附有dna修复抑制剂和核定位信号元件的纳米颗粒的制作方法
【专利说明】附有DNA修复抑制剂和核定位信号元件的纳米颗粒
[0001] 本发明涉及放疗或化疗增敏复合物，其包含纳米颗粒和附着于所述纳米颗粒的 DNA修复抑制剂和核定位信号元件（NLS)。这样的复合物用于治疗疾病，例如癌症。
[0002] 纳米技术代表了着眼于原子和分子操作的科学领域，其产生在纳米标度范围的新 结构。这些结构通常获得独特的和意外的性能。在癌症纳米技术中，焦点在于开发可以诊 断、输送治疗剂、和监测癌症治疗进程的纳米标度设备。理论上，任何成像或治疗系统会专 门地靶向肿瘤细胞簇或肿瘤细胞的脉管系统，优选地在恶性转化的早期具有所述能力。过 去的几十年，我们在基础癌症生物学和DNA损伤应答的理解上看到突出的进展（Risinger andGroden；CancerCell,6 ：539,2004 ；0rDriscollandJeggo；NatRevGenet；7 ：45, 2006,Girard,Kyselaetal；HumMolGenet13 ：1,2004,Weller,Kysela,Royetal； Science297:5527,2002)。然而这种进展没有伴随着与之相当的临床进步。举例来说，在 人类中的放射治疗受益于技术进步和计算机化，而不是基于知识来操纵癌细胞对治疗性放 射的生物学应答（Beggetal，Radiother0ncol，86:295,2008)。
[0003] 纳米颗粒可用于引导材料进入细胞。所述细胞吞噬和摄取所述纳米颗粒以及任何 附着于所述颗粒的组分。
[0004] 申请人认识到这具有促进引导化疗增敏和放疗增敏复合物进入细胞的潜力。这些 复合物许多需要靶向细胞核来起作用。因此申请人认识到也有一种需求，一旦复合物在所 述细胞内，能够靶向引导它们到细胞核。
[0005] 因此，本发明提供一种放疗或化疗增敏复合物，其包含纳米颗粒和附着于所述纳 米颗粒的（i)DNA修复抑制剂；和（ii)核定位信号元件（NLS);任选地，通过一个或多个接 头部分附着。
[0006] 所述纳米颗粒直径通常低于100nm，通常为l-50nm、5-30nm或10_15nm。
[0007] 所述DNA修复抑制剂作用为使所述细胞对于射线或化学治疗剂敏感。
[0008] 所述DNA修复抑制剂和NLS可以分别附着于所述纳米颗粒，任选地，通过接头部分 附着。也就是说，所述抑制剂和NLS可以附着于纳米颗粒的不同部分。或者，所述DNA抑制 剂可以通过，例如，接头部分，附着于所述纳米颗粒，并且所述NLS可以附着于所述DNA修复 抑制剂（如融合蛋白/肽）或附着于接头部分的不同的部分，例如作为悬垂部分（pendant moiety)。或者，所述NLS可以通过，例如，接头部分，附着于所述纳米颗粒，并且所述DNA修 复抑制剂可以附着于所述NLS，或所述接头部分（例如作为悬垂部分）。
[0009] 许多放射治疗剂，例如y射线或x射线，和化学治疗剂（例如融合蛋白如博来霉 素），损伤靶细胞，诱导DNA链断裂。DNA双螺旋的一半被断裂即发生单链断裂。这样的单 链断裂相对易于通过细胞内的DNA修复系统而修复。然而，可能在彼此相对的DNA螺旋的 两条链上发生的双链断裂更难修复。其对于细胞特别成问题，因为其可以导致基因组重排。 存在三种机制来修复双链断裂（DSB):非同源的末端连接、微同源介导的末端连接和同源 重组。如果链断裂没有被正确地修复或DNA双链断裂根本没有修复，细胞经常会在下次有 丝分裂时死亡。
[0010] 修复抑制剂是本领域众所周知的。通常地，所述抑制剂可以是DNA双链断裂修复 的抑制剂，而如上讨论的DSB可能杀死所述复合物所靶向的细胞或使其丧失能力。所述DNA抑制剂可以是NBS1(NijmegenBreakageSyndromel，Nibrin)。这是一种 754 个氨基酸的 蛋白质，鉴定为NBSl/hMrell/RAD50双链DNA断裂修复复合体的成员。这个复合体识别DNA 损伤、迅速地重新定位到DSB位置并形成核焦点。典型的NBS1序列是KEESLADDL。
[0011] 也可以使用此抑制剂以及其他DNA修复抑制剂的片段，所述片段仍然保持DNA修 复抑制活性。
[0012] 所述DNA抑制剂可以是Ku70或其片段。Ku70是由XRCC6编码的蛋白质。蛋白 质与Ku80 -起组成Ku异源二聚体，其结合到DBS端部并参与DNA修复。可以使用模拟所 述Ku80 蛋白质的结构域的合成肽（EGGDVDDLDMI)KimetalJ.Pharmacol.Exp.Therap. (2002)303 ：353〇
[0013] PARP1 (聚[ADP-核糖]聚合酶-1)通过聚ADP-核糖基化修饰细胞核蛋白质。它连 同BRCA参与DSB修复。另外，PARP1还参与单链DNA断裂的修复。或者，主要修复抑制剂可 以是Hlx或其片段。接头组蛋白普遍存在于所有体细胞。参见，例如，PCT/GB2011/051180、 W0/2011/161457。
[0014] 还可以使用DNA磷酸激酶抑制剂。
[0015] 举例来说，所述NLS可以是腺病毒或SV40NLS，或合成的序列例如M4靶向序列。 所述M4靶向序列可以是KKKKKKGGRGDMFG。所述腺病毒NLS可以是GGFSTSLRARKA。
[0016] 还可以使用合成NLS。NLS是在本领域众所周知的。上述M4靶向序列是合成肽， 所述腺病毒NLS是天然存在的靶向序列。
[0017] 所述纳米颗粒通常是金属纳米颗粒，例如过渡金属颗粒。这些包括金、铂或钯，或 其混合物。举例来说，铂和金的优点是这样的颗粒可以通过产生光电子和俄歇电子增强电 离福射的效果（Zhengetal;Radiat.Res. (2008)，169:19，Hainfeldetal;Phys.Med. Biol. (2004)，49:N309,andBistonetal;CancerRes. (2004)，64:2317)。可以将所述 电离辐射调节到允许产生这样的电子，从而增加在所靶向的细胞上的放射效果。通过放 射产生的电子的效果依赖于靠近DNA，因为负责所述效果的次级电子的行进的预期距离短 (Zhengetal(Supra)和Regullaetal(Rad.Res. (1998) 150:92)。NLS的存在帮助使所 述纳米颗粒祀向所述细胞核，从而帮助纳米颗粒定位靠近DNA。
[0018] 基于肽的DNA修复抑制剂和/或NLS可以通过众所周知的系统附着于所述纳米颗 粒上。举例来说，可以使用对金属纳米颗粒有亲合力的接头部分。这样的接头部分包括含硫 接头例如硫辛酸、金结合肽 1(Brownetal，Nat.Biotech. (1997)，15 :269)、3R-GBP1 (其包 含3个MHGKTQATSGTIQS的结合到金和铂表面的重复序列（Tamerleretal;Small(2006)2 : 1372))、CALNN肽（LevyR，J.Am.Chem.Soc. (2004) 126 (32)，10076-84)。
[0019] 也可以将一个或多个额外部分附着于所述复合物。举例来说，所述额外部分可以 使用例如上述的接头部分直接附着于所述纳米颗粒，或二者选一地，附着于所述DNA修复 抑制剂、NLS和/或它们的接头部分。举例来说，一个或多个额外部分可以选自化学治疗剂、 DNA交联剂、显像剂、造影剂和表面靶向剂。可以使用两个或更多个额外类型的部分。
[0020] 举例来说，化学治疗剂可以是诱导DNA损伤（例如DNA单链或通常地双链断裂） 的药剂。举例来说，博来霉素是一种通过细菌轮枝链霉菌（Streptomycesverticillus)产 生的糖肽抗生素。已知为抗癌剂，化学治疗的形式主要地是博来霉素A2和B2。它通过引起 DNA断裂来起作用。
[0021] 所述化学治疗剂也可以是阿霉素。阿霉素是一种蒽环类抗生素，其通常用于治疗 广泛的癌症，并插入到DNA中。
[0022] 可以与其他化学治疗剂（包括博来霉素和calichaemycin)组合使用。另一种化 学治疗剂可以是喜树碱。喜树碱是一种细胞毒性的喹啉生物碱，其抑制DNA酶拓扑异构酶 I。喜树碱和两种类似物（托泊替康和依立替康）已经用于癌症化学疗法。也可以使用这 样的复合物的类似物。其它的药剂包括氮芥类、替莫唑胺和本领域众所周知的交联剂，包括 cis-platinin(Brown et. al, J.Am.Soc. (2012) 132,4676-84)〇
[0023] 所述显像剂可以是本领域众所周知的荧光染料，如荧光黄。
[0024] 所述造影剂可以是钆、氧化铁、锰或其它的顺磁性造影剂。这些造影剂允许复合物 靶向待确诊的癌症的位置。
[0025] 所述表面靶向剂可以能够特异性附着于癌细胞的部分。举例来说，该部分可以是 在癌细胞表面上发现的受体的配体。举例来说，维生素受体，例如叶酸受体，一般在许多癌 症细胞中过表达。因此举例来说，所述细胞表面革G向剂可以是维生素，例如叶酸（Leamonet al，J.DrugTarget. (1999)7:157)。能够使纳米颗粒到祀向特定细胞的优点是其帮助限制 对于正常细胞的毒副作用。举例来说，通过受体介导的胞吞作用可以使连接维生素的分子 内在化。已经显示了对众所周知的叶酸递送的细胞毒性药物的摄取，并且它们具有在临床 前研宄中有前景的效果。所述维生素例如叶酸可以通过，例如，标准固相化学，与肽缀合。
[0026] 本发明的复合物可以与一个或多个药学上可接受的载体或稀释剂组合使用。它可 以用作药物，例如所述药物用于治疗癌症。
[0027] 还提供了一种治疗对象体内癌症的方法，其包括施用药学有效量的本发明的复合 物。
[0028] 所述复合物可以静脉内、肌内、腹膜内或口服施用。可以治疗脑瘤，例如通过颅骨 灌注越过血脑屏障。
[0029] 可以对所述患者另外进行放射治疗。举例来说，当所述复合物包括金属纳米颗粒， 在施用所述复合物之后，所述患者可以用来自电离放射源的的放射疗法来治疗，所述电离 放射源调节到所述金属纳米颗粒的吸收限。如上面所讨论的，这引起纳米颗粒发射次级电 子。
[0030] 举例来说，所述电离辐射源可以是X射线源或同步加速器源。
[0031] 举例来说，本发明通过附着于同一颗粒的DNA损伤剂或通过经由纳米颗