贯了三个两周的开端，所以从注射的顺序来看，实验是取得平衡的。为了减少一个疗程的结果带到下一个疗程中去的可能性，将三个两周的结果不计入统计分析中去。平均差值反映了两种配方之间的差别。
权利要求
1.一种改进的制备微球体组份的方法，具有将脂或蜡或其混合物和生物活性的蛋白质、肽或多肽熔融掺混以形成掺混物，并将所述的掺混物加以造粒以形成所述的微球体组份等几个步骤，其改进系由所述的掺混物在造粒前，将约1%至30%的油、半软脂、脂肪酸衍生物或其混合物加以混合所构成。
2.如权利要求1所述的方法，其中掺混物系由约30%至95%的脂或蜡或其混合物以及约2%到70%的生物活性蛋白质、肽或多肽所构成。
3.如权利要求2所述的方法，其中生物活性蛋白质是牛、猪和羊的生长激素。
4.如权利要求3的方法，其中的掺混物由约5%至20%的中性三甘醇油所构成。
5.如权利要求1的方法，其进一步是将微球体组份悬浮在制药和药理可接受的液体赋形剂中所构成。
6.按权利要求1制备的微球体组份。
7.非肠道使用的微球体组份，按重量计，系由约30%至95%的脂或蜡或其混合物，约2%至70%生物活性的蛋白质、肽或多肽，以及约1%至30%的油、半软脂、脂肪酸衍生物或其混合物所构成。
8.按权利要求7的微球体组份，含有约5%至20%中性的三甘醇油和牛、猪或羊的生长激素的生物活性蛋白质。
9.制备微球体组份的方法，包括按重量计，将约30%至95%的脂或蜡或其混合物，约2%至70%生物活性的蛋白质、肽或多肽以及约1%至30%的油进行熔融掺混形成掺混物;再将所述的掺混物进行造粒形成所述的组份。
10.按权利要求9的方法，其中掺混物系由5%至20%中性三甘醇油和是牛、猪、或羊生长激素的生物活性蛋白质所构成。
全文摘要
本发明系某些适于非肠道使用的稳定微球状组份，组份含脂肪或蜡或其混合物，生物活性的蛋白质、肽或多肽以及油、半软脂肪、脂肪酸衍生物或其混合物。本发明也涉及制备此微球状组份的方法。
文档编号A61K9/50GK1055293SQ9110131
公开日1991年10月16日 申请日期1991年2月28日 优先权日1990年3月30日
发明者威廉·斯蒂伯 申请人:美国氰胺公司