专利名称：活性蛋白c制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类药物领域，特别涉及用活性蛋白C治疗血管疾病。更具体地说，本发明涉及活性人蛋白C的制剂。
背景技术：
蛋白C是丝氨酸蛋白酶和天然存在的抗凝剂，其通过在凝结级联反应中灭活因子Va和VIIIa而调节体内稳态。人蛋白C体内主要在肝脏中合成，是单一的461个氨基酸的多肽。这个单链母体分子经历多个翻译后修饰，包括1)裂解42个氨基酸信号序列；2)蛋白酶解从一个链酶原去除位置156处的赖氨酸残基和位置157处的精氨酸残基，制备成2-链酶原形式的分子(即通过二硫桥与含有丝氨酸蛋白酶的262个氨基酸残基的重链连接的155个氨基酸残基的轻链)；3)在轻链的前42个氨基酸中聚簇的9个谷氨酸残基的维生素K-依赖性羧化作用，产生9个γ-羧基谷氨酸残基；和4)在4个位点(一个在轻链中和三个在重链中)连接碳水化合物。重链含有已充分研究的Asp257，His211和Ser360丝氨酸蛋白酶三联体。最后，成环的2-链酶原在钙离子存在下在磷脂表面被凝血酶体内激活。激活作用来自去除重链的N-末端处的十二肽，产生具有酶活性的活性蛋白C(aPC)。
除了血液凝结级联反应中aPC的酶活性外，aPC也可以自身降解，导致作为一种抗凝剂的降低的功能性。申请人发现了重要的降解途径。轻链的N-末端的自身降解可以导致位置10处组氨酸残基任一侧上的切断。这样，该降解途径得到两种灭活产物；1)去(1-9)活性蛋白C，其中去除了轻链的前9个N-末端残基；和2)去(1-10)活性蛋白C，其中去除了轻链的前10个N-末端残基。该降解途径先前没有报道过，其由于去除位置6和7处的重要的GLA残基而导致抗凝活性降低。因此，降低去(1-9)和去(1-10)活性蛋白C自身降解产物水平在获得强效高纯度的活性蛋白C药物制剂中是重要的。这些变体产物是先前未知的降解产物，并且通过常规纯化技术是非常难以去除的。申请人进一步发现在选定的一组填充剂的存在下固态溶解性明显提高。
十分期望将溶液和冻干固态中的活性蛋白C的这样的降解最小化。因此，这些发现允许制备对于健康护理从业者来说是优良药物的强效高纯度的活性蛋白C制剂。
本发明提供基本上没有这样的自身降解产物特别是活性蛋白C的轻链的去(1-9)和去(1-10)形式的改进的活性蛋白C的制剂。因此，所说的制剂适合对需要它的患者给药。
发明概述本发明提供含有活性蛋白C和选自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖及其混合物的填充剂的稳定冻干制剂。
本发明还提供含有大约2.5mg/ml活性蛋白C，大约15mg/ml蔗糖和大约20mg/ml氯化钠的稳定冻干制剂。此外，本发明提供含有大约5mg/ml活性蛋白C，大约30mg/ml蔗糖和大约38mg/ml氯化钠的稳定冻干制剂。
本发明还提供了制备含有活性蛋白C和选自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖及其混合物的填充剂的制剂的方法。
本发明还提供单位剂量形式，包括含有制剂的单位剂量容器，所述制剂中重量与重量比例是大约1份活性蛋白C，大约7.6份盐和大约6份填充剂。
本发明进一步提供治疗涉及血管内凝结的疾病状态的方法，包括给予这里所描述的活性蛋白C的制剂。
发明详述为了本发明目的，按照这里所公开的和权利要求书所要求的，下面的术语如下定义。
aPC或活性蛋白C指或者重组或者血浆产生的活性蛋白C。aPC包括和优选是人活性蛋白C，但是aPC也可以包括具有蛋白C的蛋白水解活性，酰胺水解活性，酯水解活性和生物活性(抗凝剂或血纤维蛋白溶酶原)的其它种类或衍生物。蛋白C衍生物的例子描述于Gerlitz等美国专利5453373和Foster等美国专利5516650，其中全部内容在这里引作参考。
APTT--激活的部分组织促凝血酶原激酶时间。
r-hPC--重组人蛋白C酶原。
r-aPC--通过体外或体内激活蛋白C酶原或者通过从原核细胞，真核细胞或者转基因动物直接分泌激活形式的蛋白C来制备的重组活性蛋白C，包括，例如从人肾293细胞分泌酶原后根据本领域技术人员公知的和在Yan的美国专利4981952和Cottingham的WO97/20043中证明的技术纯化和激活，这两篇专利全部在此引作参考。
连续灌输--基本上不间断地连续将溶液灌注到血管中，灌注一段特定时间。
大丸剂注射--以确定量(称之为大丸剂)一次注射药物。
适合给药--适合于作为治疗剂给予的冻干的制剂或溶液。
酶原--这里所使用的蛋白C酶原指分泌的灭活形式的一条链或两条链形式的蛋白C。
可药用的缓冲剂--可药用的缓冲剂是本领域已知的。可药用的缓冲剂包括磷酸钠，柠檬酸钠，乙酸钠或TRIS。
活性蛋白C是一种抗凝剂，具有比可得到的抗凝剂更宽的治疗指数，所述可得到的抗凝剂是例如肝素和口服羟基香豆素型抗凝剂。作为一种抗凝剂，aPC对治疗各种各样的涉及血管内凝结的获得性病态具有深刻的影响，包括血栓形成性中风，深处静脉血栓形成，肺栓塞，外周动脉血栓形成，来自心脏或外周动脉的栓塞，急性心肌梗死，弥散性血管内凝结，和急性前毛细血管或后毛细血管闭塞(包括移植或视网膜血栓形成)。
本发明涉及活性蛋白C的制剂。期望的制剂应该是一种由活性蛋白C和选自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖的填充剂组成的高纯度稳定冻干产物。冻干产物用合适的稀释剂例如无菌水或无菌盐水重新配制。优选地，得到的溶液具有大约5.5至大约6.5的pH。
制剂中活性蛋白C，缓冲液，盐浓度，pH，温度和填充剂之间的分子相互作用是复杂的，而且每一个因素对于制剂的稳定性的作用是不可预测的。本发明冻干制剂在重新悬浮时由于减小的自身降解作用而得到稳定的，酶激活的活性蛋白C。本发明具有特别减小水平的去(1-9)aPC和去(1-10)aPC。一般情况下，去(1-9)和去(1-10)aPC的水平小于10％的自身降解产物。优选地，去(1-9)和去(1-10)aPC的水平小于8％的自身降解产物。更优选地，去(1-9)和去(1-10)aPC的水平小于5％并且最优选小于3％的自身降解产物。通过小心控制该过程的条件和通过加入蔗糖，海藻糖，棉子糖或甘露糖醇而获得这种稳定性。令人感兴趣的是，其它填充剂例如羟乙基淀粉和甘氨酸不提供必需的稳定性或药学效果。
本发明填充剂提供一种优良的药物制剂，其具有均一的外观并且当用合适的溶液重新悬浮时易于溶解。重新配制时，该制剂在室温下稳定达24小时至48小时。得到先前没有获得的稳定性。
活性蛋白C的制剂中优选的填充剂是蔗糖，海藻糖和棉子糖。更优选的填充剂是蔗糖和棉子糖，最优选的填充剂是蔗糖。制剂中填充剂的量是以重量对重量为基础1份aPC对1-10份填充剂。此外，制剂中填充剂的浓度是冷冻干燥过程中重要的制剂变量。填充剂的最佳浓度取决于aPC的量和所选择的填充剂的种类。冷冻溶液中蔗糖优选的浓度是10-40mg/ml。蔗糖更优选的浓度是15-30mg/ml。2.5mg/ml aPC的制剂中冷冻溶液的蔗糖最优选的浓度是15mg/ml。 5.0mg/ml aPC的制剂中冷冻溶液的蔗糖最优选的浓度是30mg/ml。所要求的活性蛋白C的制剂中填充剂的存在提供提高的化学和物理稳定性。
冷冻干燥之前和重配时，优选将pH保持在5.5-6.5范围内以使溶液状态自身降解作用最小。制剂的优选的pH是大约5.6和大约6.4之间的pH。更优选的是大约5.7和大约6.3之间的pH。更优选的是大约5.8和大约6.2之间的pH。还更优选的是大约5.9和大约6.1之间的pH。最优选的pH是大约pH6.0。
为了保持有效的pH控制，aPC溶液应该含有可药用的缓冲剂。因此，冷冻-干燥时，制剂任选地和优选地含有可药用的缓冲剂。代表性缓冲剂体系包括Tris-乙酸盐，柠檬酸钠和磷酸钠。更优选的缓冲剂体系包括柠檬酸钠和磷酸钠，最优选的缓冲剂是柠檬酸钠。缓冲剂体系优选的摩尔浓度是10mM-50mM。缓冲剂体系更优选的摩尔浓度是10mM-20mM。最优选的摩尔浓度是40mM。技术人员会认识到很多其它缓冲剂体系是可得到的，其也可以在本发明制剂中使用。
类似地，在冷冻干燥期间和重配之时，离子强度是保证溶液态稳定性的关键变量。离子强度一般通过溶液的盐浓度确定。一般使用可药用的盐来产生离子强度，包括但不限于氯化钾(KCl)和氯化钠(NaCl)。本发明中优选的盐是氯化钠。冷冻-干燥期间，盐浓度必须足够高以在冷冻-干燥周期的冷冻步骤中引起盐的结晶。优选地，氯化钠浓度大于150mM，更优选地，冷冻溶液中氯化钠浓度在150mM-1000mM之间。对于含有2.5mg/ml aPC的制剂，冷冻溶液中更优选的氯化钠浓度在150mM-650mM之间。冷冻溶液中还更优选的氯化钠浓度在250mM-450mM之间。冷冻溶液中还更优选的氯化钠浓度在300mM-400mM之间。对于含有2.5mg/ml aPC的制剂，冷冻溶液中最优选的氯化钠浓度是325mM。
类似地，对于含有5.0mg/ml aPC的制剂，冷冻溶液中更优选的氯化钠浓度在150mM-1000mM之间。冷冻溶液中还更优选的氯化钠浓度在250mM-750mM之间。冷冻溶液中还更优选的氯化钠浓度在400mM-700mM之间。对于含有5.0mg/ml aPC的制剂，冷冻溶液中最优选的氯化钠浓度是650mM。
aPC∶盐∶填充剂(w∶w∶w)的比例是适合冷冻干燥过程的制剂中重要的因素。该比例根据aPC的浓度，选择的盐和浓度和选择的填充剂和浓度而变化。本领域技术人员通过本领域熟知的和例如实施例1中描述的技术容易确定优选的aPC∶盐∶填充剂比例。特别地，1份活性蛋白C与大约7-8份盐与大约5-7份填充剂的重量比是优选的。更优选的是1份活性蛋白C与大约7.5-8份盐与大约5.5-6.5份填充剂的重量比。最优选的是大约1份活性蛋白C与大约7.6份盐与大约6份填充剂的重量比。
优选的盐是325mM(对于含有2.5mg/ml aPC的制剂)和650mM(对于含有5.0mg/ml aPC的制剂)的氯化钠，与蔗糖(w∶w)的比例大约是1.3∶1该浓度足够高以引起盐在冷冻过程中结晶，最可能产生可以被冻干的aPC，蔗糖和柠檬酸盐的非晶形混合物。因此，325mM和650mM优选浓度时氯化钠的离子强度在冷冻-干燥过程中给予制剂以稳定性。
本发明进一步提供制备稳定冻干制剂的方法，包括冻干含有活性蛋白C和选自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖及其混合物的填充剂的溶液。本发明还提供制备稳定冻干制剂的方法，包括冻干含有大约2.5mg/ml活性蛋白C，大约15mg/ml蔗糖，大约19mg/ml氯化钠，和具有大于5.5但是小于6.5的pH的柠檬酸钠缓冲剂的溶液。此外，本发明提供制备稳定冻干制剂的方法，包括冻干含有大约5mg/ml活性蛋白C，大约30mg/ml蔗糖，大约38mg/ml氯化钠，和具有大于5.5但是小于6.5的pH的柠檬酸盐缓冲剂的溶液。
本发明提供单位剂量形式，包括装有含有活性蛋白C和选自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，蔗糖及其混合物的填充剂的稳定冻干制剂的单位剂量容器。此外，本发明提供治疗涉及血管内凝结的疾病状态的方法，包括给予所述制剂。
aPC优选肠胃外给药以保证其以有效形式送递到血液中，给药方式是以合适剂量连续灌输大约1至大约48小时。给予aPC的量是大约0.01mg/kg/hr至大约0.05mg/kg/hr。或者，aPC通过以下方式给药作为大丸剂注射，经大约5分钟至大约30分钟每小时注射一部分合适的剂量，接着以合适的剂量连续灌注大约23小时至大约47小时，这导致经24小时至48小时给予合适的剂量。
下面的实施例将帮助描述怎样实施本发明，并且将详细说明本发明。本发明范围不仅由下面的实施例组成。
制备1制备人蛋白C重组人蛋白C(r-hPC)通过本领域技术人员公知的技术在人肾脏293细胞中产生，例如在Yan的美国专利4981952中提出的那些技术，该专利在这里全文引作参考。Bang等的美国专利4775624中公开了编码人蛋白C的基因并要求专利保护，该专利在这里全文引作参考。用来在293细胞中表达人蛋白C的质粒是质粒pLPC，其在Bang等的美国专利4992373中公开，该专利在这里全文引作参考。质粒pLPC的构建也描述于欧洲专利申请No.0445939，和Grinnell等，1987，生物/技术(Bio/Technology)51189-1192，其全文也在这里引作参考。简而言之，质粒转染到293细胞中，然后鉴定稳定转化物，在没有血清的培养基中传代培养。发酵后，通过微量过滤获得没有细胞的培养基。
通过改进的Yan的美国专利4981952的技术从培养液中分离人蛋白C。在吸附阴离子交换树脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)之前澄清的培养基制成4mM EDTA溶液。用4倍柱体积的20mM Tris，200mM NaCl，pH7.4和2倍柱体积的20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4洗涤后，用20mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH7.4洗脱结合的重组人蛋白C酶原。根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定洗脱后洗脱的蛋白质纯度大于95％。
蛋白质的进一步纯化如下制备氯化钠中的3M蛋白质溶液，接着吸附在20mM Tris，3M NaCl，10mM CaCl2，pH7.4中平衡过的疏水性相互作用树脂(Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas)。用2倍柱体积无CaCl2的平衡缓冲液洗涤后，用20mM Tris，pH7.4洗脱重组人蛋白C。
通过去除残留的钙制备洗脱过的蛋白质用于激活。重组人蛋白C流经金属亲和性柱(Chelex-100，BioRad)去除钙并且再次结合阴离子交换剂(Fast FlowQ，Pharmacia)。这两个柱子顺序排列并且在20mMTris，150mM NaCl，5mM EDTA，pH7.4中平衡。负载蛋白质后，在其从系列中分离之前用1倍柱体积的相同缓冲液洗涤Chelex-100柱。在用0.4M NaCl，20mM Tris-乙酸盐，pH6.5洗脱蛋白质之前用3倍柱体积的平衡缓冲液洗涤阴离子交换柱。通过UV280nm测定重组人蛋白C和重组活性蛋白C溶液的蛋白质浓度，消光系数分别是E0.1％＝1.81或1.85。
制备2重组人蛋白C的激活在50mM HEPES，pH7.5存在下，在4℃下，牛凝血酶偶联至活化的CH-Sepharose4B(Pharmacia)上。偶联反应使用大约5000单位凝血酶/ml树脂在已经装入柱子中的树脂上进行。在将2-氨基-乙醇(MEA)加入到0.6ml/L循环溶液的浓度之前，凝血酶溶液循环通过柱子大约3小时。含有MEA的溶液循环另外10-12小时以保证完全封闭树脂上未反应的胺。封闭后，用10倍柱体积的1M NaCl， 20mM Tris，pH6.5洗涤偶联凝血酶的树脂，以去除所有没有特异性结合的蛋白质，并且在活化缓冲液中平衡之后在激活反应中使用。
纯化的r-hPC制备成5mM EDTA溶液(以螯合所有的残余钙)并且用20mM Tris，pH7.4或20mM Tris-乙酸盐，pH6.5稀释到2mg/ml的浓度。该材料流经在37℃下用50mM氯化钠和20mM Tris，pH7.4或20mMTris-乙酸盐，pH6.5平衡过的凝血酶柱子。调节流速，使r-hPC和凝血酶树脂之间接触时间是大约20分钟。收集洗脱液并且立即测定酰胺水解活性。如果该材料不具有与现有aPC标准相当的比活(酰胺水解)，则其再循环经过凝血酶柱完成r-hPC激活。接着用如上所述的pH是7.4或6.5的20mM缓冲液以1∶1稀释该材料来保持aPC低浓度，同时其等待下面的处理步骤。
从aPC材料中去除淋洗的凝血酶通过使aPC结合于在含有150mM氯化钠的活化缓冲液(20mM Tris，pH7.4或20mM Tris-乙酸盐，pH6.5)中平衡过的阴离子交换树脂(Fast Flow Q，Pharmacia)上来完成。凝血酶在这些条件下不与阴离子交换树脂相互作用，而是通过该柱子进入样品用洗出物。一旦aPC负载到柱子上，用20mM平衡缓冲液进行2-6倍柱体积洗涤，然后使用0.4M NaCl，5mM Tris-乙酸盐，pH6.5或20mM Tris，pH7.4分步洗脱来洗脱结合的aPC。用大体积洗脱柱子有利于更完全去除十二肽。从该柱子上洗脱下来的材料或者贮存在冷冻的溶液中(-20℃)或者作为冻干粉末。
活性蛋白C的抗凝剂活性通过测定激活部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)凝结测试中的凝结时间来测定。在蛋白质浓度125-1000ng/ml范围内在稀释缓冲液(1mg/ml放射免疫测试级别牛血清白蛋白[BSA]，20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.02％NaN3)中制备标准曲线，同时将样品制备成在该浓度范围内的几个稀释度。向每一个样品杯加入50μL冷的马血浆和50μL重配的活化部分组织促凝血酶原激酶时间试剂(APTT试剂，Sigma)并且在37℃下温育5分钟。温育后，向各个杯中加入50μL合适的样品或标样。稀释缓冲液代替样品或标样使用来测定基础凝结时间。向每一个样品或标样加入50μL 37℃30mMCaCl2后立即启动纤维测量器(CoA Screener HemostasisAnalyzer，American Labor)的定时器。从标准曲线的线性回归等式计算样品中活性蛋白C的浓度。这里所报告的凝结时间是三次重复最小值的平均值，包括标准曲线样品。
实施例1活性蛋白C制剂如制备1和2所述制备人活性蛋白C。为了在常规冷冻干燥器中处理而分析活性蛋白C制剂。使用冷冻干燥显微术和差示扫描量热器(DSC)来测定两个参数，这两个参数确定制剂是否可以在常规冷冻干燥器中处理。冷冻干燥显微术可用于确定要冻干的冷冻溶液的萎陷温度。DSC可用于确定冷冻溶液的玻璃化转变温度(Tg’)。萎陷和玻璃化转变温度特别有助于预测可以在冷冻-干燥过程中安全使用的温度上限。冷冻干燥显微术的结果是对DSC获得的玻璃化转变温度Tg’的补充。高于-40℃的萎陷温度对于要在常规冷冻干燥器中处理的样品最好。
表1aPC制剂基质的冷冻干燥处理
aPC与蔗糖与氯化钠(在10或20mM柠檬酸盐缓冲液中)的比例是影响萎陷和玻璃化转变温度的重要制剂变量。在常规冷冻干燥器中处理，氯化钠浓度一定要足够高(优选对于2.5mg/ml aPC是325mM和对于5mg/ml aPC制剂是650mM)以在冷冻干燥处理的冷冻部分期间引起氯化钠结晶出来。aPC的制剂可以在常规冷冻干燥器中处理，产生按重量计由1份aPC，6份蔗糖和7.6份氯化钠组成的冻干产物。
实施例2含有不同填充剂的产物制剂中aPC的稳定性制备aPC的制剂来研究各种填充剂对分子稳定性的影响。一共向不含有盐的磷酸缓冲液中的aPC加入六种赋形剂。这些填充剂是甘氨酸，甘露糖醇，蔗糖，海藻糖，棉子糖和羟乙基淀粉(HES)。aPC在没有盐，没有填充剂的磷酸盐制剂(“对照”)中的稳定性与在填充剂制剂中的相当。样品在50℃，40℃和25℃贮存不同时间。来自这些样品的分析数据与初始值(时间＝0)相比较。使用APTT势能，大小排阻-高效液相色谱(SE-HPLC)，SDS-PAGE，和蛋白质含量测定来评价制剂的物理和化学稳定性。
通过将aPC溶解于磷酸盐缓冲液中达到5mg/ml来制备aPC制剂。以6∶1(填充剂与aPC)的比例或者30mg/ml的浓度向aPC溶液的部分加入填充剂。样品冻干成5mg aPC/瓶。
这些制剂在50℃下稳定14和28天；40℃是28天，48天和6个月；25℃是6和12个月。对于各个时间点，作为分开的样品独立地分析两小瓶各个制剂，并且来自这些样品的数据与来自初始值(时间＝0)的数据相比较。分析包括aPC势能(APTT)，SDS-PAGE，aPC单体的百分含量，和蛋白质含量。
对于所有样品经历一年稳定期在pH，颜色，包装特征和物理外观上没有明显变化。当用APTT和SE-HPLC方法分析时，当与对照相比较时，HES和甘氨酸制剂具有较小物理稳定性(通过聚集)和化学稳定性(势能)。甘露糖醇制剂提供比对照略好的物理和化学稳定性，剩下蔗糖，海藻糖和棉子糖制剂，与对照相比，都表现出更优越的物理和化学稳定性。因此，甘露糖醇，蔗糖，海藻糖和棉子糖作为aPC制剂中的填充剂，当与没有填充剂的aPC制剂或者甘氨酸或HES制剂相比较时，具有更高的化学和物理稳定性。
实施例3重组人活性蛋白C的稳定性将两批重组人活性蛋白C(aPC)的冻干制剂在40℃/75％相对湿度下贮存一个月，然后分析可能的降解作用。在用无菌水重配和室温下贮存72小时后再次检测aPC的稳定性。冻干的aPC产物每瓶由10mgaPC，60mg蔗糖，76mg氯化钠和15.1mg柠檬酸盐组成。当在40℃/75％相对湿度下贮存时，该制剂中的aPC在干燥状态下稳定至少一个月，当在室温下贮存时在溶液中稳定24小时。
使用每瓶10mg aPC，60mg蔗糖，76mg氯化钠和15.1mg柠檬酸盐的相同单位配方制备两批。两批冻干的aPC在40℃/75％相对湿度下贮存一个月，并且使用APTT势能测定，用于aPC肽定量的离子配对HPLC和用于蛋白质变体形式定量的质谱监测aPC的稳定性。一批还用无菌水重配成1mg/ml aPC，并且置于室温下。使用APTT和质谱方法在0，1，4，8，24，48和72小时监测溶液中aPC的稳定性。
在40℃/75％相对湿度下在干燥状态中贮存一个月后没有aPC活性的损失和不明显量的分子结构降解。该制剂中的aPC在重配后在1mg/ml稳定达24小时。
权利要求
1.一种含有活性蛋白C和选自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，和蔗糖，及其混合物的填充剂的稳定冻干制剂。
2.权利要求1的制剂，其中填充剂是蔗糖，海藻糖或棉子糖。
3.权利要求2的制剂，其中填充剂是蔗糖或棉子糖。
4.权利要求3的制剂，其中填充剂是蔗糖。
5.权利要求1的制剂，其进一步含有可药用的盐。
6.权利要求5的制剂，其中重量比是大约1份活性蛋白C，大约7-8份盐和大约5-7份填充剂。
7.权利要求6的制剂，其中重量比是大约1份活性蛋白C，大约7.2-7.8份盐和大约5.5-6.5份填充剂。
8.权利要求7的制剂，其中重量比是大约1份活性蛋白C，大约7.6份盐和大约6份填充剂。
9.权利要求8的制剂，其中盐是氯化钠。
10.权利要求9的制剂，其中填充剂是蔗糖。
11.权利要求1的制剂，其进一步含有可药用的缓冲剂。
12.权利要求11的制剂，其中所述缓冲剂选自Tris-乙酸盐，柠檬酸钠，或磷酸钠。
13.权利要求12的可药用的缓冲剂，其中所述缓冲剂是柠檬酸钠。
14.一种含有大约2.5mg/ml活性蛋白C，大约15mg/ml蔗糖，和大约20mg/ml氯化钠的稳定冻干制剂。
15.一种含有大约5mg/ml活性蛋白C，大约30mg/ml蔗糖，和大约38mg/ml氯化钠的稳定冻干制剂。
16.一种制备权利要求1的制剂的方法，包括冻干含有活性蛋白C和选自甘露糖醇，海藻糖，棉子糖，和蔗糖，及其混合物的填充剂的溶液。
17.权利要求16的方法，其中填充剂是蔗糖，海藻糖或棉子糖。
18.权利要求17的方法，其中填充剂是蔗糖或棉子糖。
19.权利要求18的制剂，其中填充剂是蔗糖。
20.权利要求16的方法，其进一步含有可药用的盐。
21.权利要求20的方法，其中重量比是大约1份活性蛋白C，大约7-8份盐和大约5-7份填充剂。
22.权利要求21的方法，其中重量比是大约1份活性蛋白C，大约7.2-7.8份盐和大约5.5-6.5份填充剂。
23.权利要求22的方法，其中重量比是大约1份活性蛋白C，大约7.6份盐和大约6份填充剂。
24.权利要求16的方法，其中溶液的pH是在5.5-6.5之间。
25.权利要求24的方法，其中pH是大约5.8-6.2。
26.权利要求25的方法，其中pH是大约6.0。
27.一种制备稳定冻干制剂的方法，包括冻干含有大约2.5mg/ml活性蛋白C，大约15mg/ml蔗糖，大约20mg/ml氯化钠和柠檬酸盐缓冲剂的溶液，所述溶液具有大于5.8但是小于6.2的pH。
28.一种制备稳定冻干制剂的方法，包括冻干含有大约5mg/ml活性蛋白C，大约30mg/ml蔗糖，大约38mg/ml氯化钠和柠檬酸盐缓冲剂的溶液，所述溶液具有大于5.8但是小于6.2的pH。
29.包括含有权利要求1的制剂的一个单位剂量容器的单位剂量形式。
30.包括含有权利要求8的制剂的一个单位剂量容器的单位剂量形式。
31.治疗涉及血管内凝结的获得性疾病状态的方法，包括对需要它的患者给予权利要求1的制剂。
32.治疗涉及血管内凝结的获得性疾病状态的方法，包括对需要它的患者给药权利要求14的制剂。
33.治疗涉及血管内凝结的获得性疾病状态的方法，包括对需要它的患者给予权利要求15的制剂。
34.权利要求1至12中任一项的稳定冻干制剂作为治疗涉及血管内凝结的疾病状态的药物的用途。
35.权利要求1至12中任一项的稳定冻干制剂作为治疗血栓形成性中风的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及活性蛋白C的药物制剂,其还含有蔗糖,氯化钠和pH在大约5.5和大约6.5之间的柠檬酸钠缓冲液。本发明活性蛋白C制剂比活性蛋白C的其它制剂更稳定,并且长时间放置降解产物更少。
文档编号A61K31/715GK1254284SQ98804567
公开日2000年5月24日 申请日期1998年4月24日 优先权日1997年4月28日
发明者A·D·卡尔森, T·A·舍利加 申请人:伊莱利利公司