大麻素修饰的核酸分子的制作方法
【专利说明】大麻素修饰的核酸分子
【发明内容】
[0001] 本发明涉及包含至少一个多不饱和脂肪酸残基，特别是花生四烯酸残基，更特别 是大麻素（花生四烯酸乙醇胺）残基，以及与其共价结合的至少一个核苷组分，所述核苷组 分选自核酸、核苷和核苷酸。该缀合物适合于高效率的细胞转染，所述细胞例如哺乳动物细 胞包括人细胞。因此，提供了用于治疗性分子包括反义分子、siRNA分子、miRNA分子、诘抗 剂或者这些分子的前体、以及治疗性核苷或核苷酸的新递送媒介物。
[0002] RNA干扰是一个功能强大的工具，其利用短RNA双链来抑制细胞中的特定蛋白质 的形成（1-3)。在自然界中，沉默RNA分子由更大的转录物被Dicer复合物切割而产生（4)。 然而对于生物技术应用，RNA分子（siRNA)是化学制备并施用的。将siRNA用作治疗剂的 想法（5)在过去十年里被强烈地追求，但最主要的障碍是RNA双链体的差细胞摄取不能被 克服（6)。目前，集中研宄RNA递送系统，不同的如纳米粒子（7,8)、脂质体（9，10)或聚阳 离子聚合物（11)。尽管在该领域有重大进展，然而，经常仍然是高毒性（12-14)和低细胞特 异性，这代表未解决的问题。
[0003] 最近，受体介导的内吞作用已演变为允许SiRNA靶向特定细胞类型的备选递送策 略（16-25)。该方法需要将siRNA连接至与细胞类型特异性受体结合的配体。这启动内化 过程，导致RNA-配体缀合物的吸收。目前，该策略在胆固醇修饰的RNA(24)时最成功地执 行。
[0004] 在这里，我们报告此类受体介导的策略可成功用于解决敏感的细胞如神经细胞 (26,27)和免疫细胞（28)至今很难被转染的问题。我们发现，存在于这两种细胞类型（29) 上的大麻素受体可以用花生四烯酸乙醇酰胺（30, 31)(大麻素）修饰的siRNA进行有效地 革巴向。
[0005] 本发明的第一个方面是包含多不饱和脂肪酸残基和与其共价结合的核苷组分的 缀合物，其中所述核苷组分选自核酸、核苷和核苷酸。
[0006] 术语"缀合物"还包括盐，特别是药学上可接受的盐，如具有无机或有机酸或者碱 的加成盐，如本领域所已知的。
[0007] 缀合物包含至少一个多不饱和脂肪酸残基，特别是1-10,更特别是1-5个脂肪酸。 甚至更特别的是，缀合物包含1或2个多不饱和脂肪酸残基。最特别的是，缀合物包含1个 多不饱和脂肪酸残基。
[0008] 在特定的实施例中，多不饱和脂肪酸残基是花生四烯酸（AA)残基，更特别是花生 四烯酸乙醇酰胺（大麻素）酸残基。
[0009] 在进一步的【具体实施方式】，附着至多不饱和脂肪酸残基的核苷组分是核酸分子， 更特别的是RNA分子。
[0010] 缀合物包含至少一个核苷组分，特别是1-25,更特别是2-20或2-10,和甚至更特 别是2-8,即2、3、4、5、6、7或8个核苷组分。如果缀合物包含多于一个核苷组分，核苷组分 可以是相同的或不同的。
[0011] 在进一步的【具体实施方式】中，缀合物包含1个多不饱和脂肪酸残基，例如大麻素 残基和2-20,特别是2-8,即2、3、4、5、6、7或8个核苷组分。
[0012] 在一个实施方式中，缀合物可以具有线性结构。因此，核苷组分可以连接在线性链 中，其中多不饱和脂肪酸残基可以存在于链中，在链的一端或链的两端。
[0013] 在另一个实施方式中，缀合物具有分枝的结构，其中通过分枝的连接体将核苷组 分结合至多不饱和脂肪酸残基，所述连接体例如树枝状连接体。
[0014] 术语"多不饱和脂肪酸残基"包括游离脂肪酸残基，但也包括脂肪酸衍生物残基， 特别是脂肪酸酯残基，或脂肪酸酰胺残基，脂肪酸磺酸酯残基，脂肪酸硫酸酯残基、脂肪酸 膦酸酯残基、脂肪酸磷酸酯残基等。提供多不饱和脂肪酸残基具有至少一个核苷组分可以 共价结合的功能基团。功能基团可以是脂肪酸的羧基或另一种功能基团，如存在于酯残基 的醇上的功能基团或存在于胺残基的酰胺上的功能基团，如OH或NH 2基团。酯残基的醇部 分可以例如为具有其他功能基团的q_5醇，如乙二醇、丙二醇或甘油。酰胺残基的胺部分可 是具有其他功能基团的Q_ 5胺，如乙醇胺、丙醇胺或乙二胺。
[0015] 在缀合物中存在的多不饱和脂肪酸残基优选地是多不饱和C16_C24脂肪酸残基，特 别是C 18、C19、C2(l、C21或C 22脂肪酸残基，更特别是C 2(|脂肪酸残基。多不饱和脂肪酸残基具 有至少2个C = C键，特别是3、4、5或6个并且更特别是4个C = C键。至少1-5,特别是 4个C = C键是以Z构型。更特别地，所有的双键是以Z构型。
[0016] 多不饱和脂肪酸残基的具体例子选自顺-5, 8, 11，14-二十碳四烯酸（花生四烯 酸）残基，顺-5, 8, 11，14, 17-二十碳五烯酸（EPA)残基，顺-4, 7, 10, 13, 16, 19-二十二碳 六烯酸（DHA)残基、顺-6, 9, 12-十八碳三烯酸（GLA)残基和顺-8, 11，14-二十碳三烯酸 (DGLA)残基。更特别的是，脂肪酸残基是花生四烯酸残基。在一个特别优选的具体实施方 式中，脂肪酸残基是花生四烯酸乙醇酰胺（大麻素）。
[0017] 脂肪酸残基共价结合至至少一个核苷组分。优选地，脂肪酸残基通过连接体结合 至至少一个核苷组分。连接体可以是线性的或分枝的连接体，并通常具有2-50个原子的链 长度，原子包括碳原子和特别是如S、N和/或0原子的杂原子。
[0018] 例如，连接体可以是线性的连接体，例如连接体包括至少一个，例如1-10,特别是 2_5和更特别是3个Ci_C 3环氧烧基团，特别是环氧乙烧基团。
[0019] 备选地，连接体可以是分枝的，例如树枝状连接体。
[0020] 可以通过已知的连接体技术将多不饱和脂肪酸残基连接至至少一个核苷组分。 然而优选地，附着包括Click反应，例如叠氮化物与炔烃基团之间，在受限的烯烃之间， 例如降冰片烯和腈亚胺、氧化腈或四嗪，从而产生通过Click反应形成的环基团，特别是 1，2, 3-三氮唑基团。
[0021] 在优选的实施方式中，多不饱和脂肪酸残基是受体配体，优选地是真核细胞的膜 中存在的受体的配体，特别是哺乳动物细胞如人细胞的膜中存在的受体的配体。更优选地， 多不饱和脂肪酸残基是大麻素受体的配体，如（48)所描述的，其内容并入本文。
[0022] 在特定的实施方式中，本发明的缀合物表示为通式（la)或（lb)
[0023] Fn一(Lm-N) r (la)
[0024] Fn-(Lm-N) r-Lm-Fn (lb)
[0025] 其中
[0026] F是多不饱和脂肪酸残基，
[0027] L是连接体，
[0028] N是选自核酸、核苷和核苷酸的核苷组分，
[0029] n是1-10,优选地1-5,更优选地1的整数，
[0030] m 是 0 或 1，
[0031] r是1-25,优选地2-20和更优选地2-8的整数。
[0032] 在这个实施方式中，缀合物可以由例如如下结构表示：
[0033] F-L-N
[0034] F- (L-N) r
[0035] 其中F、L、N和r是如上文所定义的，
[0036] F-L*- (N)r
[0037] 其中I；是分枝的连接体并且F、N和r是如上文所定义的，
[0038] F- (L-N)r-L-F
[0039] 其中F、L、N和r是如上文所定义的。
[0040] 在另一个实施例中，缀合物可包含其他受体配体，其共价结合至至少一个核苷组 分。其他受体配体是不同于多不饱和脂肪酸残基的化合物，如叶酸、胆固醇或激素。
[0041] 在该【具体实施方式】中，缀合物可由具有通式（II)的结构表示
[0042] Fn-(Lm-N) r-Lm-Zs (II)
[0043] 其中
[0044] F是多不饱和脂肪酸残基，
[0045] L是连接体，
[0046] n是1-10,优选地1-5,更优选地1的整数，
[0047] m 是 0 或 1，
[0048] N是选自核酸、核苷和核苷酸的核苷组分，
[0049] r是1-25,优选地2-20和更优选地2-8的整数
[0050] Z是其他受体配体，和
[0051] s是1-10,优选地1-5,更优选地1的整数。
[0052] 在该实施方式中，缀合物可由如下结构表示：
[0053] F-L-N-Z
[0054] F- (L-N)r-L-Z
[0055] 其中F、L、N、Z和r是如上文所定义的，
[0056] F-L*- (N)r-L-Z
[0057] I；是分枝的连接体并且F、L、N、Z和r是如上文所定义的。
[0058] 本发明的缀合物包含选自核酸、核苷和核苷酸的至少一个核苷组分。
[0059] 术语"核酸"包括单股单链和双链核酸分子，如DNA分子或RNA分子和及其类似物。 核酸类似物是包含如下所描述的至少一个经修饰的构建区块的核酸分子。
[0060] 在一个实施方式中，核酸分子是其包含至少一个经修饰的构建区块的DNA分子。 术语"DNA分子"包括单链或双链DNA分子。在双链DNA分子中，各链可以以单独的分子存 在或者通过单链环或通过异源连接体而共价连接。
[0061] 术语"DNA分子"包括由天然DNA构建区块即2' -脱氧核苷酸构建区块构成的分 子，和包含至少一个经修饰的构建区块的分子。
[0062] 在进一步的实施方式中，核酸分子是RNA分子，其可包含至少一个经修饰的构建 区块。术语"RNA分子"包括单链或双链RNA分子，其中双链RNA分子具有至少一个突出，例 如至少一个3' -突出。在双链RNA分子，各链可以以单独的分子存着或者通过单链环或通 过异源连接体而共价连接。
[0063] 术语"RNA分子"包括由天然RNA构建区块即2' -核糖核苷酸构建区块组成的分 子，和包含至少一个经修饰的构建区块的分子。
[0064] 经修饰的构建区块可以选自糖_、主干-和/或核碱基-修饰的构建区块。糖-修 饰的脱氧核糖核苷酸包含与脱氧核糖不同的糖基团，例如经修饰脱氧核糖基团，其中2'-H 基团被选自〇H、R、OR、卤素、SH、SR、NH2、NHR，殿2或CN的基团取代，其中R是C「C6烷基或 烷氧基，或者(：2-(：6烯基或炔基，并且卤素是？、(：