专利名称：多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸注射液及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸注射液及制备方法。
目前，影响肿瘤患者治愈的一个重要原因是常规治疗(手术、化疗、放疗)后，部分患者出现肿瘤复发和转移。故此，控制和减少复发和转移，是提高肿瘤患者治愈率及生存期的重要途径之一。由于抗肿瘤免疫核糖核酸具有传递特异性和非特异性抗肿瘤免疫作用，故此，可以减少和控制肿瘤的复发和转移，提高肿瘤患者的治愈率和延长肿瘤患者的生存期，并且对癌前变，肿瘤易发人群起预防作用。目前，正在研究开发的一般是单纯特异性抗肿瘤免疫核糖核酸(即只针对某一种肿瘤有特异性作用的)。由于单纯特异性和非特异性抗肿瘤免疫核糖核酸作用单一，因此在临床上有一定的局限性。
本发明的目的就是为肿瘤患者及肿瘤易发人群提供一种多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸注射液及制备方法。本发明可使机体建立或提高特异性和非特异性抗多种肿瘤的免疫反应能力，即在治疗某一种肿瘤的同时，可使机体建立起对其它多种肿瘤的特异性免疫反应，通过提高自身的抗肿瘤能力，消灭或控制常规治疗后残余癌细胞和新生的微小肿瘤病灶，达到治疗和预防的双重目的。
本发明的目的是通过以下措施达到的。多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸注射液及制备方法，其特征在于每毫升注射液中含有免疫核糖核酸1-5mg肝素钠200-500单位生理盐水1ml其制备方法为a、将制备好的多特异性瘤苗免疫动物(如马、牛、羊等)，然后采取其淋巴结、肝脏、脾脏进行匀浆、离心、提取、除蛋白、沉淀、除糖元、精制、洗涤、溶解过滤、测定含量，制成一定的剂型;
b、将制备好的多种单特异性瘤苗分别按上述a中所述制备方法制成各种单纯特异性抗肿瘤免疫核糖核酸，然后将其等量混合后，灌封，制成一定的剂型。
上述多特异性瘤苗的制备、是取多种人肿瘤手术组织，分别去包膜和坏死组织，剪碎，按重量等量混合，置40-120目网上，压磨肿瘤块，分离出单个肿瘤细胞，滤液用1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀混悬于生理盐水中，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
上述多特异性瘤苗的制备，还可以是取多种人癌细胞培养株，分别培养、收集细胞、计数后，以相同的细胞数将各种细胞株混合，1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水混悬，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
上述单特异性瘤苗的制备，是取单纯某一种人肿瘤手术组织，去包膜和坏死组织，剪碎，置40-120目网上，压磨肿瘤块，分离出单个肿瘤细胞，滤液用1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀混悬于生理盐水中，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
上述单特异性瘤苗的制备，还可以是取单纯某一种人癌细胞培养株，培养，收集细胞，计数后，1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀混悬于生理盐水中，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
本发明注射液的剂型可以是水针剂或冻干制品。
本发明多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸，是指对多种不同肿瘤均具有特异性免疫作用。单特异性抗肿瘤免疫核糖核酸，是指只针对某一种肿瘤具有特异性免疫作用。
实施例11、多特异性瘤苗的制备将手术切除的人不同肿瘤组织，分别去包膜和坏死组织，剪碎成小块，按重量等量混合，置120目不锈钢网上，用硬橡皮塞轻轻压磨肿瘤块，分离出单个肿瘤细胞。滤液用1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀混悬于生理盐水中，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
2、原料制备动物选择1-1.5岁的经检疫的健康雄性绵羊。
免疫方法，取1-2毫升瘤菌与等体积完全弗氏佐剂(羊毛脂30%，石膜油70%，每毫升含灭活卡介苗5-10毫克)，充分乳化后，在动物四肢内侧淋巴结附近皮下注射，每处用量0.5-1.0毫升，首末两次用完全佐剂，其余用不完全佐剂(羊毛脂30%，石膜油70%)，间隔7-14天，共注射4-5次，末次免疫7-10天后，颈动脉放血处死动物。适当消毒后，切开腹腔，顺序取出肝、脾和肠系膜、胃周围、动脉周围及腰柱双侧淋巴结，然后开胸取出胸腺，纵膈和支气管淋巴结，最后取出颈部、锁骨、腹股沟淋巴结。剔去组织上的结缔组织，脂肪组织，用大量冷灭菌水冲洗后，保存于-20-70℃备用。
3、免疫核糖核酸(iRNA)的提取将原料切成小块，分别加入5-10倍(W/V)的SDS提取液(0.5%SDS-0.14MNaCL-0.01MNaAc，PH5.0)和5-10倍(W/V)的酚液(90%饱和苯酚-0.1%8羟基喹啉)，放入组织匀浆器中，低速匀浆0.5-1分钟后，高速匀浆1分钟，取出，放入60%水浴中，搅拌加热15分钟，冷却，2000-3000rpm离心20分钟(以后离心均采用同样条件)。收集上清液，底层再加入底层溶液1/2体积的SDS提取液，60℃水浴，搅拌5分钟。冷却、离心。收集上清液与前次上清合并，加入等体积酚液，室温振荡10分钟，离心。收集上清液，重复1-2次。在上清液中加入1/2体积的酚液和1/2体积的氯仿，室温振荡10分钟，收集上清液，重复1-2次。上清液中加入等体积氯仿，室温振荡10分钟，收集上清液，重复2-3次。上清液中加入2.5MNaAc溶液，使终浓度为0.15M，混匀后，加入2-3倍体积的冷乙醇，-20℃过夜，次日离心，弃上清。
(1)、沉淀物来源于脾、淋巴结等时，溶于适量0.3MNaAc，测含量后，加入2-3倍的冷乙醇。0-20℃放置1-2小时，离心、弃上清，重复1-2次后，测含量，将沉淀溶解在含250-500μ/ml肝素钠的生理盐水中，除菌分装。
(2)、沉淀物来源于肝脏时，用95%冷乙醇洗一次，加1份0.01M NaAc(PH5.0)，50-60ml/100克组织，1份2.5M KH2PO4缓冲液(PH8.0)，1份乙二醇独甲醚，冰水浴振荡5分钟，离心。收集上清液，在上层液中加入等体积0.2M NaAc及1/4-1/2体积的1%十六烷基三甲基溴化铵，-20℃放置10-30分，离心，弃上清，用适量0.2M NaAc，溶液溶解沉淀，加2-3倍的冷乙醇。-20℃1-2小时放置，离心，弃上清，重复洗涤3-5次至无泡沫为止。测含量，制剂时，将沉淀溶解于生理盐水中(含250-500μ/ml肝素钠)，除菌漏斗过滤，测定含量，灌封。
实施例21、单特异性瘤苗的制备取人同种肿瘤手术组织或一种人瘤细胞培养株，然后按上述实施例1中多特异性瘤苗制备方法中的操作步骤制备成各种单特异性瘤苗。
2、原料制备用单特异性瘤苗分别免疫健康雄性绵羊，分别采集其肝、脾、淋巴结等。操作方法与实施例1多特异性原料制备相同。
3、免疫核糖核酸的提取
将各种单特异性原料分别切碎、按实施例1多特异性提取方法分别提取、纯化、测含量。
4、制剂将各种纯化的单特异性免疫核糖核酸等量混合，溶于生理盐水中(含250-500μ/ml肝素钠)，过滤除菌，灌封。
实施例3病例张××，女，40岁。90年2月开始腹部疼痛，持续3个月逐渐加重，面色苍白，贫血面容，腹部肝肋压痛明显、质硬。B超提示肝多发性占位性病变？血管瘤。经长治医学院附院诊断为肝癌。治疗，单纯使用多特异性免疫核糖核酸。患者腋窝皮下注射8mg后，第二天疼痛减轻，又继续使用12mg，患者疼痛浮肿消失，病情好转后维持现状已有三年。目前，患者病情稳定，肝仍占位性病变，但无发展。
从以上实施例可以看出，本发明是用人多种不同组织学类型的肿瘤细胞免疫动物(羊、马、牛等)，从其淋巴结、脾脏、肝脏等器官提取的大分子(分子量为1-3×105)物质，它可超越种属界限转输抗肿瘤多特异免疫性，包括细胞免疫和体液免疫，同时也可提高机体的非特异性抗肿瘤免疫功能，可诱导产生干扰素、白细胞间素Ⅰ(IL-1)，白细胞间素Ⅱ(IL-2)，抗肿瘤细胞毒因子等多种免疫活性物质。本发明可显著延长肿瘤患者的生存期和降低易发人群的发癌率。其积极效果如下(1)、一药多效，具有预防和治疗肿瘤的双重作用，并且在治疗某一种肿瘤时，可预防其它多种肿瘤的发生。
(2)、具有建立或提高机体抗多种肿瘤的特异性免疫力和非特异性免疫力的作用。
(3)、对免疫反应的传入途径或对抗元加工处理步骤有障碍的患者，仍可诱发抗肿瘤特异性免疫反应。
(4)、不含有移植抗元，故不会发生过敏反应，对机体其它器官无任何毒付作用，使用安全、方便。
(5)、成本低廉，因可利用动物做为原料来源，故比较便宜和方便。
(6)、生产工艺简单，不需昂贵仪器，国内一般生化制药厂均可生产。
(7)、适应范围广，由于具有多特异性，可用于各种不同肿瘤。
权利要求
1.一种多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸注射液，其特征在于每毫升注射液中含有免疫核糖核酸1-5mg肝素钠200-500单位生理盐水1ml
2.一种多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸注射液的制备方法，其特征在于a、将制备好的多特异性瘤苗免疫动物(如马、牛、羊等)，然后采取其淋巴结、肝脏、脾脏进行匀浆、离心、提取、除蛋白、沉淀、除糖元、精制、洗涤、溶解过滤、测定含量，制成一定的剂型;b、将制备好的多种单特异性瘤苗分别按上述a中所述制备方法制成各种单纯特异性抗肿瘤免疫核糖核酸，然后将其等量混合后，灌封，制成一定的剂型。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的多特异性瘤苗的制备，是取多种人肿瘤手术组织，分别去包膜和坏死组织，剪碎，按重量等量混合，置40-120目网上，压磨肿瘤块，分离出单个肿瘤细胞，滤液用1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀混悬于生理盐水中，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于多特异性瘤苗的制备，还可以是取多种人癌细胞培养株，分别培养，收集细胞，计数后，以相同的细胞数将各种细胞株混合，1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水混悬，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的单特异性瘤苗的制备，是取单纯某一种人肿瘤手术组织，去包膜和坏死组织，剪碎，置40-120目网上，压磨肿瘤块，分离出单个肿瘤细胞，滤液用1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀混悬于生理盐水中，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的单特异性瘤苗的制备，还可以是取单纯某一种人癌细胞培养株，培养，收集细胞，计数后，1000-1200rpm离心10-20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水混悬，其比值为1∶1(W/V)，加入10-15%灭菌甘油，分装后置-20--40℃保存备用。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的注射液的剂型可以是水针剂或冻干制品。
全文摘要
一种多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸注射液及制备方法，将制备好的多特异性瘤苗免疫动物(如马、牛、羊等)，然后采取其淋巴结、肝脏、脾脏进行匀浆、离心、提取等工艺步骤制成一定剂型的多特异性抗肿瘤免疫核糖核酸。本发明可使机体建立或提高特异性和非特异性抗多种肿瘤的免疫反应能力，具有预防和治疗肿瘤的双重作用。本发明使用安全，无任何毒副作用，适应范围广，由于具有多特异性，可用于各种不同肿瘤。
文档编号A61K31/715GK1080173SQ93102430
公开日1994年1月5日 申请日期1993年3月5日 优先权日1993年3月5日
发明者张少云, 郭文杰, 张素英 申请人:山西省肿瘤研究所