依托泊甙磷酸酯和依托泊甙的制备方法

专利名称：依托泊甙磷酸酯和依托泊甙的制备方法
技术领域：
本发明涉及制备抗癌化合物的新方法和制备这些抗癌化合物的新的中间体。本发明尤其涉及制备4’-去甲表鬼臼脂素甙4’-磷酸酯的方法和用于制备这些磷酸酯的中间体化合物。特别是本发明涉及到制备依托泊甙磷酸酯和由依托泊甙磷酸酯制备依托泊甙的方法。
依托泊甙和替尼泊甙是4’-去甲表鬼臼脂素甙衍生物，广泛用于临床治疗癌症。尤其在美国已被批准治疗小细胞肺癌和睾丸癌。然而依托泊甙水溶解度有限，使制成适宜的剂型有困难。
为了提高依托泊甙的水溶解度和提高用药的能力，制成了依托泊甙磷酸酯作为前药。依托泊甙磷酸酯在体内代谢成依托泊甙后才可被机体利用。一个水溶性前药的实例叙述于美国专利4,904,768，该专利公开了在4’-位带有磷酸酯基的4’-去甲表鬼臼脂素衍生物，为水溶性前药。其中公开的一个实例是依托泊甙4’-磷酸酯。依托泊甙4’-磷酸酯的制法是将依托泊甙与三氯氧化磷反应后，水解，或将依托泊甙与氯代磷酸二苯酯反应，再氢化除去苯基。
表鬼臼脂素甙的制备还公布于美国专利No.4,997,931中。4’-去甲表鬼臼脂素甙的制备方法是将4’-保护的4’-去甲表鬼臼脂素与保护的糖缩合。生成的化合物再经衍生化，生成相应的4’-磷酸酯。
以前制备依托泊甙和依托泊甙磷酸酯的方法有代表性的是需要将酚加以保护，再与经保护的糖结合，然后除掉保护基因。此外，这些方法多数需要对羟基和磷酸酯基进行保护。不同的保护基需要多个步骤以除去各个保护基因。除去保护基各步常常需要酸性或碱性条件，这会使终产物降解，使收率降低。
依托泊甙磷酸酯通常由依托泊甙经磷酸化和除去保护基等附加步骤来制备。这些多步骤反应会导致所需化合物的总收率降低，并由于在依托泊甙上的甙羟基不希望有磷酸化反应，使成本增高并且难以制备这些化合物。
本发明涉及一种制备4’-去甲表鬼臼脂素甙4’-磷酸酯，特别是依托泊甙磷酸酯的方法，该方法是将新的被保护的糖与新的被保护的4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸酯偶联。更具体地说，本发明涉及二(芳甲基)保护的糖和四芳甲基保护的4’-去甲基-4-表鬼臼脂素甙4’-磷酸酯和由此制备依托泊甙磷酸酯的方法。在羟基和磷酸酯基上的芳甲基保护基可以是相同的，也可以是不同的，优选为苄基或被如下一个或多个基团取代的苄基C1-4烷基、羟基、苯基、苄基、卤素、烷氧基、硝基、羧酸及其酯。4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二(芳甲基)酯的制法是在适当溶剂中将酚与亚磷酸二(芳甲基)酯、四卤甲烷、三乙胺和酰化催化剂反应。
按照本发明的一个实例，被保护的糖是2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖，后者在溶剂中与4’-去甲基-4-表鬼臼脂素磷酸二苄酯偶联，生成四苄基保护的依托泊甙磷酸酯。被保护的依托泊甙4’-磷酸酯经结晶或重结晶回收C-1”-β-端基异构体。甙基及磷酸酯基上的保护基经氢化或其它适宜方法可同时被除去，生成依托泊甙磷酸酯。
整个过程可有效率地生成纯净的依托泊甙4’-磷酸酯，而无需另行纯化。被保护的二苄基-4-(2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-β-D-吡喃葡糖基)-4’-二甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸酯容易自反应介质中结晶出来，或重结晶出来，以基本纯净的形式分离出C-1”-β体。所需的端基异构体的分离通常只经过一步结晶就可得到。
具体地说，本发明涉及一种制备式V化合物的方法，
该方法包括将式IIIb化合物与式II化合物在路易斯酸存在下于反应介质中反应，
式中R1是芳甲基羟基保护基，R2是芳甲基或两个R2基共同是C1-5亚烷基，R3是芳甲基，R1、R2和R3是相同的或不同的，反应生成式IVb化合物，
选择性地结晶出式IVb化合物的C-1”-β端基异构体，然后除去羟基和磷酸酯基保护基，若R2是芳甲基羟基保护基，则使化合物IVb与具有1-5个碳原子的羰基或其缩醛等同物反应。
本发明的另一方面是一种制备式VI化合物的方法，
该方法包括将式V化合物于缓冲溶液中与磷酸酶反应以除去磷酸酯，得到式VI的该化合物。
本发明的另一方面是提供一种制备式VI化合物的方法，
该方法包括用磷酰化剂对式I化合物进行磷酰化，
生成式II的被保护的4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸酯。
式中R3为芳甲基，使该式II化合物与式III的被保护的糖反应，
生成式IV化合物
式中R1是芳甲基保护基；分离出式IV的C-1”-β体；除去羟基和磷酸酯基保护基，生成式V化合物，
然后用磷酸酶处理该式V化合物以除去磷酸酯基，生成式VI化合物。
本发明涉及一种制备4’-去甲表鬼臼脂素甙4’-磷酸酯的改进方法，尤其是制备依托泊甙4’-磷酸酯，其药用盐及溶剂化物。本发明还涉及芳甲基保护的糖和芳甲基保护的依托泊甙和依托泊甙4’-磷酸酯的前体的制备。本发明还涉及一种用羟基和磷酸酯基保护基制备依托泊甙磷酸酯的方法，这使得容易用结晶方法分离出端基异构体。另一个有利的特征是羟基和磷酸酯基保护基可容易地同时被除去，而不会降解终产物。
本发明方法产生保护的依托泊甙4’-磷酸芳甲基(尤其是苄基)酯，它容易用结晶方法自反应介质中分离出或用适宜的溶剂重结晶出纯的端基异构体C-1”-β体。整个过程快速而有效，提供了制备依托泊甙4’-磷酸酯的有效方法。磷酸酯基很容易用磷酸酶除去，这是一种有效地制备依托泊甙、其药用盐及溶剂化物的方法。
如同以下详细讨论的那样，整个方法可有效地制备依托泊甙磷酸酯或依托泊甙。在优选的实例中，4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄基酯在路易斯酸存在下与2，3-二苄基-4，6-O-亚乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖偶联，生成4-(2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-α，β-D-吡喃葡糖基)-4-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄基酯的端基异构体混合物。令人意外地发现，C-1”-β端基异构体很容易以基本上纯净的形式从溶液中结晶出来，C-1”-β端基异构体可直接由反应介质中结晶或用适宜溶剂重结晶。然后回收C-1”-β端基异构体，经氢化同时除去羟基和磷酸酯基保护基。
此处所用的术语药用盐包括一或二碱金属盐和碱土金属盐。在优选的实例中，终化合物是乙醇的溶剂化物。溶剂化物是用标准方法在有机溶剂如乙醇中结晶或重结晶生成的。术语亚烷基包括直链或支链烷基链，例如包括亚乙基、亚丙基和亚异丙基。
本发明的一个方面是将式I的4’-去甲表鬼臼脂素磷酰化，生成式II的被保护的4’-去甲表鬼臼脂素-4’-磷酸二(芳甲基)酯。该磷酰化过程的优选方法是将4’-去甲表鬼臼脂素与亚磷酸二(芳甲基酯)、四卤甲烷、叔胺和酰化催化剂反应。四卤甲烷的分子式为CX4，X为卤素，选自F、Cl、Br和I。在优选的实例中，四卤甲烷是CCl4。碳上的卤素可相同或不同。优选实例用的叔胺是N，N-二异丙基乙胺(DIPA)，其它适宜的叔胺也可以使用。酰化催化剂可以是本技术领域已知的标准催化剂。在优选的实例中，酰化催化剂是N，N-二甲基氨基吡啶(DMPA)。该反应可总结如下
式中R3是芳甲基。优选实例中R3为苄基，得到的磷酸酯具有化合物IIa的结构
另外，R3是被如下一个或多个基团取代的苄基C1-4烷基、羟基、苯基、苄基、卤素、烷氧基、硝基和羧酸及其酯。适宜的取代的苄基包括，例如2-甲基苄基、3-甲基苄基、4-甲基苄基、1或2-萘基、2、3或4-苯基苄基，4-甲氧羰苄基，2，6-二氯苄基、2-氯苄基和五氟苄基。
该磷酰化过程是一种方便而容易的方法，生成被保护的4’-去甲表鬼臼脂素-4’-磷酸二(芳甲基)酯，收率很高。该方法基本上是一罐法，迅速而高选择性地对化合物I的酚羟基反应。虽然这种方法对于4’-去甲表鬼臼脂素的磷酰化特别有利，但对酚类是有普遍性和高选择性的，例如酚类包括对氟苯酚、2，6-二甲氧基苯酚，邻苯二酚和4-羟基苯乙醇。用4-羟基苯乙醇进行反应时只产生很少量的伯醇基的磷酰化。依托泊甙的磷酰化生成所希望的化合物，甙基上的磷酰化比预先形成的氯代磷酸二苄酯要少。
优选的溶剂是乙腈，但在磷酰化时也可用卤代的或非卤代的溶剂。四卤甲烷，尤其是四氯化碳优选只以试剂用量使用，而不像在一些常规方法中用作溶剂。四卤甲烷在磷酰化反应中的用量是每当量起始酚一个或多个当量。该反应也可在温和条件下于室温或低于室温下进行，有代表性的是低于大约-10℃。该磷酰化反应基本上在不加氯代磷酸二苄酯(DBPCl)条件下进行，因为DBPCl可就地生成。这就避免了制备DBPCl的额外步骤，并降低了生成的磷酰化产物的杂质含量。有代表性的是，反应在大约45分钟进行完全。化合物II用标准方法如于异丙醇中重结晶得到。
然后化合物II在路易斯酸存在下与羟基被保护的吡喃葡萄糖偶联。在优选的实例中，路易斯酸是三氟化硼醚合物。其它的路易斯酸例如包括AlCl3、ZnCl2、Et2AlCl、CF3SO3H、CF3SO3Ag、Zn(CF3SO3)2和TMSCF3SO3。该偶联反应可以在分子筛存在下进行。该偶联反应在卤代或未卤代溶剂，最优选的是乙腈中进行。其它溶剂例如包括丙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷和它们的混合物。
优选的羟基被保护的吡喃葡萄糖具有式III的结构
式中R1为芳甲基。优选的实例中R1为苄基，这样吡喃葡萄糖具有式IIIa的结构
在另一实例中R1是取代的苄基，可被如下的一个或多个基团取代C1-4烷基、羟基、苯基、苄基、卤素如氟、氯、溴和碘，烷氧基、硝基和羧酸及其酯。适宜的取代的苄基包括2-甲基苄基、3-甲基苄基、4-甲基苄基、1或2-萘基、2，3或4-苯基苄基，4-甲氧羰苄基、2，6-二氯苄基、2-氟苄基和五氟苄基。有代表性的是R1与R3相同。
吡喃葡萄糖还可具有式IIIb的结构，
式中R1含义与前述相同，R2与R1相同，或两个R2基共同构成C1-5亚烷基。优选的是，两个R2基共同为亚乙基。在另一些实例中两个R2基可共同为亚丙基或亚异丙基。
化合物III、IIIa和IIIb的制备按已知的方法，如在美国专利No.4,997,931中所述的方法进行。形成的芳基被保护的吡喃葡萄糖为C-1-α，β的端基异构体混合物。与大多数端基异构体混合物不同，芳甲基吡喃葡萄糖的C-1-β端基异构体可用结晶法与α-端基异构体分开。具体地说，式IIIa的吡喃葡萄糖化合物的端基异构体混合物可用己烷结晶，生成化合物IIIa的基本上是端基异构体纯的C-1-β体。而且，吡喃葡萄糖化合物IIIa的初始组成为β∶α＝1∶1，过一段时间固化后β∶α＝85∶15。
被保护的化合物IH的吡喃葡萄糖与化合物II的被保护的4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸酯的偶联反应最好是在路易斯酸存在下于乙腈中进行。
化合物IIIa的羟基被保护的吡喃葡萄糖与4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(IIa)偶联生成具有式IVa的4-(2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯的C-1”-α，β端基异构体混合物。
在三氟化硼醚合物的存在下偶联反应迅速而容易地进行，生成化合物IVa的α和β端基异构体。
在偶联反应之前，不必分离出化合物III，特别是IIIa的β体。当反应是在卤代烃溶剂中进行时，IVa的α和β体的最后比例并不取决于原料化合物IIIa的端基异构体的组成。于-20℃和在三氟化硼醚合物的存在下，在乙腈中化合物IIa和IIIa(β∶α＝85∶15)偶联生成的化合物IVaβ和IVaα的比例为72∶28。据信在卤代烃溶剂中糖的端基异构化发生得非常快，而在乙腈中端基异构化要慢得多。
在另一实例中，反应混合物中可加入适宜的盐，以增强溶剂的离子强度。适宜的盐包括高氯酸碱金属盐和碱土金属盐。例如用溶解于乙腈中的0.5M LiClO4使IVa的β∶α增加到81∶19。
生成的IVa α，β化合物的端基异构体混合物可用甲醇重结晶，得到高收率的基本上是纯净的C-1”-β体。只单纯在甲醇中结晶或甲醇与其它溶剂合用使极性略低的IVa β端基异构体几乎完全结晶出来，基本上没有IVa α端基异构体的杂染。
偶联反应一般在室温或低于室温下，优选于大约-10℃～-40℃进行。尽管偶联反应在低温下反应较慢，但较低的温度有利于通过减慢IIIa的反应混合物中的端基异构化而生成IVa C-1”-β端基异构体。例如，4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄基酯和2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖(85∶15β∶α)在乙腈中于-20℃偶联生成IVaβ和IVaα，其比例是72∶28，而在-40℃时，其比例为74∶26。在丙腈中于-20℃进行同样的偶联反应，IVaβ与IVaα的比例为57∶43，而在-78℃时，其比例是76∶24。
用于偶联反应的优选溶剂是乙腈，因为它与偶联反应的标准溶剂相比，反应更快。乙腈的未预料到的性质是能使偶联反应在大约2小时内达到完全，而在二氯乙烷中反应历时大约18小时。在乙腈中的偶联反应比在丙腈中迅速。而且在乙腈中的偶联反应也会使生成的IVaβ端基异构体更多。在4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯与2，3-O-苄基-4，6-O-亚乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖的偶联反应中研究了数种溶剂。有代表性的是，用较高介电常数的溶剂增加了β∶α比例。
吡喃葡萄糖的取代苄基保护基上的取代基也影响生成的IVaβ与IVaα的比例。例如，在邻位上的大基团有利于化合物IV的C-1”-β体，这是由于在化合物IVa中产生了位阻，而在间位和对位的取代基造成的位阻较小。吸电子基团也有利于C-1”-β体。用五氟苄基得到最高的β∶α比例，生成的IVa C-1”-β与IVa C-1”-α的比例是80∶20。
在标准操作后进行单一的结晶步骤，可以分开IVaα，β的端基异构体混合物，得到基本上纯净的C-1”-β体。将IVaα，β的端基异构体混合物溶解于甲醇中，将溶液加热回流使化合物IVaα，β完全溶解。使溶液冷却到室温，得到的沉淀物为基本纯净的化合物IVa的C-1”-β体。
优选的实例是结晶化得到的化合物IVa C-1”-β体直接进行偶联反应。偶联反应完成后，不必进一步萃取或常规操作，将甲醇加到溶液中，并使溶液温热至0℃。然后将溶液于0℃放置数小时，得到的固体证明基本是纯净的IVa C-1”-β。
甚至从50∶50端基异构体混合物中能直接结晶出化合物IVa的C-1”-β体，这是本方法显著的和出人意料的优点。如同J.March在高等有机化学第4版John Wiley & Sons，纽约，1992，p.121所报导的那样，很少的差向异构体能够只经单一的结晶法得以分离开。
得到化合物IV的C-1”-β端基异构体后，用已知方法(最好是氢化法)同时除掉羟基和磷酸酯基保护基。氢化除去保护基步骤可有效地进行，以高收率和最低降解作用生成依托泊甙磷酸酯。化合物IV，IVa和IVb极不稳定且对酸和碱都很敏感。用酸或碱除去羟基和磷酸酯基保护基的已有方法通常会使一部分所需化合物分解。此外，去保护步骤可以将吡喃葡萄糖上的亚乙基除去。与已有的除去保护基的方法相比，氢化法的优点是只需要一个去保护步骤，不需用重金属，而且反应在温和和中性条件下进行，产物收率高。不需用层析法就可得到纯净形式的依托泊甙磷酸酯，而其它方法需用。
氢化可用许多已知方法进行。有代表性的是氢化反应于贵金属催化剂存在下于适宜的溶剂或溶剂混合物中进行。
优选的实例是氢化用4％钯/碳在化合物IVa C-1”-β体于50/50甲醇/四氢呋喃(THF)的溶液中进行。将混合物氢化数小时，有代表性的是3-6小时，氢压力为40-50磅/英寸2的氢气。然后可滤除催化剂，用乙醇重结晶依托泊甙磷酸酯。IV C-1”-β的去保护作用生成式V的依托泊甙磷酸酯如下所示
式V的4’-去甲表鬼臼脂素甙-4’-磷酸酯可与适宜的阳离子源接触转变成其药用盐。例如，将该磷酸酯用适宜的钠碱处理，使其钠盐生成可制成钠盐。式V的4’-去甲表鬼臼脂素甙-4’-磷酸酯的溶剂化物也可用已知方法得到。
依托泊甙磷酸酯可在缓冲水溶液中用磷酸酶除去磷酸酯基而转变成依托泊甙。磷酸酶能够将依托泊甙磷酸酯完全转变成依托泊甙。该反应在装有缓冲液的反应罐中于pH大约5-12(优选pH 6-9)、室温下进行。有代表性的是依托泊甙磷酸酯在与缓冲水溶液混合时，以溶剂化物的形式存在。
将依托泊甙4’-磷酸酯酶促转变成依托泊甙是有利的，因为这种转变条件温和，不会使依托泊甙或依托泊甙4’-磷酸酯降解。例如活泼的亚乙基基本上不受磷酸酶的影响。所用的酶可以是在pH 5-12(优选为6-9)下具有磷酸酶活性的任何酶。适宜的磷酸酶包括酸性和碱性磷酸酶。该磷酸酶可由牛、细菌或其它来源如牛和小牛的小肠粘膜中得到。另外，磷酸酶可以是麦芽脂酶，已知它具有磷酸酶活性。这些酶在Sigma化学公司有售。
适宜的缓冲液例如包括M-Tris(pH7.8)，M-Tris(pH8.7)，M-硼酸盐(pH10.0)和M-碳酸氢盐(pH10.3)。依托泊甙磷酸酯V的去磷酸基生成依托泊甙VI如下所示
下面的非限制性实施例对本发明的优选实施方案加以说明。实施例12，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖(IIIa α，β)本化合物是按照文献类似化合物的制法制备的，如在美国专利No.4,997,931中所述。1H NMR表明端基异构体组成是57∶43β∶α。Rf(40％ EtOAc/己烷)0.40.1H NMR(CDCl3)δ7.39-7.27(m，10H)，5.14(d，0.5H，J＝3.7Hz)，4.91-4.66(m，5.5H)，4.14(dd，0.5H，J＝5.0，10.5Hz)，4.09(dd，0.5H，J＝5.0，10.3Hz)，3.94-3.88(m，1H)，3.66(t，0.5H，J＝9.0Hz)，3.56-3.25(m，3.5H)，3.10(bs，1H，依赖于浓度的OH)，1.36(d，3H，J＝5.0Hz).13C NMR(CDCl3)δ128.53，128.42，128.31，128.09，127.95，127.83，127.63，99.50，97.72，92.12，82.94，81.44，81.08，80.89，79.31，78.33，75.23，75.12，74.96，73.81，68.53，68.22，66.22，62.48，20.43.实施例22，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-β-D-吡喃葡萄糖(IIIaβ)将IIIa α，β的端基异构体混合物(7g)量于250ml圆底烧瓶内，加入己烷(125ml)，将混悬物加热回流。糖变成不溶性油状物，沉于瓶底。将混悬液冷却至室温，然后放入搅拌棒，轻轻搅拌此溶液过夜。生成的白色蓬松状结晶漂浮于己烷中，不纯的固体留于下面。倾析出结晶，滤集于布氏漏斗上。不纯的固体留于瓶内。室温真空(20mmHg)干燥白色的IIIaβ固体。1H NMR(CDCl3)δ7.37-7.27(m，10H)，4.90-4.69(m，6H)，4.14(dd，1H，J＝4.9，10.4Hz)，3.66(t，1H，J＝9.0Hz)，3.54(t，1H，J＝10.2Hz)，3.45(t，1H，J＝9.3Hz)，3.37-3.27(m，2H)，3.23(d，1H，J＝5.5Hz，依赖于浓度的OH)，1.36(d，3H，J＝5.1Hz).13C NMR(CDCl3)5128.42，128.29，128.11，127.93，127.82，127.63，99.45，97.71，82.93，81.06，80.88，75.22，74.96，68.21，66.21，20.39.实施例34’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(IIa)
烘箱中烘干的1升三颈圆底烧瓶内装有滴液漏斗、搅拌棒、温度计、两个隔膜和N2进气口，瓶内装入4’-去甲表鬼臼脂素(I，25.00g，62.45mmol)和无水乙腈(367ml，0.17M)。将悬浮液冷却到-10℃。加入四氯化碳(30.1ml，312.25mmol)，保持温度-10℃。于3分钟内用注射器注入N，N-二异丙基乙胺(22.84ml，131.15mmol)，一次全部加入N，N-二甲氨基吡啶(0.763g，6.25mmol)，再于15分钟内滴加亚磷酸二苄酯(20.00ml，90.55mmol)。在加入过程中反应略有放热现象，但内部温度经外部冷却保持在-10℃。再于-10℃搅拌37分钟。在此期间原料溶解，用HPLC监视反应。加入0.5M KH2PO4(150ml)，使反应溶液温热至室温。混合物用EtOAc(1×350ml)萃取，再用水洗(2×100ml)。有机层经硫酸钠干燥，真空浓缩到150ml体积。加入2-丙醇(500ml)。真空蒸除溶剂(200ml)，在此期间固体析出。加入2-丙醇(500ml)，再真空蒸发除去溶剂550ml。最后再加入2-丙醇(250ml)，将混合物加热回流直到所有固体溶解。将黄色溶液冷却至室温，再于0℃保持4小时。滤集白色固体，用冷2-丙醇洗涤2次，真空干燥(40℃，20mmHg)，得到37.15g(90.1％)。HPLC RtRf(10％MeOH/CH2Cl2)0.66.1H NMR(CDCl3)δ7.37-7.28(m，10H)，6.81(s，1H)，6.39(s，1H)，6.30(s，2H)，5.90(dd，2H，J＝1.0，12.7(Hz)，5.28-5.14(m，4H)，4.71(d，1H，J＝3.4Hz)，4.53(d，1H，J＝5.1Hz)，4.25(dd，1H，J＝8.7，10.7Hz)，3.63(s，6H)，3.27(dd，1H，J＝5.2，14.1Hz)，2.71-2.61(m，1H).13C NMR(CDCl3)δ175.27，151.15，151.11，148.22，147.32，137.28，136.04，135.94，132.19，131.35，128.43，128.30，128.26，127.69，127.64，110.13，109.32，107.66，101.45，69.62，69.53，69.46，67.75，66.17，56.06，43.81，40.39，38.47.实施例44-(2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-β-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(IVaβ)(于乙腈中偶联)向装有搅拌棒，温度计、隔膜和N2进气口的烘箱中烘干的25ml二颈圆底烧瓶中加入4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(IIa，1.00g，1.51mmol)，4干分子筛(1/16”小粒)(2.0g)，2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-α，β-D-葡萄糖(IIIa，α，β，85∶15，0.702g 1.817mmol)，和无水乙腈(10.0ml)。搅拌直至溶液呈均相，然后将溶液冷却至-20℃。于2分钟内滴加三氟化硼醚合物(0.50ml，4.08mmol)。保持反应温度-20℃80分钟。在加入BF345分钟后白色固体开始析出。加入吡啶(5.23ml，64.7mmol)。使悬浮液温热到室温，用CH2Cl2(10ml)稀释。白色固体溶解。过滤溶液以除去剩余的固体。溶液用3％HCl(7ml)洗涤，水相再用CH2Cl2(10ml)反萃取。合并有机相，用水(7ml)洗涤，水相用CH2Cl2(10ml)反萃取。最后合并有机相，用饱和NaCl(7ml)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，真空浓缩成黄/白色固体。该粗产物经HPLC表明IVaβ∶IVaα为71.6∶28.4。固体物搅拌下溶解于CH2Cl2(10ml)中。加入甲醇(90ml)。不久一些固体析出。溶液搅拌下温热至回流，此时固体溶解，然后蒸除溶剂20ml。收集19ml后固体开始结晶。使混合物冷却至室温，轻轻搅拌5小时。滤集白色固体，用室温甲醇冲洗两次。IVaβ固体真空下干燥(40℃，20mmHg)，得到0.830g(53.3％)。Rf(50％EtOAc己烷)0.36.1H NMR(CDCl3)δ7.38-7.18(m，18H)，7.00-6.98(m，2H)，6.82(s，1H)，6.54(s，1H)，6.25(s，2H)，5.97-5.89(dd，2H，J＝1.0，26.7Hz)，5.29-5.18(m，4H)，4.89-4.85(m，2H)，4.77-4.71(m，3H)，4.60-4.49(m，3H)，4.39(t，1H，J＝10.2Hz)，4.23(t，1H，J＝8.2Hz)，4.16(dd，1H，J＝4.9，10.4Hz)，3.63(s，6H)，3.55(t，1H，J＝10.2Hz)，3.45-3.34(m，2H)，3.32-3.21(m，2H)，2.89-2.80(m，1H)，1.38(d，3H，J＝5.0Hz).13C NMR(CDCl3)δ174.74，151.20，148.72，147.17，138.48，137.75，137.0，136.3，136.2，132.02，128.62，128.42，128.30，128.21，128.07，127.87，127.70，127.67，110.72，109.18，107.73，102.32，101.60，99.55，81.66，80.95，75.40，75.06，73.45，69.45，68.19，67.87，65.97，43.87，41.22，37.48，20.40.
IVa C-1”-α异构体与一些所希望要的产物IVβ(IVβ∶IVα 13.7∶86.3)一起留在母液中。实施例54-(2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-β-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(IVaβ)(于二氯乙烷中偶联)向装有搅拌棒、温度计、两个隔膜和N2进气口的烘箱中烘干的250ml干燥的三颈烧瓶内加入4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(IIa，14.295g，21.57mmol)，干燥的4A分子筛(1/16”小粒)(28.6g)、2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-α，β-D-葡萄糖(IIIa α，β，10.0g，25.88mmol)和无水1，2-二氯乙烷(143ml)。搅拌此溶液直到均相，然后冷却到-20℃。于10分钟内滴加三氟化硼醚合物(7.15ml，58.24mmol)。反应于-20℃保持18小时。加入吡啶(5.23ml，64.7mmol)，混合物由褐色变成黄色。使混浊的溶液温热到室温，用CH2Cl2(200ml)稀释，过滤除去固体。溶液用3％HCl(100ml)、水(100ml)、最后用饱和NaCl(100ml)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，真空浓缩成黄色油状物。搅拌下加入回流甲醇(1500ml)。使混合物冷却到室温并放置过夜。滤集白色固体，用甲醇冲洗两次。IVaβ的固体于真空中干燥(40℃，20mmHg)，得到8.86g(39.8％)。
C-1”-α异构体IVaα与一些所希望要的产物IVaβ一起留在母液中。该剩余的偶联产物经进一步结晶和(或)层析回收。在对IVβ重结晶之前粗产物的β∶α的比例是54∶46。偶联产物的总收率为81％。
4-(2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-α-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(IVaα)Rf(50％EtOAC/己烷)0.31。1H NMR(CDCl3)δ7.38-7.21(m，20H)，6.87(s，1H)，6.26(s，2H)，5.95(d，2H，J＝5.8Hz)，5.29-5.18(m，4H)，4.87(dd，3H，J＝2.3，11.1Hz)，4.79-4.74(m，2H)，4.68-4.58(m，4H)，4.11(t，1H，J＝7.9Hz)，3.95(q，1H，J＝10.6Hz)，3.86(t，1H，J＝9.2Hz)，3.63(s，6H)，3.51(dd，1H，J＝3.6，9.4Hz)，3.45(d，1H，J＝7.2Hz)，3.45-3.35(m，3H)，2.82-2.75(m，1H)，1.32(d，3H，J＝5.0Hz).13C NMR(CDCl3)δ174.91，151.22，151.18，148.44，147.02，138.56，137.83，137.05，136.27，136.18，132.19，129.27，128.59，128.45，128.34，128.24，128.12，127.96，127.89，127.72，127.69，110.44，109.81，107.85，101.61，101.08，99.59，82.07，79.36，78.59，76.76，75.09，74.69，69.52，69.46，69.41，68.18，67.04，62.95，56.15，43.82，41.10，38.41，20.40.实施例6
本实施例说明的是偶联和结晶化步骤在同一反应容器中进行。将具有搅拌棒的50ml三颈圆底烧瓶在烘箱中烘干，装上两个隔膜，在N2下冷却。加入4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(1.002g，1.51mmol)和2，3-O-苄基-4，6-O-亚乙基吡喃葡萄糖(IIa，85∶15，β∶α，0.702g，1.81mmol)。将这些固体溶解于无水乙腈(10.0ml)中，然后将溶液冷却到-40℃。滴加入三氟化硼醚合物(0.50ml，4.1mmol)。于-40℃搅拌该溶液，用HPLC监视反应。在反应过程中，一些产物析出。6小时后，滴加入甲醇(30ml)。混悬液搅拌下温热到-30℃，然后于0℃放置(不搅拌)17小时。用布氏漏斗收集固体，用室温甲醇冲洗两次。生成0.9668g(62.0％)的IVaβ，HI为100％。实施例7依托泊甙-4’-磷酸酯(V)将50％湿重(314mg)的4％钯/碳加到4-(2，3-二-O-苄基-4，6-O-亚乙基-β-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二苄酯(IVaβ，758mg)于50/50 MeOH/THF(50ml)的溶液中。混合物于室温下、40-50磅/英寸2氢压下氢化3-6小时。滤除催化剂，用MeOH冲洗。真空浓缩滤液(40-60℃，吸气器)到8-10ml。加入无水乙醇(50ml)，再将溶液浓缩到10ml。再加入乙醇(25ml)，将溶液浓缩到10ml。加入依托泊甙4’-磷酸酯二乙醇溶剂化物晶种。于30-60分钟内调节溶液的温度由大约50℃到15-20℃。在15-20℃再保持30分钟后，滤集析出的白色结晶，用5℃乙醇(5-10ml)洗涤。在高真空，25-40℃下干燥固体，得到436mg(77.8％)依托泊甙-4’-磷酸酯二乙醇溶剂化物(V)，经HPLC测定其纯度为99.2％(面积)。实施例8依托泊甙(VI)电磁搅拌下将依托泊甙-4’-磷酸酯二乙醇溶剂化物(V，410mg)溶解于1.0M Tris缓冲液(8.0ml)中。用1NNaOH调节pH由8.1到8.7。使溶液温热至35℃。加入碱性磷酸酶(Sigma，目录#p6774)于Milli Q水的溶液(2.0ml，200单位/ml)。在10分钟内固体析出。需要时加入1N NaOH使pH维持在8.4-8.8的范围。该反应用HPLC监视。3小时后，使混合物冷却到10℃保持15分钟。真空过滤收集固体，用水(5-7ml)洗涤，高真空(20℃)干燥18小时，得到241mg(76％的依托泊甙(VI)，HPLC测定为95.5％(面积))。
权利要求
1.式IV的化合物，
其中R1是苄基或取代的苄基羟基保护基，R3是苄基或取代的苄基磷酸酯基保护基。
2.权利要求1的化合物，其中R1和R3是被1个或多个如下基团取代的苄基C1-4烷基、羟基、苯基、苄基、卤素、烷氧基、硝基、羧酸及其酯。
3.获得式IVa的C-1″-β端基异构体的方法，
所说的方法包括式IV化合物的端基异构体混合物在溶剂中形成溶液，
式中R1和R3是芳甲基，相同或不同，在所说的溶液中使所说的C-1″-β-端基异构体结晶，并且回收基本纯净的式IVa的C-1″-β端基异构体。
4.权利要求3的方法，其中所说的溶剂是乙腈。
5.权利要求3的方法，其中所说的溶剂是醇，所说的方法包括将所说的醇加热以溶解所说的端基异构体混合物，冷却所说的溶液使式IVa的C-1″-β端基异构体结晶。
6.权利要求3的方法，该方法包括将醇直接加到所说的溶液中，加入量应使式IVa的C-1″-β端基异构体结晶。
7.权利要求6的方法，其中所说的醇是甲醇。
全文摘要
制备依托泊甙磷酸酯的方法是在溶剂中将4’－去甲基－4－表鬼臼脂素－4’－磷酸二苄酯与2,3－二－O－苄基－4,6－O－亚乙基－α,β－D－吡喃葡萄糖反应,然后除去保护基。四苄基被保护的依托泊甙磷酸酯从甲醇中重结晶或加入甲醇直接从乙腈中结晶,生成基本纯净的C－1”－β体,用氢化方法同时除去苄基保护基以高收率生成依托泊甙磷酸酯。在另一实施方案中,用磷酸酶处理依托泊甙磷酸酯生成依托泊甙。
文档编号A61K31/7048GK1189500SQ9712303
公开日1998年8月5日 申请日期1997年11月27日 优先权日1993年11月4日
发明者L·J·希尔沃伯格, P·夫埃米舍逖, J·L·迪隆, J·J·犹舍尔 申请人:布里斯托尔-米尔斯·斯奎布公司