专利名称：抗血栓药剂和抗维勒布兰德因子单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗人维勒布兰德(von Willebrand)因子的新的单克隆抗体，在显示其抗血栓作用的治疗有效剂量下，它不会引起出血。本发明还涉及产生上述单克隆抗体的杂交瘤，以及包含以上述单克隆抗体作为活性成分的抗血栓药剂。
背景技术：
在活体中，当内皮下膜由于血管壁损伤而被暴露时，通过血流而来的血小板会立即粘附于内皮下膜。这样就触发了一系列血小板激活过程，包括血小板凝集，细胞内颗粒的释放，此后就形成了血栓，并由此阻止了出血。因而，血栓形成是生理止血机制必需的和不可缺少的。但是另一方面，血栓会引起血栓性疾病，如心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞和脑血栓形成等，这些疾病随着社会的老龄化，已成为引起死亡的主要原因。这样的情况已被认为是一个严重的问题。
为了治疗和预防血栓性疾病，迄今已开发出了多种抗血栓药剂。但是，对于许多现有的抗血栓药剂，尚待解决的问题仍然是，在临床应用中疗效低，对血栓的特异性低，并存在可能引起出血的副作用。如下情况被认为是造成这种状况的原因之一。即几乎所有的抗血栓剂的设计目的，都仅仅在于抑制血小板的激活过程。用于提供活性指标的体外测定血小板凝集的方法，也不足以反映体内复杂的血栓形成过程。
由于血小板膜表面的糖蛋白与内皮下膜或血浆中的蛋白质之间的特异性结合，使得血栓形成。特别是在血栓形成的最后阶段，血小板膜上的糖蛋白IIb/IIIa(此后缩写为“GP IIb/IIIa”)是作为血纤维蛋白原受体而作用的。因而预测，GP IIb/IIIa-拮抗物可以被用作有效的抗血栓剂。在GP IIb/IIIa上的血纤维蛋白原结合位点包含RGD的氨基酸一级序列。由于合成并评价了多种RGD衍生物，根据体内动物模型和临床研究(“血栓形成和止血”，Vol.69，p.560，1993)，通过其对血小板凝集的强抑制作用，已经证实GP IIb/IIIa拮抗物具有抗血栓作用。但是，暴露出的问题是，GP IIb/IIIa拮抗物也同时抑制正常的止血机制，因此与常规的抗血栓剂相比较，作为副作用的致出血倾向显得更强(TheLencet，Vol.343，p.881，1994；The New England Journal ofMedicine，Vol.330，p.956，1994)。
另一方面，被认为在血栓形成的初始阶段发挥功能的重要蛋白质包括血小板膜表面的糖蛋白Ib(此后缩写为“GPIb”)和血浆中的维勒布兰德因子(此后缩写为“vWF”)和与vWF发生的质和量的改变有关的出血性损害包括维勒布兰德病(此后写作“vWD”)。现有的临床知识表明，与血小板机能不全(由于GP IIb/IIIa缺乏而引起的出血性疾病)的病人相比较，vWD病人几乎不发生严重的出血。因此，设想有这样一种可能性，就是通过抑制GPIb和vWF之间的相互作用，可能表现出不包含致出血倾向的强有力的抗血栓作用。但是，只有单克隆抗体和低分子量化合物ATA(金精三羧酸；Blood，vol.72，p.1898.1988)是已知的特异性抑制GPIb和vWF之间相互作用的物质。体内试验还没有证实抗GPIb单克隆抗体有任何抗血栓作用。相反，人们着重指出了抗GPIb单克隆抗体能引起血小板减少症，能延长出血时间等副作用(Blood.vol.70.344a，1987，Jpn.J.Clin Pathol.Vol.40，p.266，1992)。进而，对于拮抗vWF的那些物质，已有报导表明上述的ATA和小鼠抗猪vWF单克隆抗体BB3-BD5在动物体内实验中显示出抗血栓效能(Circulation，vol.81，p.1106，1990)。但是，对于ATA和BB3-BD5，其副作用都不能被忽视。即ATA通过抑制GPIb和vWF之间的相互作用而显示出抗血栓效果，然而ATA同时具有一些完全相反的副作用，以致于它能增强由于胶原蛋白、花生四烯酸、A23187、PAF和TXA2而引起的血小板凝集作用和释放反应(Thrombosis and Haemostasis，vol.68，p.189，1992)。另一方面，BB3-BD5在其抗血栓剂量也显示出很强的致出血倾向(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.84，p.8100，1987，SURGERY，vol.112，p.433，1992)。
如上所述，现有的抗血栓剂处于进退两难的境地，即作为医疗效果的抗血栓作用不能够与作为副作用的致出血倾向分开(在医疗有效剂量和引起副作用的剂量之间没有差别)。
最近，作为在病理状态下与血栓形成密切相关的切应力诱发的血小板凝集作用(此后缩写为“SIPA”)，吸引了研究者的注意。血管的内径很小，在动脉硬化病灶区和小动脉中，血流的速率很高。因此，由于管壁和血流之间的相互作用，在这样一些区域中产生了高切应力。在这种情况下，血液中的vWF被激活了，并且它的三级结构也发生了改变。因此，在血栓形成的过程中，vWF起了关键性的作用。即下列过程是已了解的。首先，存在于内皮下膜上的vWF与血小板膜上的GPIb相结合，使血小板粘附在管壁上。其次，存在于血浆内的vWF与血小板膜上的糖蛋白IIb/IIIa交联，使血小板开始发生凝集反应。最后导致血栓形成。
一般认为，抗菌的瑞斯托菌素或波特洛蛇毒素在体外能引起vWF发生三级结构改变，与在高切应力下的改变等同。也就是说，瑞斯托菌素或波特洛蛇毒素的存在，使vWF获得了对GPIb的结合能力。用于在体外通过利用上述特征测定vWF生理活性的方法包括，瑞斯托菌素诱发的血小板凝集(此后缩写为“RIPA”)和波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集(此后称为“BIPA”)，还包括一个用于在瑞斯托菌素或波特洛蛇毒素存在时测定vWF对GPIb结合的方法。上述方法已广泛地被应用。由于实验技术的进步，已经开发出一套装置，通过在体外实际地施加一个切应力来测定SIPA。一般认为，vWF上的相同结构域参与了任意反应中对GPIb的结合。
迄今已获得了几个抗vWF抗体，它们在体外能抑制vWF的活性。但是，它们中的大多数的反应特异性都很低，尽管它们都能抑制瑞斯托菌素依赖性反应，但几乎都不能抑制波特洛蛇毒素依赖性反应。如上所述，一般认为，瑞斯托菌素诱导的vWF上的GPIb结合位点，与波特洛蛇毒素诱导的结合位点是相似的。因此，上述抗体可能能够识别vWF上对瑞斯托菌素或波特洛蛇毒素的结合位点。严格地说，它们有可能不能抑制vWF的生理活性，因此它们显示出低的反应特异性。在这种情况下，已报导了两种抗体，即由Fujimura等(J.NaraMed.Assoc.，vol.36，p.662，1985)制备的NMC-4，和由Tuddenham等制备的RFF-VIIIRAG1，在体外都能抑制依赖于瑞斯托菌素和波特洛蛇毒素的反应(Blood，vol.177，No.1，p.113，1992)。
已有报导认为，这两种抗体的抗原决定部位存在于vWF分子的GPIb结合位点，并且它们定位于vWF分子氨基酸序列的第449和第728氨基酸残基之间。并进一步观察到，碘标记的NMC-4对vWF的结合可以被RFF-VIIIRAG1部分地抑制。根据这个事实可以认为，这二个抗原决定部位是位于彼此相当靠近的部位。并且，RFF-VII RAG1仅部分地抑制BIPA，而NMC-4能完全抑制BIPA。因此，主要是通过使用NMC-4，在vWF的科学领域内进行研究，并且已经得到了某些结果。在除人以外的动物中，NMC-4仅对大鼠vWF具有反应性。
在为了获得有关人vWF的GPIb结合位点的信息，或者为了应用单克隆抗体作为针对与vWF有关疾病的预防药剂和治疗药剂，而制备抗人vWF单克隆抗体时，由于它对人vWF具有高特异性，因此认为制备这种单克隆抗体是合乎需要的。
另一方面，在以通常的方式开发一种新药时，是不允许在没有预先用动物进行试验的情况下用人作任何试验的。在进行与vWF和抗vWF单克隆抗体的生理活性有关的体内试验时，必须使用能够以动物进行试验的单克隆抗体，即除人以外，单克隆抗体同时对动物的vWF具有反应性。此外，GP IIb/IIIa的拮抗物能强烈地抑制由于血纤维蛋白原而引起的人血小板凝集作用，而对大鼠没有效果(Thrombosis和Haemostasis，vol.70，p.531，1993)。并且，大鼠也不能发生瑞斯托菌素诱发的凝集作用。根据这些事实，一般认为大鼠和人的血栓形成机制有很大的差别。因此，用大鼠来评价任何抗vWF抗体的抗血栓作用几乎是没有意义的。相反，对于豚鼠，GP IIb/IIIa拮抗物可以抑制其血小板凝集作用。并且，还能以同人一样的方式诱发瑞斯托菌素诱导的凝集作用。因此认为，在评价抗血栓作用时，豚鼠最适合作为体内试验的动物血栓模型。
根据上述观点，只与人vWF有反应的单克隆抗体，以及对人vWF和豚鼠vWF都有反应的单克隆抗体，都是可用的。但是，这种抗人vWF单克隆抗体是未知的。
并且，已证实具有体内抗血栓作用的抗人vWF单克隆抗体也是未知的。
发明公开考虑到上述观点，本发明的一个目的是提供抗人维勒布兰德因子的单克隆抗体，特别是只与人vWF具有反应性的单克隆抗体，以及与人vWF和豚鼠vWF具有反应性的单克隆抗体，其在足以表现出抗血栓效果的治疗有效剂量下不会表现出致出血作用，本发明还提供产生上述单克隆抗体的杂交瘤，以及一种含有以任一上述单克隆抗体作为活性成分的抗血栓剂。
本发明人已成功地获得了与人维勒布兰德因子具有反应性，并且对人血小板的RIPA、BIPA和SIPA具有抑制作用的单克隆抗体，方法是用人vWF免疫小鼠，然后使被免疫的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备出杂交瘤。而且，本发明人已发现，这种单克隆抗体在体内血栓形成模型中表现出强的抗血栓作用，而不引起出血。由此，本发明得以完成。
也就是说，本发明涉及一种抗血栓药剂，它含有作为活性成分的单克隆抗体，这种单克隆抗体与人维勒布兰德因子具有反应性，对人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)具有抑制作用，并且它在显示抗血栓效果的治疗有效剂量下，不会表现致出血作用。
另一方面，本发明提供了一种具有如下特性的单克隆抗体(a)该单克隆抗体与人维勒布兰德因子具有反应性；(b)该单克隆抗体能抑制人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)；(c)该单克隆抗体能抑制豚鼠血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)和BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)；以及(d)该单克隆抗体在豚鼠体内显示出强抗血栓效果，但它不会引起出血。
另一方面，本发明提供了一种具有如下特性的单克隆抗体(A)该单克隆抗体对人维勒布兰德因子具有反应特异性；(B)该单克隆抗体能抑制人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)；以及(C)该单克隆抗体与大鼠、豚鼠和兔的维勒布兰德因子不发生反应。
另一方面，本发明提供了用于产生具有上述特性的单克隆抗体的杂交瘤，它是通过以维勒布兰德因子免疫的小鼠脾细胞和Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞融合而形成的。
下面将对本发明作详细地说明。<1>本发明的单克隆抗体本发明单克隆抗体的第一实施方案(此后称为“第一单克隆抗体”)涉及具有如下特性的单克隆抗体
(a)该单克隆抗体与人维勒布兰德因子具有反应性，(b)该单克隆抗体能抑制人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)，(c)该单克隆抗体能抑制豚鼠血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)和BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)，以及(d)该单克隆抗体在豚鼠体内显示出强抗血栓效果，但它不会引起出血。
可以通过除上述特性外还具有如下特性的单克隆抗体，对上述单克隆抗体的特定实施方案作例证性说明(e)该单克隆抗体能抑制大鼠血小板的BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)，以及(f)该单克隆抗体能抑制兔血小板的BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)。
也就是说，本发明的第一单克隆抗体具有高反应特异性，其中它与人vWF具有反应活性，对其具有高亲和性，并且在体外试验中对RIPA、BIPA和SIPA都有强抑制作用。另一方面，本发明的第一单克隆抗体还至少对豚鼠的RIPA和BIPA具有抑制作用。在下述实施例中获得的单克隆抗体，在体外还对大鼠和兔的BIPA有抑制作用。根据对豚鼠单次静脉内给药实验表明，该单克隆抗体能抑制体内RIPA和BIPA，而完全不影响血液学参数和凝血参数。该单克隆抗体在基于豚鼠的光化学反应诱发的血栓形成模型中，能延长股动脉梗阻所需要的时间，并在动静脉分路形成模型中，能延长梗阻所需要的时间。而且，当以其治疗有效剂量给予该单克隆抗体时，它的作用能持续长的时间，而不表现出血时间的延长。
具有上述特性的单克隆抗体是迄今未知的。本发明的第一单克隆抗体是一种新的单克隆抗体。本发明的第一单克隆抗体在抗原决定部位上明显与上述NMC-4的不同，不但在它与动物vWF发生反应上，并且在它完全不抑制NMC-4对vWF的结合上都说明了这点(参见下面的实施例)。本发明的该单克隆抗体在体内血栓形成模型中对血栓形成具有强抑制作用，并且没有致出血倾向，这个事实强烈地表明，本发明的单克隆抗体具有可以用作血栓性疾病理想治疗药剂的可能性。本发明的单克隆抗体不但是新的，而且具有产业应用价值。
也就是说，本发明的第一单克隆抗体不仅可用于确定vWF的GPIb结合位点，并且预期本发明的第一单克隆抗体还可以用于分析体内vWF的分布状态和存在形式，研究vWD(维勒布兰德病)的病因，并可用作对血栓性疾病有效的预防药剂和治疗药剂。此外，在评价抗血栓作用时，本发明的第一个单克隆抗体可优选地用于基于豚鼠的体内试验。
本发明单克隆抗体的第二实施方案(此后被称为第二单克隆抗体)，是具有如下特性的单克隆抗体(A)该单克隆抗体对人维勒布兰德因子具有反应特异性；(B)该单克隆抗体能抑制人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)；以及(C)该单克隆抗体不与大鼠、豚鼠和兔的维勒布兰德因子发生反应。
也就是说，本发明的第二单克隆抗体与人vWF有反应活性，并对其有高亲和性。并且，第二单克隆抗体在体外对RIPA、BIPA和SIPA都有强抑制作用。此外，第二单克隆抗体与大鼠、豚鼠和兔的vWF都不发生反应。根据这几点，第二单克隆抗体比NMC-4具有高得多的特异性。
具有上述特性的单克隆抗体也是迄今未知的。本发明的第二单克隆抗体是一种新的单克隆抗体。第二单克隆抗体在抗原决定部位上明显与上述NMC-4不同，不但在它与大鼠vWF不发生反应上，并且在它完全不抑制NMC-4对vWF的结合上都表明了这点(见下述的实施例)。根据本发明的单克隆抗体不与除人以外的vWF(如大鼠的vWF)反应的事实，可以假设本发明的单克隆抗体能识别对人特异性的特殊的抗原决定簇，这种抗原决定簇在进化过程中没有被保存下来。这个事实可以支持本发明的单克隆抗体具有高特异性的假设。本发明的单克隆抗体不仅是新的，并且具有产业应用价值。
第二单克隆抗体能特异性地强烈抑制人vWF与血小板膜GPIb间的结合。因此，象第一单克隆抗体那样，第二单克隆抗体可用于确定人vWF的GPIb结合位点，分析体内人vWF的分布状态和存在形式，并且可用于研究vWD(维勒布兰德病)的病因。因为第二单克隆抗体不与除人以外的动物的vWF发生反应，所以还没有进行基于用动物的体内抗血栓形成实验。但是，如下述实施例中所证实，第二单克隆抗体识别vWF的抗原决定部位位于第一单克隆抗体识别的抗原决定部位附近。因此，第二单克隆抗体很可能能够识别与第一单克隆抗体所识别的相同的抗原决定部位。所以可以假设，第二单克隆抗体在体内具有与第一单克隆抗体同等的作用。预期第二单克隆抗体也可以用作对血栓性疾病有效的预防药剂和治疗药剂。
第一和第二单克隆抗体还对人血小板的切应力诱发的血小板粘附(此后称为“SIPAd”)具有抑制作用。SIPAd也与病理状态下的血栓形成有关。根据用正常人血所作的实验，已经证实第一和第二单克隆抗体是以剂量依赖方式抑制SIPAd。对于目前希望用作抗血栓剂的GIIb/IIIa拮抗物，没有观察到这种抑制作用。
本发明单克隆抗体的第三实施方案是与人vWF具有反应性的单克隆抗体，并且当使此第三单克隆抗体与第一或第二单克隆抗体共同存在时，它对第一或第二单克隆抗体与vWF因子间的结合具有抑制作用。如在下述实施例中所证明的，第一和第二单克隆抗体中的一个抗体，对另一个抗体与vWF的结合具有相互抑制作用，阻止它使用与之紧密靠近的抗原决定部位或使用同一个抗原决定部位。并且，第一单克隆抗体对体内血栓模型动物具有很强的抑制血栓形成作用，而不伴有致出血倾向。根据这些事实，认为第一和第二单克隆抗体所具有的特性，如抗体对RIPA、BIPA和SIPA的抑制作用，以及它们显示出抗血栓作用但不会引起出血，是来源于抗体所识别的抗原决定部位或Opitope。因此，可以认为，对vWF因子与第一和第二单克隆抗体之间的结合具有抑制作用的单克隆抗体，也可以作为本发明抗血栓剂的有效成分。
具有上述特性的单克隆抗体可以用作药物制剂。该药物制剂特别地包含有例如下面将要述及的抗血栓剂。<2>本发明杂交瘤和单克隆抗体的产生获得本发明单克隆抗体的方法是使产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合而形成杂交瘤，所述产生抗体的细胞是用人vWF免疫的动物的细胞，然后克隆出一种杂交瘤，并对此杂交瘤或其变异体进行培养，此杂交瘤能够产生对人vWF具有反应特异性的，并能抑制人血小板RIPA、BIPA和SIPA的单克隆抗体。
按如下方法得到各种类型的单克隆抗体。即，通过克隆出能够产生对豚鼠血小板RIPA和BIPA有抑制作用的单克隆抗体的杂交瘤，并对此杂交瘤或其变异体进行培养，可以得到第一单克隆抗体。通过克隆出能够产生与大鼠、豚鼠和兔的vWF不发生反应的单克隆抗体的杂交瘤，并对此杂交瘤或其变异体进行培养，可以得到第二单克隆抗体。
可按照Khler和Milstein的方法(Nature，pp.492-495，1975)制备杂交瘤。下面将说明制备杂交瘤的方法和筛选能产生目标单克隆抗体的杂交瘤的方法。
通过以人vWF免疫动物，如Balb/c小鼠，来获得产生抗体的细胞，并从该动物制备产生抗体的细胞如脾细胞、淋巴结细胞和外周血细胞。可从人血浆中通过用如凝胶过滤法纯化而获得人vWF。
从以人vWF免疫的动物取得产生抗体的细胞之后，再与骨髓瘤细胞进行细胞融合。来源于各种动物的骨髓瘤细胞株，都可用作进行细胞融合的骨髓瘤细胞。但是，优选的是用来源于与用于制备产生抗体的细胞同种动物的细胞株。为了在细胞融合过程之后区分融合细胞和未融合细胞，优选的是使用具有标记的骨髓瘤细胞，以使未融合的骨髓瘤细胞不能存活，只有杂交瘤能够增殖。例如，以对8-氮杂鸟嘌呤有抗性的骨髓瘤细胞和产生抗体的细胞通过细胞融合而形成的杂交瘤作为正常细胞，能够在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液(HAT培养液)中增殖，而对8-氮杂鸟嘌呤抗性的骨髓瘤细胞在HAT培养液中将死亡，并且产生抗体的正常细胞也不能长时间培养生长。因此，只有杂交瘤能够被选择性地培养(Science，vol.145，p.709，1964)。根据目标抗体易于从杂交瘤培养物上清液中得到的观点，优选地是用不分泌其固有免疫球蛋白的细胞株作为骨髓瘤细胞。
细胞融合可按如下方法进行。将以人vWF免疫的小鼠的脾细胞，与在对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0-Ag14(8-氮鸟嘌呤抗性，不分泌IgG)相混合，使脾细胞对骨髓瘤细胞的比例为大约10∶1至1∶1。离心之后，向得到的沉淀中加入平均分子量为1000-6000的聚乙二醇，使其终浓度为30％～50％，进行细胞融合。也可以通过对细胞混合液施加电脉冲代替加入聚乙二醇而进行融合。
将经过融合处理的细胞悬浮于HAT培养液中，例如可用Dalbecco改性Eagle基本培养液(此后缩写为“DMEM培养液”)，它含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和10％胎牛血清。将细胞悬液分配注入96孔微量培养板或类似的培养板内，在5％CO2内，在37℃对细胞进行培养，这样只有杂交瘤能够生长。
按上述方法得到的杂交瘤是一种混合培养物，它含有能产生目的单克隆抗体的杂交瘤，此外还含有这样一些杂交瘤，它们能产生抗以混合方式包含于人vWF制备物中的其他蛋白的单克隆抗体，或者产生抗与RIPA、BIPA和SIPA无关的人vWF位点的单克隆抗体。相应地，从上述杂交瘤中筛选出产生目的单克隆抗体的细胞株。
可以通过用人vWF作抗原的酶免疫测定法，来筛选产生与人vWF具有反应性的单克隆抗体的杂交瘤。能产生对人vWF介导的RIPA和BIPA都有抑制作用的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可通过用每孔中的一部分培养液，测定其对RIPA和BIPA的抑制活性来筛选。
产生本发明第一单克隆抗体的杂交瘤，可通过筛选如下的杂交瘤而获得它能够产生与动物如豚鼠、大鼠和兔vWF结合的单克隆抗体，或者产生能抑制上述动物血小板的BIPA或RIPA的单克隆抗体，可借助酶免疫测定法如ELISA(酶联免疫吸附测定法)来测定。产生本发明第二单克隆抗体的杂交瘤，可通过筛选如下的杂交瘤而获得它能够产生表现出与除人以外动物(如兔)的vWF没有反应性的单克隆抗体。
在证实培养物中已含有产生目的单克隆抗体的杂交瘤之后，将此培养物转移至HT培养液中，它含有与HAT培养液相同的组分，只是从HAT培养液中除去了氨基喋呤。对此杂交瘤进一步培养，以借助如有限稀释法进行克隆。
如下述实施例中所述，已经获得了杂交瘤AJvW-1、AJvW-2、AJvW-3和AJvW-4。它们全部于1994年8月24日保藏于通产省国立生命科学和人体技术研究所(邮政编码305，1-3 Higashi-Icchome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，保藏号依次分别为FERM P-14486、FERM P-14487、FERM P-14488和FERMP-14489，根据布达佩斯条约，它们已于1995年9月29日转移至国际保藏中心，保藏号依次分别为FEMR BP-5247、FERM BP-5248、FERM BP-5249和FERM BP-5250。在这些杂交瘤中，AJvW-2和AJvW-4产生第一单克隆抗体，AJvW-1和AJvW-3产生第二单克隆抗体。
如在下述实施例中所表明的，由AJvW-1和AJvW-3产生的单克隆抗体属于IgGa亚类同种型，由AJvW-2产生的单克隆抗体属于IgG1亚类，而由AJvW-4产生的单克隆抗体属于IgG2b亚类。迄今已报导的NMC-4属于IgG1亚类。
可通过如下方法得到本发明的单克隆抗体在适当的培养液或在小鼠腹水液中，培养上述得到的杂交瘤，或者培养借助于有限稀释法克隆此杂交瘤而选出的变异体，例如，具有高抗体产率的该杂交瘤的一个变异体。本发明的单克隆抗体还可以用另一种方法通过如下步骤获得从得到的杂交瘤分离出与抗体产生有关的基因，再把此基因掺入表达载体，然后将此载体导入一种微生物如大肠杆菌(E.coli)，并培养由此得到的产生抗体的微生物。此杂交瘤包括上述AJvW-1、AJvW-2、AJvW-3、AJvW-4、以及它们的变异体。
用于培养该杂交瘤的培养液包括例如，基于DMEM培养液的，并补充含有胎牛血清、L-谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸钠、2-巯基乙醇和抗菌素(例如青霉素G、链霉素和庆大霉素)的培养液。本发明的杂交瘤通常在此培养液中，以含有5％CO2和95％空气的气体相，37℃培养2-4天。另一种方法是，将此杂交瘤在用2，6，10，14-四甲基正十五烷(例如姥鲛烷(Pristane，商品名)，Sigma产品)预先处理的Balb/c小鼠腹腔内培养大约10-15天。以这样的量产生的单克隆抗体，可以用于纯化处理。
借助适合于分离和纯化蛋白质的通常方法，可以从培养物上清液或腹水液中，对由此产生的单克隆抗体进行分离和纯化处理。这些方法包括例如，离心、透析、硫酸铵盐析和用如DEAE-纤维素、羟基磷灰石、蛋白A琼脂糖和蛋白G琼脂糖的柱层析。<3>本发明的抗血栓药剂本发明的抗血栓药剂包含作为活性成分的单克隆抗体，此单克隆抗体与人维勒布兰德因子具有反应性。对人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)具有抑制作用，并且在显示出抗血栓效果的医疗有效剂量下，不表现出致出血作用。更具体地说这种单克隆抗体包括本发明的第一和第二单克隆抗体。并如上所述，在使之与第一和第二单克隆抗体共同存在时，对第一和第二单克隆抗体与vWF因子之间的结合具有抑制作用的单克隆抗体，预期也具有和第一和第二单克隆抗体相同的作用，也可以用作本发明抗血栓药剂的有效成分。
在将来源于小鼠的单克隆抗体用作人抗血栓药剂时，由于抗原性和在血液中半衰期的问题，合乎要求的是将此单克隆抗体修饰成为人型的抗体。按照Jones等(Nature，vol.321，p.522，1986)和Queen等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.86，p.10029，1989)所述的方法，可使该抗体的可变区转变成人型抗体的可变区，而不失去其反应特异性。最近，Winter等和Lerner等所述的详尽克隆方法也是可以使用的方法(J.Mol.Biol.，Vol.222，p.581，1991；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.88，p.2432，1991)。
片段F(ab′)2、Fab′和Fab只要它们具有与上述单克隆抗体同样的特性，也可以用作抗血栓药剂，这些片段可通过用蛋白水解酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶消化上述单克隆抗体，然后纯化而获得。
本发明抗血栓药剂的类型或剂型包括例如，注射液、舌下片剂、皮肤敷剂、片剂或丸剂、胶囊、粒剂、糖浆剂、栓剂、软膏剂和滴注剂。其中优选的是注射液、舌下片剂和皮肤敷剂。根据剂型，本抗血栓药剂可以添加药剂学允许的赋形剂，例如乳糖、马铃薯淀粉、碳酸钙和藻酸钠。在注射液的情况下，用作溶剂的液体包括例如注射用水、生理盐水和Ringer氏液。溶剂可随分散剂一起加入。另外，除了抗-vWF单克隆抗体之外，还可以同时加入其它抗血栓成分。
本发明抗血栓药剂的给药剂量，取决于如病人的年龄和状况。但是，一般情况下，在静脉内给药时，对于成年人，用本发明的抗血栓药剂能达到预期效果的剂量范围，优选是每天0.1μg/kg-1000mg/kg，更优选的是1μg/kg-100mg/kg。其中，剂量是以作为有效成分的单克隆抗体的量表示的。
本发明的抗血栓药剂可应用于涉及抗血栓作用的一般应用。也就是说，本发明的抗血栓药剂可用于预防或治疗与血小板粘附和凝集有关的疾病。更具体地说，例如，本发明的抗血栓药剂对治疗如下疾病有效阵发性脑局部缺血发作、不稳定性心绞痛、脑梗塞、心肌梗塞和外周动脉闭塞性疾病，并对防止PTCA再闭塞和冠状动脉旁路移植的闭塞也是有效的，并且对治疗冠状动脉瓣膜移位和原发性血小板增多症有效。
附图简述
图1显示本发明实施例的抗体2和抗体4以及作为对照的NMC-4的抑制活性，是用人PRP在RIPA中测定的。
图2显示本发明实施例的抗体1和抗体3以及作为对照的NMC-4的抑制活性，是用人PRP在RIPA中测定的。
图3显示抗体2、抗体4和NMC-4的抑制活性，是用豚鼠PRP在RIPA中测定的。
图4显示抗体2、抗体4和NMC-4的抑制活性，是用人PRP在BIPA中测定的。
图5显示抗体1、抗体3和NMC-4的抑制活性，是用人PRP在BIPA中测定的。
图6显示抗体2、抗体4和NMC-4的抑制活性，是用豚鼠PRP在BIPA中测定的。
图7显示抗体2、抗体4和NMC-4的抑制活性，是用大鼠PRP在BIPA中测定的。
图8显示抗体2、抗体4和NMC-4的抑制活性，是用兔PRP在BIPA中测定的。
图9显示抗体1、抗体3和NMC-4的抑制活性，是用兔PRP在BIPA中测定的。
图10显示抗体2、抗体4和NMC-4的抑制活性，是用人PRP在SIPA中测定的。
图11显示抗体1、抗体3和NMC-4的抑制活性，是用人PRP在SIPA中测定的图12显示抗体2、抗体4和NMC-4对vWF与固定化人血小板结合的影响(存在瑞斯托菌素时)。
图13显示抗体1、抗体3和NMC-4对vWF与固定化人血小板结合的影响(存在瑞斯托菌素时)。
图14显示抗体2、抗体4和NMC-4对vWF与固定化人血小板结合的影响(存在波特洛蛇毒素时)。
图15显示抗体1、抗体3和NMC-4对vWF与固定化人血小板结合的影响(存在波特洛蛇毒素时)。
图16显示各个单克隆抗体对生物素化的AJvW-1与固定化vWF结合的影响。
图17显示各个单克隆抗体对生物素化的AJvW-2与固定化vWF结合的影响。
图18显示各个单克隆抗体对生物素化的AJvW-3与固定化vWF结合的影响。
图19显示各个单克隆抗体对生物素化的AJvW-4与固定化vWF结合的影响。
图20显示各个单克隆抗体对生物素化的NMC-4与固定化vWF结合的影响。
图21显示抗体2和抗体4的抑制作用，是在豚鼠间接体内(exvivo)RIPA中测定的。
图22显示抗体4的抑制作用，是在豚鼠间接体内BIPA测定的。
图23显示在豚鼠PIT模型中抗体2对栓塞时间的影响。
图24显示在豚鼠PIT模型中抗体4对栓塞时间的影响。
图25显示在豚鼠A-V分路模型中抗体2对栓塞时间的影响。
图26显示在豚鼠出血时间测定模型中抗体2对出血时间的影响。
图27显示在豚鼠出血时间测定模型中抗体4对出血时间的影响。
实施本发明的最佳模式下面将参照实施例对本发明作更具体的说明。但是，本发明并不被下述实施例所限制。
实施例<1>制备单克隆抗体(1)免疫致敏和细胞融合将纯化的人vWF与等量佐剂(MPL+TDM乳化液RIBI的商品名)混合，将得到的混合物对Balb/c雄性小鼠(免疫开始时为8周龄)皮下注射给药，给药量相当于每只小鼠100μg vWF的量(活化免疫)。21天后，按如上所述每次皮下注射给药(加强免疫)。加强免疫后的19天或30天，以用PBS(磷酸盐缓冲的生理盐水，Nissui产品)稀释成250μg/ml浓度的人vWF制剂200μl，对小鼠通过尾静脉给药(未次免疫)。
末次免疫的3天之后，取出小鼠的脾，并将它们分离成单细胞。随后用DMEM培养液洗脾细胞。同时收集处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14，并用DMEM培养液洗此细胞。在塑料试管中以10∶1的细胞比率将脾细胞与骨髓瘤细胞充分混匀，接着加入50％(w/v)聚乙二醇(Boehringer Mannheim产品，平均分子量4000)，在37℃下进行细胞融合7分钟。
通过离心除去上清液，并向残留物中加入HAT培养液(含有10％胎牛血清的DMEM培养液，并添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)。混悬残留物使脾细胞的浓度为5×106个细胞/ml。将此细胞悬液分配到96孔培养板中，每孔含悬液100μl，然后在5％CO2内，在37℃下进行培养。在第二天和第五天，对每孔补充HAT培养液50μl。此后，根据杂交瘤增殖的情况，每隔3天或4天更换一半量的培养液。(2)杂交瘤的筛选和克隆可通过用单克隆抗体对vWF生理活性的抑制活性作为指标，来筛选出产生本发明单克隆抗体的杂交瘤。在完成杂交瘤的增殖过程之后，从每孔中取出部分培养液作样品，测定其对RIPA和BIPA的抑制活性。选取对这两个反应都有强抑制作用的杂交瘤克隆。
再从选取的克隆中，挑选出能产生对豚鼠、兔和大鼠vWF显示有反应性的单克隆抗体的杂交瘤。将得到的杂交瘤转移至HT培养液中作进一步培养，HT培养液是与HAT培养液相同的培养液，不同的只是从HAT培养液中省去了氨基喋呤。按照有限稀释法进行两次克隆。这样可得到稳定的杂交瘤。最后得到的二株杂交瘤被命名为AJvW-2和AJvW-4。
另一方面，可从上述对RIPA和BIPA反应具有强抑制作用的克隆中，挑选出能产生与豚鼠、兔和大鼠vWF无反应的单克隆抗体的杂交瘤。将得到的杂交瘤转移至HT培养液中作进一步培养，此HT培养液是与HAT培养液相同的培养液，不同的只是从HAT培养液中省去了氨基喋呤。用有限稀释法进行两次克隆。这样可得到稳定的杂交瘤。最后得到的二株杂交瘤被命名为AJvW-1和AJvW-3。
AJvW-2和AJvW-4产生本发明的第一单克隆抗体，而AJvW-1和AJvW-3产生本发明的第二单克隆抗体。<2>单克隆抗体的制备和纯化(1)单克隆抗体的制备用2，6，10，14-四甲基正十五烷(商品名姥鲛烷，Sigma产品，0.5ml)，对出生后6-8周龄的雌性Balb/c小鼠作腹膜内注射。10-20天之后，将在PBS中的AJvW-1、AJvW-2、AJvW-3或AJvW-4细胞悬液(1×106-107细胞)对此小鼠作腹膜内接种。7-10天之后，将小鼠活杀，作开腹手术，收集产生的腹水液。将腹水液离心，除去不溶性物质，回收上清液，于-20℃贮存。(2)单克隆抗体的纯化从上述腹水上清液中，用Hi-Trap蛋白A抗体纯化试剂盒(商品名，Pharmacia产品)纯化IgG。即，向腹水液(2ml)中加入溶液A(1.5M甘氨酸，3M NaCl，pH8.9，8ml)，再用具有45μm孔径滤膜的滤器(Millipore产品)过滤。然后，将得到的滤液作柱层析，以Protein Sepharose HP(Pharmacia产品)装柱(柱容积1ml)，以溶液A充分平衡，加样后先用10倍柱体积的溶液A洗柱。接着，用10倍柱体积的溶液B(0.1M甘氨酸，pH2.8)洗脱IgG级分。将洗脱出的IgG级分对PBS进行透析，得到纯化的样品。
由AJvW-1、AJvW-2、AJvW-3和AJvW-4产生的单克隆抗体此后将依次分别被称为抗体1、抗体2、抗体3和抗体4。
用与上述同样的方法，从含有NMC-4的小鼠腹水中纯化NMC-4，以便得到一个用作对照的样品。<3>测定单克隆抗体的亚类(subclass)用上面<2>中得到的纯化抗体，借助于商品化的亚类测定试剂盒(商品名Mono Ab-ID EIA kit A，Zymed产品)，测定本发明单克隆抗体的IgG亚类。此方法基于ELISA测定法。结果是，抗体1、抗体2、抗体3和抗体4全部都属于IgG类。测定还表明，抗体1和抗体3的亚类是IgG2a同种型，抗体2的亚类是IgG1同种型，而抗体4的亚类是IgG2b同种型。如迄今所报导的，NMC-4属于IgG1。<4>本发明的单克隆抗体对血小板凝集的抑制活性(1)对RIPA的抑制活性将从正常人输血者得到的血液与3.8％柠檬酸钠混合，比率为9∶1，然后以1100rpm转速离心10分钟，制得富含血小板的血浆(PRP)。使PRP(3×108血小板/ml，225μl)与各种浓度的单克隆抗体(2μl)在37℃反应3分钟。此后，将瑞斯托菌素(Sigma产品)加入其中，使其终浓度为1.5mg/ml。用测定血小板凝集能力的仪器(商品名HEMATRCER，Niko Bioscience产品)，在37℃监测血小板凝集作用10分钟。以透光度改变表示血小板凝集程度。用加入DMEM或溶解样品的缓冲液得到的最大凝集作为对照，测定对血小板凝集的抑制活性。
结果显示在图1(抗体2、4)和图2(抗体1、3)中。抗体1、抗体2、抗体3、抗体4和NMC-4都以剂量依赖方式抑制人RIPA。IC50值对抗体1是0.8μg/ml，对抗体2是3.5μg/ml，对抗体3是1.0μg/ml，对抗体4是2.0μg/ml，对NMC-4是0.7μg/ml。
以与上述相同的方式制备豚鼠PRP，向其中加入瑞斯托菌素，使其终浓度为1.75mg/ml，并以与上述相同的方法进行测定。抗体1(终浓度为80μg/ml)抗体3(终浓度为80μg/ml)和NMC-4(终浓度为27μg/ml)完全不抑制豚鼠的RIPA，而抗体2和抗体4以剂量依赖性方式抑制豚鼠RIPA(图3)。IC50值对抗体2是0.4μg/ml，对抗体4是1μg/ml。(2)对BIPA的抑制活性在测定BIPA之前，需先将从蝮蛇得到的粗制毒液(Sigma产品)纯化制备蛇毒液，即波特洛蛇毒素。也就是，将1g粗制毒液溶解于含有0.15M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，以3000rpm转速离心除去不溶性物质。得到的上清液用Sephadex G-75柱(5×90cm，Pharmacia产品)进行凝胶过滤。收集相应于洗脱量为480-570ml范围内的级分，并用超滤浓缩器(DIAFLO YM-10，Amicon产品)将得到的溶液浓缩成20ml的体积。此后，将此浓缩液对基于用DEAE-TOYOPEARL-650M的离子交换柱(1.6×32cm，Pharmacia产品)加样，随后用0至0.3M NaCl的浓度梯度液洗脱。收集600和640分钟之间的洗脱级分，并用上述相同的方法将得到的溶液浓缩至4ml体积。然后以含有0.15M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)作溶剂，将此浓缩液对凝胶过滤柱(Sephadex G-75，2.6×90cm，Pharmacia产品)加样。回收具有强血小板凝集活性的级分，以合并的溶液作纯化的样品。
使人PRP(3×108血小板/ml，225μl)与各种浓度的单克隆抗体(2μl)，在37℃反应3分钟。然后向反应混合物内加入上述波特洛蛇毒素，使其终浓度为5μg/ml，按照与上面<1>中所述的相同方法测定血小板凝集作用。结果显示在图4(抗体2、4)和图5(抗体1、3)中。抗体1、抗体2、抗体3、抗体4和NMC-4都以剂量依赖性方式抑制BIPA。IC50值对抗体1是0.8μg/ml，对抗体2是2.0μg/ml，对抗体3是1.0μg/ml，对抗体4是5.6μg/ml，对NMC-4是2.0μg/ml。
按与上述相同的方法制备豚鼠PRP，对其中加入波特洛蛇毒素，使其终浓度为2μg/ml，并按与上述相同的方法进行测定。抗体1(终浓度为80μg/ml)，抗体3(终浓度为80μg/ml)和NMC-4(终浓度为27μg/ml)完全不抑制BIPA，而抗体2和抗体4以剂量依赖性方式抑制BIPA(图6)。IC50值对抗体2是3.1μg/ml，对抗体4是3.5μg/ml。
通过以1300rpm离心大鼠柠檬酸化血液10分钟而制备PRP。对此PRP(5×108血小板/ml)加入波特洛蛇毒素，使其终浓度为0.08μg/ml，并按与上述相同的方法进行测定。抗体1(终浓度为80μg/ml)和抗体3(终浓度为80μg/ml)完全不抑制大鼠BIPA，而抗体2、抗体4和NMC-4以剂量依赖性方式抑制BIPA(图7)。IC50值对抗体2是1.2μg/ml，对抗体4是5.0μg/ml，对NMC-4是2.2μg/ml。
通过以1200rpm转速离心兔柠檬酸化血液10分钟，制备PRP。向此PRP(3×108血小板/ml)中加入波特洛蛇毒素，使其终浓度为0.075μg/ml，并按与上述相同的方法进行测定。结果显示在图8(抗体2、4)和图9(抗体1、3)。抗体1(终浓度为80μg/ml)、抗体3(终浓度为80μg/ml)和NMC-4(终浓度为27μg/ml)完全不抑制兔BIPA，而抗体2和抗体4以剂量依赖性方式抑制BIPA。IC50值对抗体2是5.0μg/ml，对抗体4是1.8μg/ml。(3)对SIPA的抑制活性使人PRP(2.5×108血小板/ml，360μl)与各种浓度的单克隆抗体(40μl)在室温下反应10分钟。然后用测定细胞功能的仪器(Toray产品)，测定由切应力诱发的血小板凝集。也就是说，按如下方式对反应混合物施加切应力在0-15秒的时间内，施加6达因/cm2的恒定切应力，在15-105秒的时间内，施力6→12达因/cm2的低梯度切应力，在105-225秒的时间内，施加12→108达因/cm2的高梯度切应力，而在最多350秒的时间内，施加108达因/cm2的恒定切应力。以透光度的改变代表血小板凝集活性的大小。用加入DMEM或溶解样品的缓冲液得到的最大凝集作为对照，来测定对血小板凝集的抑制活性。
结果显示在图10(抗体2、4)和图11(抗体1、3)中。抗体1、抗体2、抗体3、抗体4和NMC-4，都以剂量依赖性方式抑制人SIPA。IC50值对抗体1是0.7μg/ml，对抗体2是1.1μg/ml，对抗体3是0.9μg/ml，对抗体4是1.5μg/ml，对NMC-4是1.5μg/ml。<5>本发明的单克隆抗体对人vWF的亲和性(1)人vWF的125I标记将碘原(iodogen，Pierce产品，1mg/ml)和二氯甲烷液(1ml)加入聚丙烯小试管中，再用氮气流除去其中的溶剂。向此聚丙烯小试管中注入人vWF溶液(0.43mg/ml)，并加入Na125I溶液(15.9MBq，8.6μl)，在室温下反应2分钟。反应后，将此反应液对PD10柱(Pharmacia产品)加样，加样前先将该柱用含2ml 10％BSA(牛血清白蛋白)的TBS溶液(Tris缓冲液)闭封处理，并用100ml TBS洗柱。用TBS进行洗脱。将洗脱液分级分离成每分500μl的级分。每洗脱液级分取等分量(2μl)，用γ-计数器测定其放射活性(计数时间为1分钟)。收集具有高计数值的级分，合并的级分(1ml)被称为125I标记的人vWF溶液(125I-vWF)(0.3mg/ml，人vWF，220630cpm/μl)。(2)制备固定化血小板将按与上述<4>(1)项中所述相同方法收集的人PRP加入与等量2％多聚甲醛溶液混合，随后在4℃静置过夜。通过离心收集固定化的血小板，并用PBS洗三次。然后将此固定化血小板再混悬于PBS中，使之具有与收集PRP时相等的体积，得到固定化血小板悬液。(3)本发明的单克隆抗体对vWF结合血小板特性的影响先用含有1％BSA的PBS封闭96孔过滤板，然后将固定化血小板悬液，不同浓度的抗体液和瑞斯托菌素液或波特洛蛇毒素液，分配到孔中，再加入125I-vWF液，随之在室温下静置30分钟。在滤板静置之后，通过真空过滤除去未与固定化血小板结合的125I-vWF，并用含有0.05％吐温-20的PBS洗滤器。通过用γ计数器测定存留在滤器上的125I(总计时间1分钟)，来确定人vWF对固定化血小板的结合量。存在抗体时的人vWF与血小板的结合量，对不存在抗体时人vWF与血小板的结合量之间的比率，被命名为结合率(％)。
存在瑞斯托菌素时得到的结果显示在图12(抗体2、4)和图13(抗体1，3)中。存在波特洛蛇毒素时得到的结果显示在图14(抗体2，4)和图15(抗体1，3)中。抗体1、抗体2、抗体3、抗体4和NMC-4都能以剂量依赖性方式抑制vWF对血小板的瑞斯托菌素依赖性结合和波特洛蛇毒素依赖性结合。瑞斯托菌素依赖性反应的IC50值对抗体1是0.37μg/ml，对抗体2是1.1μg/ml，对抗体3是20.0μg/ml，对抗体4是0.95μg/ml，对NMC-4是0.35μg/ml。及波特洛蛇毒素依赖性反应的IC50值对抗体1是1.2μg/ml，对抗体2是0.9μg/ml，对抗体3是2.1μg/ml，对抗体4是0.9μg/ml，对NMC-4是0.3μg/ml。<6>抗体1、抗体2、抗体3和抗体4的抗原决定部位与NMC-4的抗原决定部位的比较为了将抗体1、抗体2、抗体3和抗体4的抗原决定部位，与NMC-4的抗原决定部位进行比较，研究了抗体1、抗体2、抗体3和抗体4对NMC-4与固定化的人vWF结合的抑制作用。
用生物素化试剂盒(Biotinylation kit，Amersham商品名)对纯化的抗体1、抗体2、抗体3、抗体4和NMC-4进行生物素化，分别制得如下样品生物素化的抗体1、生物素化的抗体2、生物素化的抗体3、生物素化的抗体4和生物素化的NMC-4。即，向经过对PBS液透析处理的各个单克隆抗体溶液加入生物素-间隔臂-N-羟基琥珀酰亚胺酯，在室温下反应1小时，然后用Sephadex G25柱(Pharmacia产品)纯化。
将溶解于PBS液的人vWF(5μg/ml)，以每孔50μl的量加到E.I.A微量滴定板中(Linbro/Titertek产品)，然后在4℃上静置过夜。这样，人vWF被固定化了。第二天，用清洗液(含有0.05％吐温-20的PBS)对每个孔洗3次，再加入含有0.5％BSA的PBS液，然后在室温下放置1.5小时。这样，封闭了所有未吸附蛋白质的部分。
在Eppendorf管内，使每种生物素化抗体与未生物素化的抗体1、抗体2、抗体3、抗体4或者NMC-4混合，将得到的各种溶液以50μl的量加到上述各人vWF固相化的孔中，在37℃培育1小时。洗孔之后，每个孔加入以含有0.05％吐温-20和1％BSA 0.05M TBS稀释500倍的链亲和素-碱性磷酸酶(Amersham产品)溶液50μl，然后在37℃反应1小时。
洗孔之后，对每个孔加入100μl显色底物，即对硝基苯磷酸(Sigma产品)，随后被静置20分钟。根据在405nm的吸光度，测定生物素化抗体对人vWF的结合。以与上述相同的方法测定存在过量(100倍)非生物素化抗体时的非特异性结合。从前面的测定值中扣除后面的测定值，得到的值被称为比吸收度。
结果显示在图16至20中。抗体1、抗体2、抗体3和抗体4完全不抑制生物素化NMC-4对固定化vWF的结合，而它们能相互抑制生物素化抗体1、生物素化抗体2、生物素化抗体3和生物素化抗体4对固定化vWF的结合。另一方面，NMC-4也完全不抑制生物素化抗体1、生物素化抗体2、生物素化抗体3和生物素化抗体4对固定化vWF的结合。根据上述结果可以证明，vWF上对抗体1、抗体2、抗体3和抗体4的抗原决定部位，是位于彼此相邻的部位，但它们与对NMC-4的抗原决定部位不同。<7>对豚鼠血小板凝集的抑制作用(间接体内)以PBS将上面<2>中纯化的抗体2和抗体4调配成各种浓度，并以100μg/kg或300μg/kg的剂量将它们对豚鼠(雌性，430-600克)作静脉内注射(每组4只豚鼠)。用PBS作安慰剂对照。5分钟之后，在乙醚麻醉下从动物腹主动脉以柠檬酸法采血，用于制备PRP(血小板数量为3.0×108/ml)，并按照与<4>中所述的相同方法测定RIPA或BIPA。以PBS给药组的最大凝集率作为100％，计算每个抗体对血小板凝集的抑制百分数。
结果显示在图21和22中。抗体2和抗体4以剂量依赖性方式抑制RIPA。ED50值(对血小板凝集有50％抑制的值)对抗体2是70μg/kg，对抗体4是90μg/kg。对于BIPA，抗体4的ED50值是55μg/kg，抗体2和抗体4对RIPA和BIPA的强抑制作用可持续到给药后6小时，48小时后才消失。
与上述测定分开进行的，还有用自动血液学分析仪(Sysmex E-2000，Toa Medical Electronics产品)对给予抗体后5分钟以柠檬酸法采集的全血有关的血液学参数进行了测定。抗体2或抗体4的给药剂量是100μg/kg或300μg/kg。总之，没有观察到下列参数任何显著的改变总血小板计数，总红细胞计数，总白细胞计数，血红蛋白的浓度，血细胞比容值，平均细胞容积，平均细胞血红蛋白量，平均细胞血红蛋白浓度，红细胞分布范围，血小板分布范围，平均血小板容积，白细胞大细胞比率和血小板血细胞比容值。
借助于离心，以与上述相同的方法，从给予抗体后5分钟得到的血液中分离出血浆。用凝固参数测定仪(Sysmex CA-3000，ToaMedical Electronics产品)，对该血浆测定激活部分促凝血酶原激酶的时间、激活凝血酶原的时间和血纤维蛋白原的浓度。结果表明，即使抗体2或抗体4的给药剂量达到1000μg/kg，各个参数都未见任何显著的改变。<8>本发明的单克隆抗体对豚鼠(体内)血栓形成的预防作用(1)对在豚鼠颈动脉中光化学诱发血栓模型血栓形成预防作用的评价(PIT模型)可根据Nakajima等(Thrombosis Research，vol.67，p.435，1992)的方法，在豚鼠颈动脉中形成栓塞性血栓，这样，可以在给予或不给予抗体2或抗体4的情况下，测定血栓形成的时间。
在用乌拉坦麻醉下暴露和剥离出豚鼠颈动脉，对其安装脉冲多普勒血流量计探头。通过颈动脉插管，以30、100或300μg/kg的剂量给予抗体2、抗体4或生理盐水。5分钟之后，通过同一插管，以10mg/kg剂量给予光致敏物，即玫瑰红。同时，用成血栓光源(HamametsuPhotonics产品)，以540nm激发性绿光照射位于探头安装部位上游的血管(位于心脏侧)，以便测定由于血栓形成致使血管栓塞和血流停止的时间(栓塞时间)。
结果显示在图23和24中。抗体2和抗体4在给药剂量不小于100μg/kg时，能显著地延长栓塞时间。用Mann-Whiteny U测验进行统计学处理。在图23和24中，符号*表示P＜0.05，符号**表示P＜0.01。(2)以A-V分路模型评价对血栓形成的预防作用在乌拉坦麻醉下，将聚乙烯管插入豚鼠左颈静脉，以30、100或300μg/kg的剂量给予抗体2或生理盐水。5分钟之后，将此插管的另一端插入右颈静脉，以形成分路，并再次开放血流。用脉冲多普勒血流量计测定血流停止的时间(栓塞时间)。
结果显示在图25中。抗体2在给药剂量不小于100μg/kg时，能显著地延长栓塞时间。用Mann-Whiteny U测验进行统计学处理。在图25中，符号*表示P＜0.05，符号**表示P＜0.01。(3)对出血时间延长的评价在戊巴比妥麻醉下，以100或300μg/kg的剂量对豚鼠静脉内给予抗体2、抗体4或生理盐水。5分钟之后，切开足底动脉，切口长度5mm以上。以粘附于滤纸的血迹作指示，每15秒钟检查1次伤口是否出血。测定从切开伤口到停止出血所需要的时间。
结果显示在图26和27中。在1000μg/kg的剂量下抗体2和抗体4能延长出血时间。在300μg/kg的给药剂量下，抗体2和抗体4完全不影响出血时间，而在上述PIT模型和A-V分路模型中，在此剂量下它们表现出延长栓塞时间的作用。用Mann-Whiteny U测验进行统计学处理。在图26和27中，符号*表示P＜0.05，符号**表示P＜0.01。
根据上述实验结果，可以证明，当对活体动物给药时，抗体2和抗体4显示出对血栓形成有强抑制作用，而不表现有致出血倾向，否则出血将引起临床问题。
产业可利用性按照本发明得到的单克隆抗体对vWF具有强亲和性的高反应特异性，它具有与迄今所知道的抗vWF单克隆抗体不同的抗原决定部位，并能够用作抗血栓剂的活性成分。可以预期，本发明的抗血栓剂，可以被用作对与vWF有关的疾病(例如，血栓性疾病和不稳定性心绞痛)特别有效的预防药剂和治疗药剂。另外，用本发明的单克隆抗体，还能得到有关vWF的GPIb-结合位点的非常有用的信息。
并且，本发明的第一单克隆抗体与豚鼠vWF具有反应性，因此有可能用豚鼠进行例如生理活性试验和副作用试验。
权利要求
1.一种抗血栓药剂，它含有作为活性成分的单克隆抗体，这种单克隆抗体与人维勒布兰德因子具有反应性，对人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)具有抑制作用，并且它在显示抗血栓效果的治疗有效剂量下，不会产生致出血作用。
2.权利要求1的抗血栓药剂，其中的单克隆抗体是由杂交瘤产生的，该杂交瘤是通过将小鼠骨髓瘤细胞与用人维勒布兰德因子免疫的小鼠脾细胞融合而形成的。
3.权利要求2的抗血栓药剂，其中的杂交瘤是AJvW-1、AJvW-2、AJvW-3、AJvW-4或者其中任意一个的变异体。
4.一种具有如下特性的单克隆抗体(a)该单克隆抗体与人维勒布兰德因子具有反应性；(b)该单克隆抗体能抑制人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)；(c)该单克隆抗体能抑制豚鼠血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)和BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)；以及(d)该单克隆抗体在豚鼠体内显示出强抗血栓作用，但它不会引起出血。
5.权利要求4的单克隆抗体，它是由杂交瘤产生的，该杂交瘤是通过将小鼠骨髓瘤细胞与用人维勒布兰德因子免疫的小鼠脾细胞融合而形成的。
6.权利要求5的单克隆抗体，其中的杂交瘤是AJvW-2、AJvW-4或其中任意一个的变异体。
7.一种具有如下特性的单克隆抗体(A)该单克隆抗体对人维勒布兰德因子具有反应特异性，(B)该单克隆抗体能抑制人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)，BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)，以及(C)该单克隆抗体与大鼠、豚鼠和兔的维勒布兰德因子不发生反应。
8.权利要求7的单克隆抗体，它是由杂交瘤产生的，该杂交瘤是通过将小鼠骨髓瘤细胞与用人维勒布兰德因子免疫的小鼠脾细胞融合而形成的。
9.权利要求8的单克隆抗体，其中的杂交瘤是AJvW-1、AJvW-3或其中任意一个的变异体。
10.一种单克隆抗体，它与人vWF因子具有反应性，并且当使该单克隆抗体与权利要求6或9中限定的单克隆抗体共同存在时，该单克隆抗体对权利要求6或9中限定的单克隆抗体与vWF因子之间的结合具有抑制作用。
11.一种用于产生权利要求5中限定的单克隆抗体的杂交瘤，它是通过将Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞与用维勒布兰德因子免疫的小鼠脾细胞融合而形成的。
12.权利要求11的杂交瘤，它是AJvW-2、AJvW-4或其中任意一个的变异体。
13.一种用于产生权利要求8中限定的单克隆抗体的杂交瘤，它是通过将Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞与用维勒布兰德因子免疫的小鼠脾细胞融合而形成的。
14.权利要求13的杂交瘤，它是AJvW-1、AJvW-3或其中任意一个的变异体。
全文摘要
一种被用作抗血栓药剂活性成分的单克隆抗体,它与人维勒布兰德因子具有反应性,对人血小板的RIPA(瑞斯托菌素诱发的血小板凝集)、BIPA(波特洛蛇毒素诱发的血小板凝集)和SIPA(切应力诱发的血小板凝集)具有抑制作用,并且,它在显示抗血栓效果的治疗有效剂量下,不会表现致出血作用。
文档编号A61K38/00GK1174575SQ95197474
公开日1998年2月25日 申请日期1995年11月29日 优先权日1994年11月30日
发明者长野充代, 山本浩史, 鬼头守和, 吉元良太, 小林干 申请人:味之素株式会社