专利名称：含有吸附于磷酸铝上的多糖缀合抗原的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有与载体蛋白相连的缀合多糖抗原的新的疫苗制剂，本发明具体涉及抗原吸附于磷酸铝上的预防嗜血乙型流感病毒(Hib)感染的疫苗制剂，本发明也涉及多价疫苗，即用于改善或治疗一种以上疾病状态的疫苗，本发明也涉及这种疫苗的生产及其在医药上的应用。
现有技术中已知利用多糖的疫苗，例如用于预防嗜血乙型流感病毒(Hib)感染的疫苗是以与载体蛋白缀合的荚膜多糖(PRP)为基础的。该多糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物，这些疫苗典型地以简单的(即没有佐剂)制剂形式存在，尽管在一种情况下，(由Merck生产的Pedvax Hib)利用了含有氢氧化铝的稀释剂以重建冻干的缀合物。载体蛋白典型地是白喉或破伤风类毒素或脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白。这种缀合疫苗抗原的例子公开于US 4 365 170，US 4 673 574，EP 208 375，EP 477508和EP 161 188。
可以将这种缀合疫苗与其他抗原或疫苗同时施用，这涉及到多次注射，与多次注射相关的问题包括更复杂的施用方法和大的总注射体积。当疫苗给婴儿使用时，这是一个十分严重的问题。
因此建议生产联合疫苗，一个众所周知的联合疫苗提供抗白喉、破伤风和百日咳芽胞杆菌(B.pertussis)感染的保护，此疫苗含有整个细胞或无细胞的百日咳成分，所述成分典型地由两或三种抗原组成(去毒的PT，FHA和经常但不是全部为69KDa)，尽管在某些情况下，其他百日咳芽胞杆菌(B.pertussis)抗原也可存在并使白喉和破伤风毒素类毒素化。这种疫苗经常指的是DTPw或DTPa，也可以在这种联合疫苗中加入合乎需要的其他抗原以预防如乙型肝炎或脊髓灰质炎的疾病。
可以在此联合中加入多糖缀合疫苗，然而我们已发现成分的简单混合会导致降低对多糖成分的抗体滴度。
本发明人已发现如果将缀合抗原吸附于磷酸铝上即可抑制这种降低，相反，如果抗原被吸附于氢氧化铝上，对多糖成分的抗体滴度彻底降低。
因此本发明提供了含有吸附于磷酸铝上的多糖缀合抗原的疫苗组合物，此抗原优选为得自与载体蛋白缀合的Hib的荚膜多糖(PRP)。
载体蛋白优选为白喉或破伤风类毒素，白喉Crm197蛋白或如N.enigitidis的细菌的外膜蛋白。
通过任何已知的偶联技术都可制备多糖缀合物，例如可通过硫酯键偶联多糖，此缀合法依靠用1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)激活多糖以形成氰酸酯，因此被激活的多糖可直接或通过间隔基与载体蛋白上的氨基基团偶联，优选使氰酸酯与己烷二胺偶联，使用涉及硫酯键形成的异连接化学(heteroligation)使氨基-衍生化的多糖与载体蛋白缀合。这种缀合物描述于PCT公开申请WO93/15760 Uniformed Services University。
也可通过US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中描述的直接还原氨基化法制备缀合物，其他方法描述于EP-0-161-188，EP-208375和EP-0-477508中。
另一个方法涉及通过碳二亚胺缩合使被溴化氰激活又被己二酸酰肼(ADH)衍生化的多糖与蛋白载体偶联，这种缀合描述于Chu C.等感染免疫(Infec Immurnity)，1983 245 256。
在本发明优选的实施方案中，PRP多糖与载体蛋白的比例由典型的1∶3降至1∶0.3-1∶2，这种低比例的缀合物是有利的，因为即使在没有佐剂的状态下，它们也不会遇到干扰的问题。
在本发明优选的实施方案中，该制剂优选含有至少一种可提供抗一种或多种选自下列病原的保护作用的抗原的其他成分甲肝病毒(HAV)，白喉，破伤风，百日咳，乙肝和脊髓灰质炎病毒。
在本发明范围内的特殊的组合疫苗包括DTPa(白喉-破伤风-无细胞的百日咳)-Hib联合疫苗制剂，Hib-乙型肝炎疫苗制剂，DTPa-Hib-乙型肝炎疫苗制剂和IPV(灭活的脊髓灰质炎疫苗)-DTPa-Hib-乙型肝炎疫苗制剂。
上述联合疫苗可任选包括具有抗甲型肝炎的保护作用的成分。
用于这种疫苗的适当成分已经可以商购，可从世界卫生组织得到详情。例如，IPV成分可以是Salk灭活脊髓灰质炎疫苗，白喉、破伤风和百日咳疫苗可含有无细胞的产物，如Infanrix DTPa(SmithKline Beecham Biologicals)，提供抗甲型肝炎的保护作用的成分优选为已知为‘Havrix’(SmithKlineBeecham Biologicals)的产物，它是得自HAV的HM-175株的被杀死的减毒疫苗[见灭活甲肝候选疫苗(‘Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A’)，F.EAndre，AHepburn and E.D Hondt，医学病毒学进展(Prog.Med.Virol).Vol 37，page 72-95(1990)and‘Havrix’产品专题(the product monograph‘Havrix’published by SmithKline Beecham Biologicals)(1991)]。乙型肝炎病毒成分可含有‘Engerix-B’的‘S’抗原。
根据本发明的有利的嗜血乙型流感病毒或联合疫苗是小儿科疫苗。
疫苗的制备一般描述于疫苗设计-亚单元和缀合物方法(VaccineDesign-The Subunit and adjuvant approach)Ed Powell and Newman，Pellum Press.包入脂质体囊描述于例如Fullerton的美国专利4,235,877。蛋白质与大分子的缀合公开于如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等人的美国专利4,474,757。
每一疫苗剂量中缀合抗原的量选定为在典型的疫苗中可诱导免疫保护性应答而没有显著的，有害的副作用的量，这种量依据所用特殊免疫原的不同而有所不同，一般希望每一剂量含有1-1000ug总免疫原，优选2-100ug，最优选4-40ug。可通过涉及观察抗体滴度和受试者的其他反应的一般性研究确定对于特殊疫苗而言的最适量，受试者可以约4周为间隔接受一至两次加强注射。
根据本发明的另一方面，提供了含有吸附于磷酸铝上的缀合抗原的疫苗的生产方法，所述吸附优选在pH5-6之间进行，优选在约5.4时进行。在一个实施方案中，将疫苗在放置超过24小时后冷冻干燥，另外本发明的疫苗可以液体形式与其他抗原联合。
本发明进一步提供了这种疫苗的首次医学应用。
本发明的另一个实施方案提供了预防或改善嗜血乙型流感病毒感染的方法，此方法包括施用无毒的有效量的本发明疫苗。
下列实施例将阐明本发明。实施例1含有吸附于磷酸铝上的与破伤风类毒素缀合的HiB多糖的疫苗制剂合成嗜血乙型流感病毒荚膜多糖(PRP)破伤风类毒素(TT)缀合物1.a溴化氰偶联通过在NIH下开展的偶联化学(Chu C.et al(1983)，进一步研究嗜血乙型流感病毒和6A型肺炎球菌缀合多糖蛋白的免疫原性(further studies on theimmunogenicity of Haemophilus influenzae type b and pneumococcal type 6Apolysaccharide protein conjugates)。感染免疫(infec Immunity)，245-256)进行PRP和TT的共价偶联，在控制的条件下，用溴化氰激活并用己二酸酰肼间隔基衍生化PRP。
衍生化后，通过渗滤纯化被激活的多糖(PRP-AH)，通过碳二亚胺缩合使两个纯化的成分(PRP-AH和TT)偶联，然后通过超滤和凝胶过滤纯化缀合物以除去试剂和未缀合的PRP和TT。PRP-TT缀合物的合成1.b CDAP偶联将30mg天然Hib PRP溶于6ml 2M NaCl中，在多糖溶液(来自100mg/ml的于乙腈中的储存溶液)中加入225mcl的CDAP(1-氰-4-二甲基氨基-吡啶四氟硼酸盐)，90秒后，加入450mcl 0.2M的三乙胺，激活在pH10.0下进行，冰上1分钟，室温下分钟。
在激活的多糖中加入90mg破伤风类毒素(最初的PS与蛋白质的比例为1比3)，偶联反应在室温下进行1小时，然后，在室温下用3ml 1M的甘氨酸溶液，pH5.0淬灭反应30分钟，并在4℃下过夜。
通过在用0.2M NaCl平衡过的sephacryl HR 500柱上凝胶过滤纯化缀合物，测定每一级分中的糖类和蛋白质的含量，收集缀合物并无菌过滤(膜Minisart 0.222γm)。吸附于磷酸铝上1.c在0.15mg磷酸铝中加入12.5mcg实施例1(a)中的多糖缀合物，搅拌2小时，将pH调至5.1，将混合物在室温下放置一天，再将被吸附的缀合物在2至8℃下放置9天，为了制备冻干的产物，将被吸附的产物在乳糖(15.75mg)中稀释以得到25mcg多糖/ml和0.4mg Al/ml的最终组合物，将所得最终组合物装入0.5ml小瓶中冻干。
为了制备液体产物，将被吸附的缀合物在水中稀释以与150mM NaCl和5mg/ml苯氧基乙醇注射得到20mcg多糖/ml和0.32mgAl/ml的最终组合物。
1.d根据WO93/24148(SmithKline Beecham Biologicals)的方法配制含和不含乙型肝炎病毒的白喉破伤风和百日咳(无细胞的)疫苗。
1.e制备‘低比例’PRP-TT磷酸铝预-吸附缀合物。
用与实施例1.a相似，但是所用的破伤风类毒素的量(30mcg，60mcg)有所降低的方法制备缀合物，得到多糖蛋白质的比例为1∶1或1∶2的产物，然后根据实施例1c的方法，将缀合物吸附于磷酸铝上，最终的冻干制品含有12.5μg缀合物，0.15mgALPO4，15.75mg乳糖，使用前在0.5ml注射用水，pH0.1+/-0.1中重建。实施例2预吸附于磷酸铝上并与DTPa或DTPa-HB联合的PRP-TT缀合物的免疫原性在注射前，将普通或预吸附于ALPO4上的实施例1a)中的Hib缀合物(两种疫苗都被冻干)与DTPa或DTPaHB混合不超过1小时，将此联合疫苗以相当于1/20人剂量的剂量(0.5μgPRP)通过皮下途径注射幼鼠(1周龄)，2周和4周后对小鼠加强免疫，每次免疫接种后收集血清以测量抗-PRP抗体，对照包括在盐水中重建的Hib疫苗(吸附或未吸附于ALPO4上)。
在0-14-28天用1/20人剂量的Hib疫苗，单独或与DTPa或DTPaHB(1/20th人剂量)联合将随机抽取的10只幼鼠组(1周的ago-OFA株)皮下免疫3次，在免疫接种前，用盐水或联合(DTPa或DTPaHB)重建冻干的Hib疫苗不超过1小时。
在14-28-56天，麻醉下取鼠血，通过单个血清的ELISA测量抗-PRP的抗体，使用校正参比以γ/ml表示滴度，计算每一组每一时间点的GMT，计算第三次免疫接种后所得滴度的95％置信限。
如表1所示，Hib缀合物吸附于ALPO4没有修饰其免疫原性如在婴儿中见到的，第二次剂量后产生了一些抗-PS，第三次剂量后显示出良好的加强免疫效果。将Hib疫苗与DTPa或DTPaHB混合使抗-PRP反应降低了3至8倍，在DTPaHB情况下，这一降低更加明显。相反，在ALPO4预吸附的Hib疫苗将抗-PRP反应恢复到至少与普通疫苗相等的水平。结论因而，该Hib/磷酸铝制剂具有解决当将Hib与其他小儿科联合疫苗混合时所遇到的相容性问题的潜力。
表1预吸附于ALPO4上并与DTPa或DTPa-HB联合的PRP-TT缀合物在幼鼠模型中的免疫原性
权利要求
1.疫苗组合物，它含有吸附于磷酸铝上的多糖缀合抗原。
2.权利要求1所要求的疫苗，其中抗原是得自与载体蛋白缀合的嗜血乙型流感病毒的荚膜多糖。
3.权利要求1或2所要求的疫苗，其中载体选自含有白喉类毒素，白喉CRM197蛋白，脑膜炎球菌外膜蛋白和破伤风类毒素的组中。
4.权利要求1，2或3所要求的疫苗，其中载体蛋白是破伤风类毒素。
5.权利要求1-4中任一个所要求的疫苗，其中多糖与蛋白质的比例为从1∶0.3至1∶2(重量∶重量)。
6.权利要求1-5中任一个所要求的疫苗，含有至少一种可提供抗除嗜血乙型流感病毒以外的病原体的保护作用的其他成分。
7.权利要求1-6中任一个所要求的疫苗，其中其他成分选自抗原组并可提供抗甲型肝炎病毒，白喉，破伤风，百日咳，乙型肝炎病毒和脊髓灰质炎的保护作用。
8.权利要求1-7中任一个所要求的疫苗，其中所吸附的缀合物被冻干。
9.权利要求1-7中任一个所要求的疫苗，其中所吸附的缀合物悬浮于水中以供注射。
10.一种试剂盒，含有一个根据权利要求8的冻干疫苗的容器和一个含抗第二种病原体的疫苗的第二个容器。
11.生产根据权利要求1-6的疫苗的方法，包括将多糖抗原与蛋白载体缀合并将所述抗原吸附于磷酸铝上。
12.权利要求1-9中任一个所限定的疫苗组合物用于医药。
13.治疗患有或易感嗜血乙型流感病毒感染的病人的方法，包括施用安全和有效量的根据权利要求1-9中任一个所述的疫苗组合物。
全文摘要
本发明涉及预防嗜血乙型流感病毒(Hib)感染的疫苗制剂,其中抗原被吸附到磷酸铝上,本发明也涉及多价疫苗,此疫苗可改善或治疗一种以上的疾病,本发明也涉及这种疫苗的生产和在医药中的应用。
文档编号A61K39/116GK1188418SQ96194973
公开日1998年7月22日 申请日期1996年6月19日 优先权日1995年6月23日
发明者朱利恩·皮特曼斯, 皮埃尔·豪泽 申请人:史密斯克莱·比奇曼生物公司