粒的金属 本身的放射，提供DNA损伤的局部增加的组合。这在由DNA损伤剂或者放射所损伤的核的 相同区域内，与局部协同的DNA修复减少相结合。
[0032] 本发明进一步的优点，包括可能克服对于癌症（例如白血病）的化学疗法的耐药 性。当治疗白血病时，许多病人具有耐药性因为癌症细胞阻断细胞摄取途径。相信使用纳 米颗粒可以帮助克服这样的耐药性。
[0033] 现在通过参照下列附图以仅作例子的方式来描述本发明。
[0034] 图1 :靶向vs.非靶向的NP在MRC5正常人成纤维细胞中递送。A和C幅：所述 ESRF纳米成像工作站（station)锌线提供必要的微米结构信息，从其可以根据金（或钼） X射线荧光信号容易地区分细胞核和胞质区（下一张图也一样）。B幅：在暴露于非靶向NP 的细胞中的金线信号。
[0035] D幅：在暴露于通过新的合成肽靶向细胞核的NP的细胞中的金线信号，所述合成 肽由串联配置的金附着结构域、细胞核靶向结构域和DNA修复抑制结构域组成，这些结果 说明只有靶向的纳米颗粒可以到达细胞核。
[0036] 图2 :在人类肿瘤细胞系中靶向的NP的递送。A幅和B:A549肺腺癌细胞，A:锌线 和B:金线。C幅和D:K562人类髓细胞样的白血病悬浮细胞系，C:锌线和D:金线。
[0037]B幅和D显示在暴露于通过新的合成肽靶向到细胞核的NP的细胞中的金线信号的 高存在，所述合成肽由串联配置的金附着结构域、核靶向结构域和DNA修复抑制结构域组 成，这些结果说明只有靶向的纳米颗粒可以到达细胞核，和证明有效负载递送的普遍性和 高效率，所述有效负载递送通过用于纤维母细胞样和类淋巴母细胞肿瘤细胞群的靶向肽构 建体进行。
[0038] 图3 :靶向的NP和放射对人类细胞的协同效应的分析。A幅：MRC5正常人成纤 维细胞的全克隆源性存活分析。B幅：K562人类慢性骨髓白血病细胞的2Gy存活分数 (fraction)分析。
[0039] 非靶向对照组没有观察到细胞杀伤的增强。这些结果证明只有通过新的合成肽 靶向细胞核的纳米颗粒使通过放射的细胞杀伤增强，所述合成肽由串联配置的金附着结构 域、细胞核靶向结构域和DNA修复抑制结构域组成。
[0040] 图4 :在MRC5正常人成纤维细胞中靶向的NP对细胞周期分布的影响的流式细胞 术分析。首行：在未暴露的对照中细胞周期进展的时间过程。底端行：在与细胞存活实验相 同的条件下暴露于靶向的NP的细胞中的细胞周期进展的时间过程。在暴露于通过新的合 成肽靶向细胞核的纳米颗粒的细胞和对照细胞之间，没有观察到细胞周期分布的变化，所 述合成肽由串联配置的金附着结构域、细胞核靶向结构域和DNA修复抑制结构域组成。这 些数据强烈建议在细胞存活实验中观察到的细胞杀伤的增强是一种增加的DNA损伤/降低 DNA修复效果的结果，所述效果由靶向核的纳米颗粒引起。
[0041] 图5 :用5Gy放射24小时后的yH2AX聚焦分析。A幅显示对照MRC5细胞，B幅显 示用靶向的金NP预处理的MRC5细胞。磷酸化组蛋白变体H2AX的增加水平是由DNA损伤 剂（例如电离辐射）引起的DNA双链断裂的增加水平的替代测量。这个结果证明通过新的 合成肽靶向细胞核的纳米颗粒通过增加由放射引起的未修复/不可修复的DNA损伤的比例 增强细胞杀伤，所述合成肽由串联配置的金附着结构域、细胞核靶向结构域，和DNA修复抑 制结构域组成。
[0042] 图6 :在用5Gy放射经过24小时之后的无着丝粒染色体片段（微核）分析。A幅 显示对照MRC5细胞，B幅显示用靶向的金NP预处理的MRC5细胞，其具有清晰可见的4个 微核。C幅对基于每个数据集所计数的100细胞的定量分析进行求和。微核形成是说明不 可修复的DNA双链断裂的水平较高。这个结果进一步证明通过新的合成肽靶向细胞核的纳 米颗粒通过增加由放射引起的没有修复/不可修复的DNA损伤的比例来增强细胞杀伤，所 述合成肽由串联配置的金附着结构域、细胞核靶向结构域和DNA修复抑制结构域组成。
[0043] 图7 :与放射对人类细胞的协同效应相比，靶向的NP的纳米毒性分析。A幅：暴露 于靶向的金和铂NP的K562人类慢性骨髓白血病细胞的克隆源性存活分析。B幅：暴露于靶 向的金和铂NP，以及随后的2Gy电离辐射的K562人类慢性骨髓白血病细胞的2Gy存活分数 分析。这些结果证明在缺少DNA损伤剂时通过新的合成肽靶向细胞核的纳米颗粒本身对于 所靶向的细胞是没有毒性的，所述合成肽由串联配置的金附着结构域、细胞核靶向结构域， 和DNA修复抑制结构域组成。
[0044] 图8 :使用抑制中枢神经系统轴突生长的试验分析靶向的NP的纳米神经毒性。A 幅：在对照的离体培养物中的轴突生长的免疫荧光分析（在所有幅中由绿色FITC标签鉴定 的轴突生长）。B和C幅：暴露于靶向的金（B幅）和铂（C幅）NP的体外神经元培养物。在 临床上对于示于靶向的纳米颗粒最相关的标靶之一是脑瘤，其中所述治疗对于围绕肿瘤组 织的健康神经元组织的毒性通常是主要问题。这些结果证明在缺少DNA损伤剂时通过新的 合成肽靶向细胞核的纳米颗粒本身对于所靶向的神经元没有毒性，所述合成肽由串联配置 的金附着结构域、细胞核靶向结构域和DNA修复抑制结构域组成。
[0045] 图9 :在用30Gy的y-射线放射之后，在用靶向的金和铂纳米颗粒（NP)预处理的 MRC5人类细胞中的DSB修复动力学的脉冲场凝胶电泳（PFGE)分析。A幅：放射的没有NP的 对照细胞的PFGEd幅：放射的用靶向的金NP预处理的MRC5细胞的PFGEX幅：通过PFGE的 DSB再连接的定量分析。与放射后的对照相比，在24小时的修复时间后，在NP处理的细胞 中未修复的DSB的百分比非常显著地增加（对照12. 03±3. 11，靶向的金A137. 06±10. 99， p彡 0? 01，靶向的金A337. 10±11. 53,p彡 0? 01，靶向的铂A124. 13±4. 03,p彡 0? 01，靶向 的铂A321. 83±1. 58,p彡 0? 01)。
[0046] 使用直接测量"断裂DNA"的试验，这些结果证明通过新的由以串联方式配制的金 附着结构域、细胞核靶向结构域和DNA修复抑制结构域组成的合成肽靶向细胞核的纳米颗 粒在暴露于电离辐射后的DSB修复上具有深远的影响，在长时间的修复时间后剩余众多未 修复的断裂。
[0047] 材料和方法
[0048] 纳米颗粒的制备
[0049] 按照已知的方法制备柠檬酸盐包被的13nm金和铂纳米颗粒（分别为13nmAuNP，和 6nmPtNP) [J.Phys.Chem. 90,4765-4767 (1986)，andAnal.Chem. 67, 735-743 (1995)]。然后 用新的三重（tripartite)肽将纳米颗粒功能化[Chem.Commun，47,6431-6433(2011)]。产 生的样品在下面的表格中列出。
【主权项】
1. 一种放疗或化疗增敏复合物，其包含纳米颗粒和附着于所述纳米颗粒的： (i) DNA修复抑制剂；和 (ii) 核定位信号元件（化巧； 任选地，通过一个或多个接头部分附着。
2. 权利要求1的复合物，其中所述DNA修复抑制剂和化S分别附着于所述纳米颗粒，任 选地通过接头部分附着。
3. 权利要求1的复合物，其中DNA修复抑制剂附着于所述纳米颗粒，任选地通过接头部 分附着，并且所述NLS附着于所述DNA修复抑制剂或所述接头部分。
4. 权利要求1的复合物，其中所述化S附着于所述纳米颗粒，任选地通过接头部分附 着，并且所述DNA修复抑制剂附着于所述NLS或所述接头部分。
5. 权利要求1-4中任一项的复合物，其中所述DNA修复抑制剂是双链断裂修复的抑制 剂。
6. 前述权利要求中任一项的复合物，其中所述DNA修复抑制剂是NBS1、Ku70、PARP1、 Hlx或其它DM修复蛋白或其功能性片段和DM磯酸激酶抑制剂或其能抑制DM修复的片 段。
7. 前述权利要求中任一项的复合物，其中所述化S是腺病毒或SV4CMLS，或合成的化S。
8. 前述权利要求中任一项的复合物，其中所述纳米颗粒是金属纳米颗粒。
9. 权利要求8的复合物，其中所述纳米颗粒是金、销、钮或其混合物。
10. 权利要求8或9的复合物，其中所述接头对于所述金属纳米颗粒具有亲和力。
11. 前述权利要求中任一项的复合物，其中所述接头部分选自硫辛酸、金结合肤 1 (GBP1)、3R-GBP1、CAL順肤和谷脱甘肤。
12. 前述权利要求中任一项的复合物，另外包含一或多个部分，所述部分选自化学治疗 剂、DNA交联剂、显像剂、造影剂、表面祀向剂。
13. 权利要求12的复合物，其中所述化学治疗剂是博来霉素、阿霉素或喜树碱。
14. 权利要求12的复合物，其中所述DNA交联剂是cis-platinin。
15. 权利要求12的复合物，其中所述表面祀向剂是维生素。
16. 前述权利要求中任一项的复合物，与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂组 合。
17. 前述权利要求中任一项的复合物，用作药物。
18. 权利要求17的复合物，用于治疗癌症。
19. 一种治疗对象的癌症的方法，其包括施用药学有效量的权利要求1-16的复合物。
20. 权利要求19的方法，其中对所述对象另外进行放射治疗。
21. 权利要求19或20的方法，其中所述复合物包含金属纳米颗粒，在施用所述复合物 之后，W来自电离放射源的放射疗法来治疗所述对象，所述电离放射源调节至所述金属纳 米颗粒的吸收限。
【专利摘要】一种放疗或化疗增敏复合物，其包含纳米颗粒和附着于所述纳米颗粒的：(i)DNA修复抑制剂；和(ii)核定位信号元件(NLS)；任选地，通过一个或多个接头部分附着。
【IPC分类】A61K49-00, C07K14-47, A61K47-48
【公开号】CN104540523
【申请号】CN201380028733
【发明人】B·基塞拉
【申请人】伯明翰大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年5月28日
【公告号】EP2854860A1, US20150119624, WO2013179014A1