4. 0] ^^一碳-7-烯，
[0121] 9 =蝶酸
[0122] TFA=三氟乙酸，和
[0123] CDI=羰基二咪唑
[0124] 图 2
[0125] 靶向海肾荧光素酶的大麻素和叶酸修饰的siRNA的化学结构和序列。
[0126] 图 3
[0127] 递送荧光素标记的siRNA和dsDNA至RBL-2H3和HeLa细胞。用大麻素（AEA)修 饰的dsDNA和siRNA孵育表达大麻素受体的RBL-2H3细胞。用叶酸（FA)修饰的dsDNA和 siRNA孵育表达叶酸受体的HeLa细胞。作为阴性对照，用缺乏配体修饰的双链体孵育这两 种细胞系。
[0128] 图 4
[0129] a、b)在HeLa细胞中通过叶酸（FA，紫）修饰的siRNA介导的和在RBL-2H3细胞中 通过大麻素（AEA，蓝色）修饰的siRNA介导的海肾荧光素酶的相对沉默。通过荧光素酶活 性进行定量。c)在RBL-2H3细胞中通过胆固醇（Chol，绿色）和大麻素（AEA，蓝色）修饰的 siRNA介导的肾荧光素酶的相对沉默。通过荧光素酶活性进行定量。d)在RBL-2H3细胞中 通过胆固醇（Chol，绿色）和大麻素（AEA，蓝色）修饰的siRNA介导的脾酪氨酸激酶酶的相 对沉默。通过确定mRNA水平进行定量。
[0130] 图 5
[0131] 在人B细胞（BJAB)中通过大麻素（AEA，蓝色）修饰的siRNA介导的和通过jet PRME(JP，灰色）封装的非修饰siRNA介导的荧光素酶的相对沉默。基因沉默AEA修饰的 siRNA的基因沉默作用与jetprime封装的siRNA相似。
[0132] 图 6
[0133] 显示了大麻素（AEA，蓝色）修饰的siRNA和jetPRME封装的siRNA(JP，灰色） 的细胞毒性。通过cytotoxGio细胞毒性测定法（Promega)进行定量。也显示了正常细胞 的生长（空白，黑色）和诱导的细胞死亡（阳性对照，红色）。在1.0UM的浓度，AEA修饰 的siRNA没有表现出细胞毒性。相比之下，jetPRME封装的siRNA显示出细胞毒性的剂 量依赖性增加。
[0134] 图 7
[0135] 不同大麻素修饰的siRNA的比较。
[0136] a)大麻素（AEA配体）、连接体和单siRNA分子的缀合物。
[0137] b)AEA_配体、分枝的连接体和三个siRNA分子的缀合物。
[0138] 图 8
[0139] a) 9-倍叠氮化物修饰的大麻素缀合物作为用于生产9-倍siRNA修饰的大麻素的 试剂。
[0140] b)通过铜催化的炔烃-叠氮化物Click反应（CuAAC)，将炔烃-修饰的RNA寡聚 核苷酸共价缀合至9-倍炔烃-叠氮化物-修饰的大麻素的方案。
[0141] 图 9
[0142] a、b) 9-倍叠氮化物-修饰的大麻素构建体的示例性合成。
[0143] 图 10
[0144] 通过HPLC和质谱对9-倍和8-倍大麻素-修饰的RNA寡核苷酸的表征。
[0145] 图 11
[0146] 具有1、3、7、8和9个siRNA分子的不同的大麻素（AEA)修饰的RNA构建体的siRNA 功效比较。通过荧光素酶活性进行定量。在具有3个和7个siRNA分子/受体配体的构建 体中出现最高功效。
[0147] 图 12
[0148] 具有1、3、8或9个siRNA分子/构建体的缀合物对内源基因（SYK)下调的功效的 比较。
[0149] 具有3个siRNA分子/大麻素的构建体显示了最好的结果。 实施例
[0150] 1.RNA-配体缀合物的合成
[0151] 如图1所示进行大麻素修饰的RNA链的合成。合成的中心内容是炔烃修饰的RNA 链和相应配体叠氮化合物1之间的Cu-催化的炔烃-叠氮化物click反应（34-39)。为了 比较大麻素修饰的RNA链与其他系统，我们利用click方法也用于使用叶酸叠氮化物2制 备叶酸-RNA(40)缀合物和用于使用胆固醇叠氮化物3制备胆固醇修饰的RNA链。我们在 所有情况下引入RNA链和各自配体之间的短四乙二醇间隔体。click技术在所有情况下能 够有效连接疏水性的和常常是非常难溶的（叶酸）配体分子至RNA。此外，该方法使得能够 以更难地有效缀合至siRNA双链体的3' -末端。3' -修饰的siRNA链通常更耐受RNAi机制 (41)。为了实现3'-末端附着，我们在RNA合成中使用在C5具有辛二烯（octadiine)柄的 脱氧尿嘧啶亚磷酰胺。
[0152] 在仅仅一步中从花生四烯酸4以及叠氮基-和氨基-官能化的寡聚乙二醇5制备 大麻素叠氮化物配体1。采用相同的策略用于合成胆固醇叠氮化物3。通过更精细的合成来 制备叶酸衍生物2,起始于受保护的谷氨酸衍生物6,其使用氨基-叠氮化物四乙二醇化合 物5进行缩合。在叶酸2去保护之后，提供Fmoc基团的切割以及与蝶酸的缀合。化合物2 以这种方式包含附着至Y-羧基基团的乙二醇间隔体，其提供了具有优越的受体结合特性 的叶酸化合物（42)。三个叠氮化物随后以优异的产率与含有RNA正义链的炔烃进行click。 在HPLC纯化后，配体修饰的RNA杂交到反义的相对链从而获得siRNA双链体，如图2中所 不〇
[0153] 2.递送RNA-配体缀合物至细胞中
[0154] 为了显示递送RNA双链体至活细胞中，我们最初将大麻素-和叶酸-修饰的RNA 正义链杂交至含有荧光素标签的反义链。图3显示了使用两个不同细胞系执行的共聚焦显 微镜研宄的结果。对于大麻素修饰的RNA双链体，我们利用RBL-2H3细胞，其作为用于免疫 细胞功能的模型（43)。Barker等人能够显示RBL-2H3细胞对大麻素的摄取与神经元细胞 和星形胶质细胞是功能上等同的（44)。因此该细胞系是免疫细胞和神经元中大麻素摄取的 极好模型。
[0155] 用已知过表达叶酸受体的HeLa癌细胞研宄对叶酸修饰的RNA双链体的摄取。显微 镜研宄表明，未修饰的siRNA按预期无法进入这两个细胞系。然而在各细胞中容易地检测 到大麻素和叶酸修饰的siRNA证明存在摄取。使用经修饰的dsDNA也观察到相同的结果， 这表明摄取完全是配体依赖的（图3)。
[0156] 为了证明递送的siRNA分子表现出预期的RNAi作用，我们利用商业上可得的双荧 光素酶报告子测定法。包含两个荧光素酶（海肾和萤火虫）的质粒转染入细胞。通过靶向 海肾荧光素酶的表达来评价RNAi，而萤火虫荧光素酶作为内部标准。对于这些研宄，我们使 用配体修饰的siRNA而无进一步的焚光素修饰。使用未修饰的RNA双链体（无配体，无焚 光素）的初始对照实验表明海肾表达不受影响。与此相反的是，我们观察到在两种细胞系 中存在配体修饰的siRNA时，海肾表达的剂量依赖性沉默（图4)。最重要的是，即使相对少 量的siRNA-配体缀合物已经显示相当大的影响，最终导致大约60%左右的相对沉默。
[0157] 用混杂的siRNA进行最后的对照实验。再一次地，我们无法检测到任何发光减少， 表明观察到的沉默是由大麻素修饰的siRNA与mRNA靶的特异性结合所引起的。
[0158] 下一步评价与胆固醇-siRNA缀合物相比，大麻素修饰的siRNA的沉默功效（24)。 此比较的结果如图4所示。令我们吃惊的是，我们注意到新的大麻素1修饰的siRNA-直比 广泛利用的胆固醇系统明显更有效，这确立了大麻素配体作为一个强大的新的递送工具。
[0159] 为了研宄大麻素-siRNA缀合物是否能够向下调节治疗重要的内源基因产物，我 们下一步试图抑制脾酪氨酸激酶（SYK)的表达，脾酪氨酸激酶是参与IgE依赖性炎症信号 传导级联的一种关键蛋白。因此，该蛋白是治疗过敏性和炎症性疾病（45,46)的预期靶标。 对于实验，我们制备大麻素修饰的siRNA，其序列如Sanderson等人描述（47)。将siRNA缀 合物添加至RBL-2H3细胞后，我们使用实时PCR监视表达水平。事实上，SYK蛋白的表达成 功减少了约55% (图4)，并且再次发现大麻素缀合物比胆固醇修饰的siRNA显著地更有活 性。
[0160] 总之，我们在这里报告了使用Cu-催化的炔烃-叠氮化物化学来构建新的大麻素 siRNA缀合物。所述化学使得能够以优异的产率和纯度在3' -末端有效构建不同配体修饰 的RNA。对于很难获得的经叶酸修饰的寡核苷酸，这是特别值得一提的。大麻素缀合物允许 转染免疫细胞，并提供优异的沉默数据。我们认为大麻素配体，与click化学组合，具有成 为转染神经细胞和免疫细胞的新的黄金标准的潜力。
[0161] 3.对狂犬病病毒蛋白质的调节
[0162] 显示大麻素siRNA调节狂犬病病毒蛋白质。将siRNA针对病毒株SADL16的N-和 P-蛋白（...）。通过病毒滴定法和生长图，显示mRNA敲减对狂犬病病毒的整个生命周期产 生负面影响。
[0163] 用狂犬病病毒感染细胞及随后转染不同的大麻素-siRNA构建体后，测定细胞培 养基中的病毒滴度（ffu/mL)。发现病毒滴度的减少高达99%。
[0164] 用BJAB细胞（人伯基特淋巴瘤B细胞）、白血病细胞（人T细胞白血病细胞）和 E14细胞（小鼠皮层神经元）进行了实验。
[0165] 4.对蛋白质FKBP51的调节
[0166] 在分离的人PBMC细胞中，测试针对蛋白FKBP51的mRNA的大麻素-siRNA缀合物 进行测试。FKBP51调节留体激素受体的信号转导，并且其尤其与某些精神疾病以及阿尔茨 海默病相关。
[0167] 实验显示了 70%的蛋白质敲减。
[0168] 参考文献
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