专利名称：含有il-6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有白细胞介素6(IL-6)拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂，可以在肿瘤治疗中辅助、增强抗肿瘤剂的作用。
在人肿瘤的化疗法中，到目前为止一直采用烷基化制剂、代谢拮抗剂、抗肿瘤抗生素制剂、铂化合物等。有时，单独使用这些抗肿瘤剂得不到显著的治疗效果，所以人们一直考虑合用多个抗肿瘤剂的治疗方法(Frei，E.III，Cancer Res.，32，2593-2607，1992)。人们已经了解，肿瘤细胞对于抗肿瘤剂有各种各样的敏感性，有的对抗肿瘤剂表现出治疗抗性(Magrath，I.，New Directions in Cancer Treatment，1989，Springer-Verlag)。产生肿瘤细胞治疗抗性的原因如下表现对多种药物的抗性(multi-drug resistance；MDR)(Tsuruo，T.等人Cancer Res.，42，4730-4733，1982)、抗肿瘤剂被摄入细胞内的量减少(Sherman，S.E.等，Science，230，412，1985)、DNA修复活性的增加(Borch，R.F.，Metabolismand Action of Anticancer Drugs.Powis，G&Prough，R.编、Taylor &Francis，London，1987，163-193)或是促进细胞内抗肿瘤剂的失活(Teicher，B.A.等，Cancer Res.，46，4379，1986)等。这种情况下，如果只是给以抗肿瘤剂则往往得不到预期的治疗效果。
肾细胞癌(renal cell carcinoma)是一种表现出对顺铂、阿霉素和长春花碱等抗肿瘤剂治疗抗性的肿瘤(Kakehi，Y.等，J.Urol.，139，862-864，1988；Kanamaru，H.等，J.Natl.Cancer Inst.，81，844-847，1989；Teicher，B.A.等，Caucer Res.，47，388-393，1987)。顺铂等具有抗肿瘤作用的铂化合物结合于DNA，阻碍DNA的合成和细胞的分裂(Pinto，A.L.等，Biochica et Biophysica Acta，780，167-180，1985)。
人们认为肾细胞癌对顺铂的治疗抗性与谷胱甘肽-S转移酶-π(GST-π)的表达、以及由于含有巯基物质在细胞质内水平的上升而引起对顺铂作用的抑制、DNA修复能力的上升或C-myc等致癌基因的活化等有复杂的关系(Sklar，M.D.等，Cancer Res.，51，2118-2123，1991；Mizutani，Y.等，Cancer in press，1944；Nakagawa，K.等，Japan.
J.Cancer Res.，79，301-305，1988)。
同时，人们认为肿瘤细胞的穿膜运输能力的变化引起细胞内顺铂摄入量的减少，增加了对顺铂的治疗抗性(Richon，V.等，CancerRes.，47，2056-2061，1987；Waud，W.R.等，Cancer Res.，47，6549-6555，1987)。有报道说作为含有巯基的物质，在哺乳动物细胞内存在最丰富的谷胱甘肽，在细胞内使顺铂钝化，在某种肿瘤的细胞内谷胱某肽和金属硫蛋白水平变高(Hromas，R.A.等，Cancer LETT.，34，9-13，1987；Taylor，D.M.等，Eur.J.Cancer，12，249-254，1976)。
谷胱甘肽是三肽硫代化合物，起着使烷基化制剂和顺铂那样的DNA结合物质钝化的作用以及在由此引起的细胞损伤的修复中起着重要的作用。GST-π的一个作用是通过使上述那样的抗肿瘤剂与谷胱甘肽结合，促进抗肿瘤剂的钝化。
肾细胞癌产生白细胞介素6(IL-6)，因为发现了IL-6受体(IL-6R)，暗示IL-6在肾细胞癌的增殖活化中起着某种作用(Miki，S.等，FEBS Lett.，250，607-610，1989；Takenawa，J.，等，J.Natl.CancerInst.，83，1668-1672，1991)。有报道肾细胞癌患者治疗后情况变坏时，血清中IL-6水平上升(Blay，J.，等，Cancer Res.，52，3317-3322，1992；Tsukamoto，T.，等，J.Urol.，148，1778-1782，1992)。然而，到目前为止还不清楚IL-6与对肾细胞癌的抗肿瘤剂的治疗抗性之间是否有明确的关系。
IL-6被称为B细胞制激因子2或干扰素β2，是多功能细胞激动素。IL-6是作为与B淋巴球系细胞的活化有关的分化因子被发现的(Hirano，T等，Nature 324，73-76，1986)，此后，逐渐弄清了它是影响各种细胞功能的多功能细胞激动素(Akira，S.等，Adv.in Immunology 54，1-78，1993)。IL-6通过细胞上的二种蛋白质传递它的生物学活性。
一种是IL-6结合的分子量约为80KD的配体结合性蛋白质，即IL-6R。IL-6R贯通细胞膜，除了细胞膜上发现的膜结合型之外，主要是由细胞外区域构成的可溶性IL-6R(sIL-6R)存在的。另一种是非配体结合性的与信息传递有关的分子量约为130KD的gp130。IL-6与IL-6R形成IL-6/IL-6R复合体，然后通过与另一个膜蛋白质gp130结合，向细胞传递IL-6的生物学活性(Taga等，J.Exp.Med.，196，967，1987)。
有报告说象顺铂那样的铂化合物以及丝裂霉素C抗肿瘤剂，虽然诱导肿瘤细胞产生细胞程序性死亡，但IL-6却抑制由抗肿瘤剂诱导产生的细胞程序性死亡(Kerr，J.等，Cancer 73，2013-2026，1994；Sachs，L.等，Blood82，15-21，1943)。而象顺铂和丝裂霉素C那样的抗肿瘤剂通过产生自由基对肿瘤细胞给予细胞毒性(Oyanagi，Y.等，Biochem.pharmacol.，26，473-476，1997；Nakano，H.等，Biochem，Biophys.Acta.，796，285-293，1984)，而IL-6促进对自由基有分解作用的锰超氧化物歧化酶(Manganese superexide dismutase；MnSOD)的表达，已知IL-6抗体抑制被促进的MnSOD的表达(Ono.M.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，182，1100-1107，1992；Dougall，W.C.等，Endocrinology，129，2376-2384，1991)。
然而，这些报告没有记载通过阻断IL-6生物学活性增强抗肿瘤作用，实际上还没有尝试使用IL-6拮抗剂作为抗肿瘤剂的作用增强剂。
到目前为止，肿瘤治疗中虽然仍使用抗肿瘤剂，但使用的量多就会产生不希望的一些副作用如恶心、呕吐、损伤肾和肝功能、抑制骨髓机能等。对于肿瘤细胞投入能充分发挥抗肿瘤作用量的抗肿瘤剂，有时也是很危险的。另外，也有使用通常的抗肿瘤剂的化学疗法却没有看到效果的、表现出治疗抗性的肿瘤，人们正期待着能够使这样的肿瘤对抗肿瘤剂的敏感性增加的作用增强剂的出现。
本发明的目的就在于提供对抗肿瘤剂有辅助、增强作用的、使对抗肿瘤剂有治疗抗性的肿瘤细胞的敏感性增加的新的抗肿瘤剂的作用增强剂。更详细地说，本发明提供含有IL-6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂。再详细点说，本发明提供含有IL-6拮抗剂的具有抗肿瘤作用的化疗制剂的作用增强剂。
本发明人等就IL-6拮抗剂对于肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性的变化产生的影响进行了深入地研究，结果发现IL-6抗体或IL-6R抗体等IL-6拮抗剂可使肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性上升，使用较少的抗肿瘤剂就能看到治疗效果。而且，对于通常的抗肿瘤剂显示治疗抗性的肿瘤通过并用含有IL-6拮抗剂的作用增强剂就可看到治疗效果。
即，本发明是关于含有IL-6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂。更详细地说，本发明涉及含有IL-6拮抗剂的具有抗肿瘤作用的化疗制剂的作用增强剂。
作为IL-6拮抗剂，理想的是对IL-6的抗体、对IL-6R的抗体等，例如，优选它们的单克隆抗体。具体的单克隆抗体有PM-1抗体、或是人型化的PM-1抗体。而作为与IL-6拮抗剂组合使用的抗肿瘤剂有化疗制剂，如具有抗肿瘤活性的铂化合物、丝裂雷素C等。铂化合物有顺铂、卡铂(carboplatinum)、254-S，DNA-2114R，NK-121等。
附图的简单说明
图1A和1B表示浓度为0，0.1，1或10μg/ml的顺铂分别与IL-6抗体(图1A)或IL-6R抗体(图1B)共存时对肾细胞癌株Caki-1的细胞损伤活性。◆表示只加顺铂，■表示顺铂和0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示顺铂与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示顺铂与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图2A和2B表示浓度为0，0.1，1或10μg/ml的丝裂霉素C分别与IL-6抗体(图2A)或IL-6R抗体(图2B)共存时对肾细胞癌株Caki-1的细胞损伤活性。◆表示只加丝裂霉素C，■表示丝裂霉素C和0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示丝裂霉素C与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示丝裂霉素C与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图3A和3B表示浓度为0，0.1，1或10μg/ml的顺铂分别与IL-6抗体(图3A)或IL-6R抗体(图3B)共存时对肾细胞癌株Caki-1/DDP的细胞损伤活性。◆表示只加顺铂，■表示顺铂与0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示顺铂与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示顺铂与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图4A和4B表示浓度为0，0.1，1，10μg/ml的顺铂分别与IL-6抗体(图4A)或IL-6R抗体(图4B)共存时对肾细胞癌株ACHN的细胞损伤活性。◆表示只加顺铂，■表示顺铂与0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示顺铂与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示顺铂与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图5A和5B表示浓度为0，0.1，1，10μg/ml的顺铂分别与IL-6抗体(图5A)或IL-6R抗体(图5B)共存时对肾细胞癌株A704的细胞损伤活性。◆表示只加顺铂，■表示顺铂与0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示顺铂与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示顺铂与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图6A和6B表示浓度为0，0.1，1或10μg/ml的顺铂分别与IL-6抗体(图6A)或IL-6R抗体(图6B)共存时对从患者1得到的新鲜肾细胞癌的细胞损伤活性。◆表示只加顺铂，■表示顺铂与0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示顺铂与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示顺铂与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图7A和7B表示浓度为0，0.1，1，10μg的顺铂分别与IL-6抗体(图7A)或IL-6R抗体(图7B)共存时对从患者2获得的新鲜肾细胞癌的细胞损伤活性。◆表示只加顺铂，■表示顺铂与0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示顺铂与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示顺铂与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图8A和8B表示浓度为0，0.1，1，10μg/ml的顺铂分别与IL-6抗体(图8A)或IL-6R抗体(图8B)共存时对从患者3获得的新鲜肾细胞癌的细胞损伤活性。◆表示只加顺铂，■表示顺铂与0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示顺铂与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示顺铂与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图9A和9B表示浓度为0，1，10，100μg/ml的卡铂分别与IL-6抗体(图9A)或IL-6R抗体(图9B)共存时，对肾细胞癌株Caki-1的细胞损伤活性。◆表示只加卡铂，■表示卡铂与0.1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，▲表示卡铂与1μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存，●表示卡铂与10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞损伤活性(％)。
图10中的A表示用培养液(对照)、10μg/ml的顺铂、10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体处理的肾细胞癌株Caki-1中为研究GST-πm RNA表达使用GST-πcDNA探针的Caki-1的总RNA的RNA印迹结果。带1是只用培养液，带2是用顺铂，带3是用IL-6抗体，带4是用IL-6R处理的。图10中的B表示实施了溴乙锭染色的用于RNA印迹的凝胶图。各个带都显示有RNA的存在。
本发明的含有IL-6拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂是在治疗肿瘤时与抗肿瘤剂合用，以增强抗肿瘤作用。同时可降低必需的抗肿瘤剂的用量，而且对于用通常化学疗法看不出治疗效果的治疗抗性的肿瘤也具有使其对抗肿瘤剂的敏感性增加的效果。
通过本发明的作用增强剂使抗肿瘤作用增强的抗肿瘤剂作用于肿瘤细胞可以抑制肿瘤细胞的发育和增殖，是具有治疗肿瘤效果的化疗制剂。化疗制剂中有烷基化制剂、代谢拮抗剂、抗肿瘤抗生素制剂、来自植物的生物碱、激素疗法制剂、铂化合物等。在这些抗肿瘤剂中，抗肿瘤抗生素制剂丝裂霉素C和具有抗肿瘤作用的铂化合物特别理想。铂化合物有铂原子与别的原子形成的络合物。该络合物通过与DNA结合，阻碍肿瘤细胞DAN合成，以及阻碍肿瘤细胞的分裂，表现出抗肿瘤作用。到目前为止作为具有抗肿瘤作用的铂化合物已知有顺铂(Cis-diamminedichloroplatinum(II)，结构式如下)，
卡铂(Cis-diammine(1，1-cyclobutanedicarboxylato)-platihum(II)，结构式如下)
254-S((GLycolato-0，0′)diammineplatinum(II)，结构式如下)，
DNA-2114R((-)-(R)-2-aminomethylpyrrolidine(1，1-cyclobutanedicarboxylatoplatinum(II)，结构式如下)，
NK-121((R)-cis-2-methyl-l，4-butanediamine(1，1-cyclobutanedicarboxylato)platinum(II)，结构式如下)，
乙二酰铂(Oxaliplatin；USAN，Oxalato(trans-1，2-cyclohexanediamin-e)platinum(II)，结构式如下)，
TRK-710((alpha-acety1-gamma-methyltetronate)2-(1-1，2-diaminocyclohexane)platinum(II)，结构式如下)。
这些铂化合物中顺铂、卡铂、DNA-2114R是较理想的。
这些抗肿瘤剂通过常规方法制剂。例如，铂化合物，根据需要将作为药物使用的单体与辅剂一起混合后作成口服的或非口服的，最好是作成针剂。作成针剂时，最好是与蒸馏水或氯化钠、氯化钾等盐溶液混合或是与葡萄糖、生理盐水混和。这些制剂中抗肿瘤剂的剂量根据患者的年龄、症状等而定，希望是便于使用的单位剂量，例如用于成人肿瘤治疗时，每天一次给药10-2000mg/m2(体表面积)，根据给药量可连续给药5天，或在给药期内设计1-4周的停药期。
利用本发明的作用增强剂证实有抗肿瘤作用的肿瘤细胞是具有IL-6R、且IL-6作为一种生理活性物质显示出增殖和/或治疗抗性的肿瘤。这样的肿瘤有肾细胞癌(Miki，S.等，FEBS Letter，250，607-610，1984)、骨髓瘤(Kawano，M.等，Nature，332，83-85，1988)、卵巢癌(Kobayashi，H.等，第53届日本癌学会总会讲演要旨集271页、874，1994)、EB病毒感染B淋巴瘤(Tosata，G.等，J.Virol.，64，3033-3041，1990)、成人T细胞白血病(Sawade，T&Takatsuki，K.Br.J.Cancer，62，923-924，1990)、前列腺癌(Siegall，C.B.等，Cancer Res.，50，7786-7788，1990)、Kaposi肉瘤(Miles，S.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.87，4068-4072，1990)等。
本发明使用的IL-6拮抗剂只要是能够阻断经IL-6进行的信息传递、阻碍IL-6生物学活性的物质，可以选择任何来源的物质。作为IL-6拮抗剂有IL-6抗体、IL-6R抗体、gp130抗体、IL-6突变体、IL-6的反义寡核苷酸或IL-6的部分肽段或IL-6R的部分肽段等。
本发明中作为IL-6拮抗剂使用的抗体，例如有IL-6抗体、IL-6R抗体、或gp130抗体。虽说不管其来源和种类(单克隆抗体或多克隆抗体)如何，但理想的是来自哺乳动物的单克隆抗体。这些抗体是通过与IL-6、IL-6R或gp130结合，阻碍IL-6和IL-6R的结合或阻碍IL-6R与gp130的结合，阻断IL-6的信息传递，从而阻碍IL-6生物学活性的抗体。
产生单克隆抗体的细胞的动物只要是哺乳动物即可，并没有特别地限制，人抗体或人以外的哺乳动物的抗体都可以。来自人以外的哺乳动物的单克隆抗体其制作简便，理想的是来自兔或啮齿类的单克隆抗体。啮齿类无特别限制，理想的是老鼠、大鼠、仓鼠等。
这样的抗体中，有作为IL-6抗体的MH166抗体(Matsuda等，Eur.J.Immunol.18951-956，1988)和SK2抗体(Sato等，第21届日本免疫学会总会、学术记录、21116，1991)等。作为IL-6R抗体有PM-1抗体(Hirata等，J.Immunol.1432900-2906，1989)，AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO92-19759)等。
这些抗体中，IL-6R抗体最理想，其具体例是上述的PM-1抗体。
单克隆抗体基本上使用众所周知的技术，按如下方式制作。即，以IL-6、IL-6R或gp130作为致敏抗原，按通常的免疫方法进行免疫，利用通常的细胞融合法使得到的免疫细胞与亲和细胞融合，通过常规的筛选法，筛选产生单克隆抗体的细胞。
再具体点讲，为了制作单克隆抗体只要按下列操作进行就可以。例如，作为上述的致敏抗原最好是使用来自人的，例如人的IL-6通过使用Hirano等人在Nature(32473，1986)中公开的人IL-6基因序列就可得到。将人IL-6基因序列插入众所周知的表达载体系统，使适当的宿主细胞转化后，从其转化细胞中或培养上清中纯化目的IL-6蛋白质，用纯化的IL-6蛋白质作为致敏抗原就可以制作单克隆抗体。
对于人IL-6，利用欧洲专利申请公开号EP325474号公开的基因序列，按照与上述人IL-6同样的方法，可以得到IL-6R蛋白质。IL-6R有二种，一种是在细胞膜上表达的，另一种是从细胞膜上脱下的可溶性蛋白(sIL-6R)(Yasukawa等，J.Biochem.，108，673-676，1990)。sIL-6R主要是由结合于细胞膜的IL-6R的细胞外区域构成的，在细胞膜贯通区域或在细胞贯通区域和细胞内区域缺损方面与膜结合型IL-6R不同。
对于人gp130，利用欧洲专利申请公开号EP411946公布的基因序列，按照与上述IL-6同样的方法，可以得到gp130蛋白质。
作为用致敏抗原免疫的哺乳动物虽没有特别限定，但最好是考虑与用于细胞融合的亲本细胞的适合性来选择。通常使用老鼠、大鼠、仓鼠、兔等。
按照众所周知的方法使用致敏抗原免疫动物。例如，作为一般的方法，通过将致敏抗原注射入哺乳动物的腹腔内或注射入皮下来进行免疫。具体讲，用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等量地稀释致敏抗原；根据要求将悬浮液适当地混合成通常的佐剂，例如作成Freund’s完全佐剂，乳化后，最好是每4-21天对哺乳动物投与数次。同时，在致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。
在如上所述进行免疫并证实血清中所希望的抗体水平上升后，从哺乳动物取出免疫细胞，进行细胞融合，理想的免疫细胞是脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的亲本细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞常使用众所周知的各种细胞株，例如，P3(P3×63Ag8.653)(J.Immunnol.1231548，1978)，P3-U1(Current Topics in Micro-biology andImmunology 811-7，1978)，NS-1(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)，MPC-11(Cell，8405-415，1976)，Sp2/o(Nature，276269-270，1978)，FO(J.Immunol，Meth.351-21，1980)，S194(J.Exp.Med.148313-323，1978)，R210(Nature，277131-133，1979)等。
上述免疫细胞与骨髓癌细胞的细胞融合基本是根据众所周知的方法，例如Milstein等人的方法(Milstein等，Methods Enzymol，733-46，1981)等进行。
再具体些讲，例如，在细胞融合促进剂存在下于通常的营养培养液中实施上述细胞融合。作为细胞融合促进剂，例如常使用聚乙二醇(PEG)，仙台病毒(HVJ)等，根据要求为了提高融合效率也可以添加二甲基亚砜等辅剂。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例，对于骨髓瘤细胞最好是使用1-10倍的免疫细胞。上述细胞融合用的培养液可以使用适合于上述骨髓瘤细胞增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液，此外也可使用常用于培养该种细胞的一般的培养液，也可与胎牛血清(FCS)等血清补液合用。
细胞融合是在上述的培养液中，将所定量的上述免疫细胞与骨髓瘤细胞充分地混合，通常添加预先加温至37℃左右的浓度为30-60％(w/v)的PEG溶液，例如，平均分子量为1000-6000左右的PEG溶液，通过混合，形成目的融合细胞(杂交瘤)。接着，逐次添加适当的培养液，反复进行离心、去除上清的操作，可以除去对杂交瘤发育不理想的细胞融合剂等。
该杂交瘤通过在通常的培养液例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养液)中培养，进行选择。在HAT培养液中进行的培养是为了使目的杂交瘤之外的细胞(非融合细胞)死亡，这需要充分的时间，通常要继续几天至数周。然后，实施通常的限界稀释法，进行能产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。
这样作成的能产生单克隆抗体的杂交瘤在通常的培养液中进行继代培养是可能的，而且可在液氮中长期保存。
为了从杂交瘤中获得单克隆抗体，可以采用按照通常的方法培养该杂交瘤，然后取其培养上清的方法，或是将杂交瘤给予与该杂交瘤相适合的哺乳动物，使其增殖后取其腹水的方法。前一方法适用于获得高纯度抗体，而后一种方法适合于抗体的大量生产。
而单克隆抗体不仅可以通过免疫抗原得到产生抗体的细胞，然后使该细胞经融合产生杂交瘤，再由杂交瘤获得，也可以通过将抗体基因克隆，重组入适当的载体，再将该载体导入公知的细胞株中，例如COS，CHO等，利用基因重组技术使其产生单克隆抗体(例如，参照Vandamme，A-M等，Eur.J.Biochem.，192，767-775，1990)。
通过上述方法得到的单克隆抗体，利用盐析法、凝胶过滤法、亲和层析法等通常的纯化手段，可以进行高纯度的纯化。
这样制成的单克隆抗体通过放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA，ELISA)、荧光抗体法(Immunofluorescence Analysis)等通常的免疫学手段可以证实可高灵敏度而且高精度地识别抗原。
本发明中使用的单克隆抗体并不限于杂交瘤产生的单克隆抗体，以使对人的异种抗原性降低等为目的而人为地改变的抗体更理想。例如，可以使用除人以外的哺乳动物，如老鼠的单克隆抗体可变区与人抗体稳定区组成的嵌合抗体，这样的嵌合抗体利用已知的嵌合抗体制作方法，特别是利用基因重组法制造。
而重组的人抗体可以用于本发明。这种抗体是将人以外的哺乳动物如老鼠抗体的互补性决定区移植到人抗体的互补性决定区后形成的，其中的一般的基因重组手法是已经公知的。利用已知的方法，可以得到在本发明中有用的重组人型抗体，其中最理想的例子是重组的PM-1抗体(例如，可参照国际专利申请公开号WO92-19759)。
另外，根据需要，为了制作重组的人抗体的互补性决定区形成合适的抗原结合部位，也可以置换抗体的可变区的框架(FR)区的氨基酸(Sato等，Cancer Res，531-6，1993)。而只要是与抗原结合、阻碍IL-6的活性，构建编码抗体片断(例如将F(ab′)2，Fab或Fv，H链和L链的Fv用适当的连接件连接的信息链Fv(scFv))的基因，然后使其在适当的宿主细胞中表达，也可以用于上述的目的。(例如，可参照Bird等，TIBTECH，9132-139，1991)。
scFv是连接H链V区和L链V区构成的。在该scFv中H链V区与L链V区是通过连接件理想的是肽连接件连接形成的(Huston，J.S.等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883，1988)。scFv中的H链V区和L链V区可以是来自上述记载的任一抗体。这些V区最好是用肽连接件连接。作为肽连接件例如可使用由12～19个氨基酸残基构成的任意一条肽链。
编码scFv的DNA可经过如下过程获得。即，以编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、以及编码L链或编码L链V区的DNA为模板，将编码这些序列中所希望的氨基酸序列的DNA部分，使用规定其两端的一对引物，通过PCR法扩增，然后，将编码肽连接件部分的DNA以及为了使其两端与H链、L链连接而规定的一对引物重组后，通过扩增可以得到编码scFv的DNA。
而一旦作成编码scFv的DNA，利用常规方法就可得到含有该DNA的表达载体以及通过该载体转化的宿主，进一步利用宿主通过常规方法可以得到scFv。scFv与抗体分子相比向组织的移行性更优越，人们期待着利用与重组的人抗体具有同样功能的抗体。
本发明中使用的IL-6突变体是在Brakenhoff等，J.Biol.Chem.26986-93，1994或Savino等，EMBOJ.131357～1367(1994)中公布的。
作为IL-6突变体，使用的是通过在IL-6的氨基酸序列中引入置换、缺失、插入等变异，在维持与IL-6R的结合活性的同时，使IL-6的信息传递作用消失的突变体。而IL-6只要具有上述性质，虽然不必考虑其来源的动物种类，但若考虑到抗原性，最好是使用来自人的IL-6。具体地讲利用众所周知的分子模拟程序，例如，WHATIF(Vriend等，J.Mol.Graphics，852-56，1990)，从IL-6的氨基酸序列预测其二级结构，再评价突变的氨基酸残基对整体结构的影响。
在决定了适当的变异氨基酸残基后，以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体为模板，利用通常使用的PCR(聚合酶链式反应)法引入突变，从而得到编码IL-6突变体的基因。根据需要，将该基因重组到适当的表达载体中，使其在大肠杆菌细胞或哺乳类细胞中表达，表达的IL-6可能就包含在培养上清中，或通过常规方法，将它纯化分离出来，评价它对IL-6R的结合活性以及IL-6的信息传递的中和活性。
本发明使用的IL-6部分多肽或IL-6R部分多肽，只要是它们可与各IL-6R或IL-6结合且没有IL-6活性传递作用，可以不管其片断的序列。关于IL-6部分多肽以及IL-6R部分多肽，参照美国专利公报US5210075和欧洲专利公开公报EP617126。关于IL-6R反意义寡核苷酸参照特愿平5-300338。
由本发明的IL-6拮抗剂构成的抗肿瘤剂作用增强剂只要能阻断IL-6的信息传递，能辅助和增强抗肿瘤剂的作用，就可用于具有IL-6R且以IL-6作为一种生理活性物质显示增殖和/或治疗抗性的任何肿瘤的治疗，是非常有效的。
由本发明的IL-6拮抗剂构成的抗肿瘤剂作用增强剂，理想的给药方式是非经口给药，例如，通过静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射等使药到达全身或局部。而且，至少可以与一种医药用载体或稀释液一起作成医药组合物或试剂盒。
由本发明IL-6拮抗剂构成的抗肿瘤剂作用增强剂对人的给药量因患者的病态、年龄或给药方法不同而不同，但选择适宜的量是必要的。例如使用IL-6R抗体时在大约1-1000mg/患者的范围内，可以选择4次以下的分次用量。也可以以1-10mg/kg/周的用量给药。但由本发明的IL-6拮抗剂构成的抗肿瘤剂作用增强剂并不受这些给药量的限制。
由本发明的IL-6拮抗剂构成的抗肿瘤剂作用增强剂可以按常规方法制剂(Remington’s pharmaceutical Science，latest edition，MarkPublishing company，Easton，美国)。例如，注射用制剂是把精制的IL-6拮抗剂溶解于溶剂，如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等，然后添加防止吸附剂如Tween80、明胶、人血清白蛋白(HSA)等后制成。或者是为了在使用前再溶解后利用，也可以制成冷冻干燥的药品。为进行冷冻干燥可以使用赋形剂如甘露糖醇、葡萄糖等糖醇或糖类。
实施例以下通过实施例，参考例和实验例具体地说明本发明，但本发明并不限于这些例子。
实施例1L-6抗体或IL-6R抗体在肿瘤细胞对于抗肿瘤剂的敏感性方面的影响就肿瘤细胞对各种抗肿瘤剂的敏感性研究了IL-6抗体或IL-6R抗体的影响。
(1)人肾细胞癌的制备将人肾细胞癌株Caki-1，Caki-1的亚系耐顺铂株Caki-1/DDP、人肾细胞癌ACHN、人肾细胞癌A704(Giard，D.J.等，J.Natl.CancerInt.51，1417-1423，1973)于含有25mMHEPES、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％加热钝化胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液(为Gibco制)(以下，称为完全培养液)中培养，使之在塑料皿上形成单层细胞。
另一方面，根据Mizutani，Y.等(Cancer 69，537-545，1992)的方法，从肾细胞癌患者获得新鲜肿瘤细胞。对于三个肾细胞癌患者进行外科手术时可得到肾细胞癌肿瘤组织。根据组织学上的分类确认是肾细胞癌后，利用3mg/ml的胶原酶(Sigma Chemical Co.，Ltd.)将肿瘤组织分解开，制备成肿瘤细胞悬浮液，用RPMI1640培养液洗三次后，将该细胞悬浮液层叠在15ml容量的塑料管中的各为2ml的100％、80％和50％的Ficol-Hypague构成的非连续梯度上，400xg离心30分钟。除去上述的100％层中的富含淋巴细胞的单细胞层，从80％层可获得肿瘤细胞和中皮细胞。
为了防止其它细胞的混入，将15ml的塑料管的完全培养液中富含肿瘤细胞的细胞悬浮液层叠在各为3ml的25％、15％、10％Percoll构成的非连续梯度上，室温下25xg离心7分钟。从试管底部可得到与淋巴细胞分开的肿瘤细胞。洗涤得到的肿瘤细胞，用完全培养液悬浮后，利用台盼蓝染色法确认肿瘤细胞的生存。这样制备的这些肿瘤细胞用于以下实验。
(2)通过ELISA法确认肾细胞癌的IL-6的产生利用ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)法研究来自肾细胞癌株Caki-1，Caki-1/DDP，ACHN，A704和肾细胞癌患者(No.1-3)的新鲜肿瘤细胞的培养上清中是否存在IL-6。
向96孔的ELISA板添加100μl的IL-6抗体，至少放一晚上，用IL-6抗体覆盖ELISA板。这些板直至使用时为止可于4℃放置保存最长4周。将IL-6抗体覆盖的板洗三次，然后用含1％BSA(牛血清白蛋白)的ELISA PBS封闭一小时。洗二次后，将100μl的肿瘤细胞培养上清或作为对照的来自大肠杆菌的重组IL-6(Yasukawa等，Biotechnol.Lett.，12，419，1990)加到各孔中。
将板温育一小时，洗三次后，将100μl的抗IL-6的多克隆抗体(Matsuda，T.等.Eur.J.Immnol.，18，951-956，1988)加到各孔中。温育一小时，向各孔中加入结合了碱性磷酸酶的羊抗兔IgG，再温育一小时。将板洗净，与碱性磷酸酶底物(Sigma 104，Sigma Chemical Co.，Ltd.)一起温育。2小时后利用ELISA READER(Immunoreader，Japan IntermedCo.Ltd.制)，测定405nm的吸光度。从测试结果可清楚看到这些肾细胞癌产生了IL-6(参照表1)。
表1上清中的IL-6浓度RCC细胞 IL-6浓度(pg/ml；平均±标准偏差)Caki-1 1337±35Caki-1/DDP 3900±325A7041290±141ACHN1282±106新鲜的RCC细胞(患者No.1) 1236±71新鲜的RCC细胞(患者No.2) 42±4新鲜的RCC细胞(患者No.3) 2579±219(3)IL-6抗体或IL-6R抗体对于抗肿瘤剂的细胞毒性的影响为了研究IL-6抗体或IL-6R抗体在各种肾细胞Caki-1，Caki-1/DDP，ACHN，A704和来自患者(No.1-3)的新鲜肿瘤细胞对于各种浓度的抗肿瘤剂，即顺铂(Cis-diamminedichloroplatinum(II)、丝裂霉素C(Mitomycin C；MMC)、阿霉素(adriamycin；ADR)、长春花碱(vinblastine；VBL)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil；5-FU)的敏感性方面的影响，实施了MTT法(Mizutani，Y.等，Cancer 73，730-737，1994)。
将100μl上述的肾细胞癌肿瘤细胞悬浮液(2×104细胞)分别加到96孔底面微滴板(Corning Glass Works，Corning制)。将板放到37℃5％CO2存在加湿条件下，将肿瘤细胞培养24小时。除去细胞培养上清，用RPMI1640培养液将肿瘤细胞洗三次。在IL-6抗体(Matsuda，T.等，Eur.J.Immunol.，18，951-956，1988)或IL-6R抗体(Hirata，Y.等，J.Immunol.，143，2900-2906，1989)共存下向各孔中加入含200μl的各抗肿瘤剂的溶液或作为对照的完全培养液，37℃培养24小时。再向各孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml，Sigma Chemical Co.制)，继续于37℃、5％CO2存在加湿条件下培养4小时。从各孔中除去培养液，换成含有0.05NHcl的异丙醇(Sigma Chemical Co.制)。
用微量培养板读数仪(Immunoreader，Japan Inermed Co.Ltd.制)测定各孔溶液在540nm波长的吸光度。用下式计算细胞毒性的百分数。细胞毒性(％)＝〔1-(实验组的吸光度/对照组的吸光度)〕×100。
结果，就CaKi-1细胞来说，在与抗体共存下，由于顺铂(图1A，B)或MMC(图2A，B)引起的细胞毒性明显上升。而在加了对照抗体MOPC3/C(J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)，41，1083，1968)的实验组，没有看到在对于顺铂或MMC的敏感性方面的影响。与只加抗肿瘤剂情况相比，在抗肿瘤剂与IL-6抗体或IL-6R抗体共存下，能看出同等程度的细胞毒性效果的抗肿瘤剂的必需量是1/10-1/100。另外，在IL-6抗体或IL-6R抗体与ADR，VBL或5-FU共存下肿瘤细胞对于抗肿瘤剂的敏感性没有变化。
Caki-1/DDP细胞对顺铂的抗性在IL-6抗体或IL-6R抗体与顺铂共存下被克服了(图3A，B)。这样的IL-6抗体或IL-6R抗体与顺铂的协同作用在其它的肾细胞癌ACHN(图4A，B)、A704(图5A，B)，以及从三个患者取的新鲜肿瘤细胞(图6，7，8中的各A，B)中也同样可以看到。
实施例2IL-6抗体或IL-6R抗体在肾癌细胞对卡铂的敏感性方面的影响使用肾细胞癌株Caki-1，与上述实施例1同样研究配成各种浓度的卡铂(Carboplatin)与IL-6抗体或IL-6R抗体共存时的细胞毒性。其结果表明，Cali-1细胞对卡铂的敏感性增强(图9A，B)。
实施例3IL-6抗体或IL-6R抗体对抗肿瘤剂在细胞内蓄积的影响在10μg/ml的顺铂或100μ/ml的5-FU和作为对照的培养液、10μg/ml的对照抗体MOPC3/C、10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体组合的存在下，将Caki-1细胞培养24小时。
然后，除去培养液，用RPMI1640培养液将细胞洗三次，利用火焰原子吸光光谱仪法(Daley-Tates，P.T.等，Biochem.Pharmacol.，34，2263-2369；Riley，C.M.等，Analytical Bioehem.124，167-179，1982)测定顺铂在细胞内的蓄积。测定仪器用的是Zeeman Z-8000(Zeeman Z-8000Spectro-photometer，Hitachi Co.Ltd.制).用气相色谱/质谱法(Marunaka，T.，等，J.Pharm.Sci.，69，1246-1300，1980)测定5-FU的细胞内蓄积。用的测定仪器是装有JGC-20kp气相色谱的JMS-D300质谱仪(JOEL制)。其结果如表2所示。很明显IL-6抗体或IL-6R抗体对于顺铂、5-FU在肿瘤细胞内的蓄积没什么影响。
表2CDDP或5-FU在细胞内的蓄积(ng/107细胞)药剂 处理对照(培养液)对照Ab 抗IL-6mAb抗IL-6RmAbCDDP0.28±0.050.27±0.020.26±0.050.27±0.025-FU1.48±0.321.57±0.451.50±0.191.63±0.31数值是根据3次实验数据计算的(平均±标准偏差)
实施例4顺铂、LI-6抗体或IL-6R抗体对谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)表达的影响将Caki-1细胞与作为对照的培养液、10μg/ml的顺铂、10μg/ml的IL-6抗体或IL-6R抗体同时培养4小时。然后利用Mizutani，Y.等(Cancer 73，730-737，1994)的方法制备细胞的总RNA，于1.2％琼腊糖2.2MHCHO凝胶上每孔加10μgRNA，在含有200mMMOPS(MOPS；3-[N-吗啉代]丙磺酸)、50mM醋酸钠和10mMEDTA钠盐的1×MOPS缓冲液中电泳。然后，在含有3MNaCl、0.3柠檬酸钠(PH7.0)的20×SSC溶液中将RNA转移至BiodyneA膜上(Poll制)。通过α32P-dCTP(NEN制)用随机聚合引物伸长法标记50-100ng的GST-πcDNA探针(Nakagawa，K.等，J.Biol，Chem.265，4296-4301，1990)。将转录了RNA的上述尼龙膜用紫外线交联，使它与上述探针杂交。结果如图10所示。
顺铂对于Caki-1细胞的GST-πmRNA的表达没什么影响。但若添加IL-6抗体或IL-6R抗体则GST-πmRNA的表达降低。这些事实表明，IL-6抗体或IL-6R抗体引起肾细胞癌对顺铂的敏感性上升，GST-πmRNA表达水平下降。
使称为IL-6抗体或IL-6R抗体的IL-6拮抗剂与抗肿瘤剂共存，用很低的量也能看到肿瘤细胞对抗肿瘤剂的敏感性，利用IL-6拮抗剂与抗肿瘤剂可以看出它们发挥协同作用的结果。对于抗肿瘤剂显示出治疗抗性的肿瘤细胞，通过IL-6拮抗剂可增强对抗肿瘤剂的敏感性，证明治疗这类肿瘤是可能的。
另外，由本发明的IL-6拮抗剂构成的抗肿瘤剂的作用增强剂通过使抗肿瘤剂的必需给药量减少，可以降低抗肿瘤剂对组织的毒性，因此可以期待作为抗肿瘤剂的作用增强剂。
权利要求
1.含有白细胞介素6(IL-6)拮抗剂的抗肿瘤剂的作用增强剂。
2.权利要求1的作用作增强剂，其中IL-6拮抗剂是人IL-6的拮抗剂。
3.权利要求1或2的作用增强剂，其中IL-6拮抗剂是单克隆抗体。
4.权利要求3的作用增强剂，其中IL-6拮抗剂是IL-6抗体或IL-6受体抗体。
5.权利要求4的作用增强剂，其中IL-6拮抗剂是PM-1抗体。
6.权利要求5的作用增强剂，其中IL-6拮抗剂是人型化的PM-1抗体。
7.权利要求1～6中任一项的作用增强剂，其中抗肿瘤剂是化疗制剂。
8.权利要求7的作用增强剂，其中抗肿瘤剂是具有抗肿瘤作用的铂化合物。
9.权利要求7的作用增强剂，其中的抗肿瘤剂是丝裂霉素C。
10.权利要求8的作用增强剂，其中的抗肿瘤剂是从顺铂、卡铂(carboplatinum)、254-S、DWA-2114R或NK-121中选择的。
11.权利要求1～10中任一项的作用增强剂，其中对抗肿瘤剂的敏感性(抗肿瘤作用)被增强的肿瘤是带有IL-6受体、且以IL-6为生理活性物质表现出增殖和/或治疗抗性的肿瘤。
全文摘要
一种对抗肿瘤剂如顺铂、羰铂等铂化合物、丝裂霉素C等有增强作用的抗肿瘤剂作用增强剂,含有白细胞介素6(IL－6)拮抗剂如IL－6抗体、IL－6受体抗体、gp130抗体等构成。
文档编号A61K38/00GK1174507SQ9519747
公开日1998年2月25日 申请日期1995年12月28日 优先权日1994年12月29日
发明者吉田修, 水谷阳一 申请人:中外制药株式会社