专利名称：一种重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程中下游领域的蛋白质分离纯化，尤指重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法。
随着70年代基因工程技术的兴起，目前很多珍贵的药物蛋白及其它活性蛋白，如人生长激素，干扰素，白介素等都可利用基因工程大肠杆菌进行生产。
所谓基因工程大肠杆菌就是整合了外源基因的大肠杆菌，该外源基因编码目的蛋白，通过宿主大肠杆菌就可合成相应的目的蛋白。目前，大肠杆菌细胞中的外源蛋白有三种分泌形式，即胞外分泌，周质分泌，形成包涵体。其中最为常用的是包涵体形式，胞外分泌近年也逐步增多，而周质分泌型虽然也有诸多的优点但应用较少，其中的一个重要原因就是缺少有效的专用于细胞周质蛋白提取的工艺。胞外分泌型只需在细胞培养结束后，离心取上清液进行分离纯化。包涵体表达形式则要先对细胞进行破壁处理，然后利用包涵体与细胞碎片及胞内物质的密度差进行包涵体分离，收获包涵体作进一步纯化。而周质分泌型则需要定向释放技术，该技术的关键在于仅作用于细胞外膜而不损害细胞内膜和细胞壁。如果细胞壁和内膜损害程度太大，则胞内干扰物质大量释放到提取液中，将给目的蛋白的下一步纯化带来困难。
目前细胞周质的专用提取方法很少见，特别是适合于工业化生产的工艺还未见报道。目前已报道的周质制备方法有溶菌酶法[MolecularCloning-A Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989]，蔗糖渗透压法[Comelis.P.,Mol.Gen.Genet.,1982,186:507～511]、低浓度胍处理法[T.J.Naglak and H.Y.Wang,EnzymeMicrob.Technol.,1990,12(8):603]，这些方法都不过是细胞全破碎方法的温和化而已，都未能解决细胞壁和内膜的受损害问题。因此，或多或少会使胞内物质，特别是对目的蛋白质的分离纯化有严重干扰的核酸大分子释放到提取液中。而杂蛋白及核酸的夹带不仅影响目的蛋白的纯化回收率，而且还会影响产品的质量。特别是这些方法在试验室小试规模可能还有一定效果，但却难以在工业规模中推广。
为此，本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法，即盐处理法制备细胞周质液。该方法有效地防止了前述已有方法在制备细胞周质液时对细胞壁和内膜的损害，从而减少了细胞内干扰物质对蛋白分离纯化的影响。它不仅适合于实验室的小量制备，而且特别适合于工业化规模的生产。
本发明是一种重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法，通过盐的阳离子作用于重组大肠杆菌细胞以增加细胞外膜的通透性，从而达到专一抽提细胞周质中蛋白之目的。具体工艺步骤如下所述。
在重组大肠杆菌发酵结束之后，冷却发酵液温度(0～37℃均可，以0～15℃为佳)使细胞代谢降低，同时在发酵液中直接加入盐处理细胞。可用的盐类主要包括一价阳离子盐如钠盐如氯化钠、硫酸钠、硝酸钠等所有的可溶性钠盐，钾盐如氯化钾、硫酸钾、硝酸钾等所有可溶性钾盐，铵盐如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等所有可溶性铵盐，以及其它所有含一价阳离子的可溶性盐。如实施例1、2、3、4配合图2显示钠盐、钾盐、铵盐如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸铵效果相同。从成本上考虑，采用氯化钠最佳。
盐的加量和处理时间视不同的发酵工艺、品种、菌株而异，以盐中的阳离子摩尔浓度计，从78m mol～8000m mol为有效浓度范围。以氯化钠为例，如图3所示钠离子浓度在78m mol～3440m mol范围内都有效果。针对不同的大肠杆菌及所涉及的各种蛋白，可能有不同的最佳浓度。加盐处理时间一般需10分钟以上，但不超过4小时，时间太长则有细胞自溶的可能。
本操作步骤也可如下进行发酵结束后先离心发酵液收获菌体，然后将菌体温和分散于大于菌体体积的盐溶液中进行处理，工艺条件如离子浓度、温度、时间如同上述)加盐处理完毕后，离心收集菌体，加入冷的提取液，温和分散菌体，低温抽提周质蛋白。
提取液一般使用蒸馏水即可，也可使用缓冲液如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等作提取液，作为提取液的缓冲液和蒸馏水中也可加入某种蛋白保护剂如PMSF(蛋白酶抑制剂)、白蛋白、多糖等、也可加入盐促进蛋白质溶解(如氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，浓度从50～150m mol)，也可加入离子螯合剂EDTA。如实施例7使用10mmolTris(PH=7.5)作提取液也取得相同的效果。
提取液温度以0～15℃较好，提取液加量应大于菌体湿重，最佳比例为5～10∶1(重量比)，此比例太小，可能提取不充分，此比例太大，提取液中目的蛋白浓度太稀。抽提时温度也以0～15℃为佳，抽提时间视发酵工艺、品种、菌株的不同而异。一般需10分钟以上，但不超过4小时，时间太长可能引起菌体自溶。
低温抽提完毕后，离心收集上清液，即得周质提取液。该周质提取液再经进一步分离纯化即可得到目的蛋白。
本发明方法以制备基因工程大肠杆菌BL21(Omp)周质液为例，详述于后。该工程菌分泌人生长激素于细胞周质中。另外，以目前已有的周质提取较好的方法即溶菌酶法作提取效果对照(具体操作见对照例1，在以上提到的已有方法中，溶菌酶法的目的蛋白提取率高，杂质少)。
检测方法使用放免法测量人生长激素含量[使用卫生部上海生物制品研究所人生长激素试剂盒]、福林-酚法测量提取液总蛋白含量[参见生物化学实验南京大学生物系人民出版社1979]、定磷法测核酸含量[参见生物化学实验南京大学生物系人民出版社1979]，同时，提取液作还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以及对提取液作进一步纯化精制获得人生长激素(常规方法如等电点沉淀、再经硫酸铵沉淀、最后用离子交换树脂分离)。
两种方法的结果对照见表1，周质提取液电泳图见图1。图中显示，本发明方法的周质液杂蛋白明显少于溶菌酶法，因而有利于目的蛋白的回收和产品的质量的提高。目前因无其它满意的细胞周质中目的蛋白含量测定方法，所以无法计算本发明方法的目的蛋白提取率。
表1．本发明方法与溶菌酶法的周质提取液的比较
表1结果显示，本发明方法的周质提取液中人生长激素占总蛋白含量的62％，核酸未检出。溶菌酶法周质液中，虽然人生长激素含量相仿，但杂蛋白含量、核酸含量均大于本发明方法。两种方法的周质液经常规方法进行纯化精制，本发明方法的最终产量为50mg/L(发酵液)，而溶菌酶法的最终产量为25mg/L(发酵液)，高出一倍。
因此，本发明作为大肠杆菌周质液的制备方法，具有以下优点1．顺利解决了从周质分泌型重组大肠杆菌中制备含目的蛋白的周质液这一技术关键，避免了已有方法对细胞壁和内膜的损害而引起胞内干扰物质的过多释放。因此，与已有方法相比本发明方法提取液的蛋白纯度、目的蛋白纯化回收率及最终产品的质量都大为提高。2．工艺简单，操作方便。在发酵结束后可直接加盐对发酵液进行处理，这与已有方法比较是一个显著的改进。3．本发明方法所用原料是价廉的盐，其生产成本大大低于其它方法的成本。如溶菌酶法，它需要昂贵的溶菌酶、Tris、EDTA，以及20％的蔗糖。4．它不仅适合于实验室的小量制备，而且特别适合于工业化规模的生产。因此本发明方法的提出将促进周质分泌型工程菌的应用，特别是为该类型基因工程菌的工业化应用开辟道路。
图1是本发明方法与溶菌酶法制备的周质分泌型重组人生长激素大肠杆菌BL21(omp)菌体周质液电泳图。1．溶菌酶法，2．本发明方法，3．标准人生长激素。
图2是采用各种一价阳离子盐处理重组人生长激素大肠杆菌BL21(omp)菌体而制得的周质液电泳图。1．氯化钠，2．硫酸钠，3．氯化钾，4．硫酸铵。
图3是采用不同的钠离子浓度处理重组人生长激素大肠杆菌BL21(omp)菌体而制得的周质液电泳图。发酵液中钠离子浓度从左到右分别为1-78m mol,2-150m mol,3-230m mol,4-430m mol,5-860m mol,6-1720m mol,7-2580m mol,8-3440m mol。
本发明通过以下的实施例作进一步阐述，但并不限止本发明的范围。
实施例1采用氯化钠处理细胞制备周质液使用基因工程大肠杆菌BL21(Omp)，该分泌型工程菌分泌人生长激素于细胞周质中。发酵规模为8L，取1L发酵液进行周质液制备。各实施例中的检测方法均如上所述。
工程菌发酵完毕后，开始降温，同时直接加入氯化钠，最终钠离子浓度为430m mol，降温到4℃后保持30分钟。然后冷冻离心，取菌体，以1∶7.5的比例(菌体湿重蒸馏水重量)加入4℃蒸馏水，温和分散菌体，4℃保温30分钟。最后冷冻离心取上清液即周质液。
周质液体积250ml，周质液中生长激素含量为0.9mg/ml，总含量为225mg。周质液总蛋白含量为1.46mg/ml，核酸未检出。周质液电泳图见图2中的1。
周质液经等电点沉淀、硫酸铵沉淀，最后使用阴离子交换树脂作纯化，最终生长激素产量为50mg/L(发酵液)，纯度96％。
实施例2采用硫酸钠处理细胞制备周质液使用的菌体、发酵规模及取样量同实施例1。
工程菌发酵完毕后，开始降温，同时直接加入硫酸钠，钠离子最终浓度为1200m mol，降温到15℃后保持10分钟。然后冷冻离心，取菌体，以1∶10的比例(菌体湿重蒸馏水重量)加入15℃蒸馏水，温和分散菌体，15℃保温10分钟。最后冷冻离心取上清液即周质液。
周质液体积330ml，周质液中生长激素含量为0.59mg/ml，总含量为195mg。周质液总蛋白含量为1.00mg/ml，核酸未检出。周质液电泳图见图2中的2。
周质液经等电点沉淀、硫酸铵沉淀，最后使用阴离子交换树脂作纯化，最终生长激素产量为41mg/L(发酵液)，纯度96％。
实施例3采用硫酸铵处理细胞制备周质液使用的菌体、发酵规模及取样量同实施例1。
工程菌发酵完毕后，开始降温，同时直接加入硫酸铵，最终铵离子浓度为8000m mol，降温到0℃后保持3小时。然后冷冻离心，取菌体，以1∶10的比例(菌体湿重蒸馏水重量)加入0℃蒸馏水，温和分散菌体，0℃保温3小时。最后冷冻离心取上清液即周质液。
周质液体积330ml，周质液中生长激素含量为0.74mg/ml，总含量为244mg。周质液总蛋白含量为1.29mg/ml，核酸未检出。周质液电泳图见图2中的4。
周质液经等电点沉淀、硫酸铵沉淀，最后使用阴离子交换树脂作纯化，最终生长激素产量为40mg/L(发酵液)，纯度96％。
实施例4采用氯化钾处理细胞制备周质液使用的菌体、发酵规模及取样量同实施例1。
工程菌发酵完毕后，开始降温，同时直接加入氯化钾，最终钾离子浓度为230m mol，降温到0℃后保持30分钟。然后冷冻离心，取菌体，以1∶5的比例(菌体湿重蒸馏水重量)加入0℃蒸馏水，温和分散菌体，0℃保温30分钟。最后冷冻离心取上清液即周质液。
周质液体积160ml，周质液中生长激素含量为1.4mg/ml，总含量为224mg。周质液总蛋白含量为2.20mg/ml，核酸未检出。周质液电泳图见图2中的3。
周质液经等电点沉淀、硫酸铵沉淀，最后使用阴离子交换树脂作纯化，最终生长激素产量为45mg/L(发酵液)，纯度96％。
实施例5重组人生长激素大肠杆菌周质蛋白液的大规模制备使用基因工程大肠杆菌BL21(Omp)，该分泌型工程菌分泌人生长激素于细胞周质中。生产规模为220L。
工程菌发酵完毕后，开始降温，同时直接加入氯化钠，最终钠离子浓度为430m mol，降温到4℃后保持15分钟。然后冷冻离心，取菌体，以1∶7.5的比例(菌体湿重∶蒸馏水重量)加入4℃蒸馏水，温和分散菌体，4℃保温30分钟。最后冷冻离心取上清液即周质液。周质液电泳图见图1中的2。
周质液体积35L，周质液中生长激素含量为0.9mg/ml，总含量为31.5g。周质液总蛋白含量为1.52mg/ml，核酸未检出。
周质液经等电点沉淀、硫酸铵沉淀，最后使用阴离子交换树脂作纯化，最终生长激素产量为40mg/L(发酵液)，纯度95％。
实施例6阳离子的有效浓度范围实验以氯化钠为例，发酵液取样量为1.5ml，制备周质液0.37ml，使用的菌株、发酵规模及操作步骤同实施例1，发酵液的钠离子浓度分别为78、150、230、430、860、1720、2580、3440m mol。提取液测量生长激素含量(测量方法同实施例1)，同时作还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
生长激素含量分别为0.18、0.26、0.40、0.97、0.94、0.96、0.97、0.96mg/ml周质液。电泳结果如图3所示从78～3440m mol的钠离子浓度范围均有效果。
实施例7以10mmolTris(PH=7.5)作提取液制备重组人生长激素大肠杆菌周质蛋白液除提取液外其余条件均与实施例5相同。
结果周质液体积35L，周质液中生长激素含量0.91mg/ml。最终生长激素产量42mg/L(发酵液)，纯度95％。
对照例1溶菌酶法制备重组人生长激素大肠杆菌周质蛋白液使用的菌种、发酵规模及取样量同实施例1。操作方法参见“MolecularCloning-A Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989”。
1L发酵液冷却到4C后，冷冻离心后取菌体，加入250ml溶菌酶溶液温和分散菌体，在4℃下保温30分钟。溶菌酶溶液组成1mg/ml溶菌酶，1mmolEDTA(PH=8.0),20mmolTris(PH=8.0)。然后冷冻离心取上清液即细胞周质液。
周质液总蛋白含量为1.96mg/ml，生长激素含量为0.89mg/ml周质液，核酸含量为0.18mg/ml周质液。周质液电泳图见图1中的1。
采用常规后处理方法操作(同实施例1)，最终得到人生长激素25mg/L(发酵液)，纯度91％。
权利要求
1.一种重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法，其特征在于在发酵液中直接加入盐处理细胞，离心收集菌体，然后再加入提取液抽提，离心取上清液，即得周质蛋白液。
2.按权利要求1所述的周质蛋白液的制备方法，其特征在于所述盐包括钠盐、钾盐、铵盐及其它含一价阳离子的可溶性的盐。
3.按权利要求1所述的周质蛋白液的制备方法，其特征在于所述盐的阳离子浓度为78m mol-8000m mol。
4.按权利要求1所述的周质蛋白液的制备方法，其特征在于盐处理细胞的时间为10分钟-4小时。
5.按权利要求1所述的周质蛋白液的制备方法，其特征在于所述提取液是蒸馏水或缓冲液，或在水或缓冲液中还含有蛋白保护基、盐、离子螯合剂EDTA。
6.按权利要求1所述的周质蛋白液的制备方法，其特征在于提取液加入量与菌体湿重的重量比例为5-10∶1。
7.按权利要求1所述的周质蛋白液的制备方法，其特征在于提取液的抽取时间为10分钟-4小时。
全文摘要
一种重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法，通过使用盐处理大肠杆菌细胞以增加细胞外膜的通透性，从而达到专一抽提细胞周质中的蛋白之目的。本方法有效地防止了制备细胞周质液时对细胞细胞壁和内膜的损害，从而减少了细胞内干扰物质对目的蛋白分离纯化的影响。它将促进周质分泌型工程菌的应用，特别是为该类型的基因工程菌工业化应用开辟道路。
文档编号A61K38/00GK1227873SQ9812206
公开日1999年9月8日 申请日期1998年12月4日 优先权日1998年12月4日
发明者林俊 申请人:中国科学院上海细胞生物学研究所