一种竹叶异荭草素提取物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物有效成分提取技术，特别涉及一种竹叶异荭草素提取物。
【背景技术】
[0002] 异荭草素（Isoorientin)，亦称异荭草苷，是荭草素的同分异构体，黄色结晶，分子 式：C 21H2tlO11,分子量：448. 38,可溶于甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇等有机溶剂，熔点：230°C? 232°C。现代研宄表明，异荭草素对心肌缺血、缺氧有明显的保护作用。
[0003] 异赶草素常见的提取来源为赶草（寥科植物赶寥（Polygonum orientale L.)的 干燥果穂及带叶茎枝）；我们研宄发现竹叶黄酮中异荭草素含量一般在2%以上，而竹叶黄 酮来源于竹叶，提取原料安全廉价，自然资源可以得到更充分的利用。
【发明内容】
[0004] 本发明的所要解决的技术问题是提供一种竹叶异荭草素提取物，本发明采用负压 提取，通过控制负压提取时的料液比、负压条件和温度条件等，制备得到高纯度的竹叶异荭 草素提取物；并且本发明的竹叶异荭草素提取物中具有诱导嗜酸粒细胞凋亡并且活化MBP 激酶的物质。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：
[0006] 一种竹叶异荭草素提取物，采用包括以下步骤制备得到：
[0007] 步骤（1)、原料处理：将竹叶除杂、洗净；
[0008] 步骤（2)、负压提取：将所述步骤（1)处理的原料放入负压容器中，加入提取溶剂， 在所述负压容器中浸提l-2h后过滤并收集滤液，浓缩，得本发明所述的竹叶异荭草素提取 物；
[0009] 所述负压提取的条件为：负压为-0. 065Mpa?-0. 075Mpa，温度30?35°C;所述原 料和提取溶剂按照1:10?1:15(g/ml)的料液比浸提。
[0010] 优选的技术方案中，所述步骤（1)中，所述原料洗净后，还进行以下处理：将洗净 后的竹叶干燥后粉碎过20-60目筛。
[0011] 优选的技术方案中，所述步骤（2)中，所述提取溶剂为去离子水、或者PH值为 1. 0-3. 0、质量分数为65-85%的乙醇溶液。
[0012] 优选的技术方案中，所述步骤（2)中，所述负压提取的条件为：负压为-0. 065Mpa， 温度35°C ;所述提取溶剂为所述乙醇溶液为PH值为2. 0、质量分数为65%的乙醇溶液；所 述原料和提取溶剂按照1:10(g/ml)的料液比浸提。
[0013] 优选的技术方案中，所述步骤（2)中，所述浓缩的程度为：浓缩至比重10?15,采 用波美计测量。
[0014] 本发明与现有技术相比，具有如下优点：
[0015] (1)本发明采用负压提取，通过控制负压提取时的料液比、负压条件和温度条件等 因素，制备得到高纯度的竹叶异荭草素提取物。本发明制备的竹叶异荭草素提取物中，异荭 草素纯度高达8%?10%。所述纯度是指在竹叶异荭草素提取物中异荭草素的质量含量。
[0016] (2)本发明方法相对于现有技术，提取温度更低，可以低至30°C，可以确保提取过 程中异荭草素活性成分不被破坏。
[0017] (2)本发明竹叶异荭草素提取物在减少嗜酸粒细胞方面显示出较好的效果，即其 可以有效地用于预防和治疗由过多的嗜酸粒细胞而引起的各种疾病。
[0018] (3)本发明竹叶异荭草素提取物可以作为细胞凋亡诱导剂、抗过敏、抗炎和保健食 品。
【具体实施方式】
[0019] 以下通过具体实施例，对本发明作进一步的详细描述。
[0020] 实施例1 :
[0021] 一种竹叶异荭草素提取物，采用以下步骤制备得到：
[0022] 步骤（1)、原料处理：将竹叶除去杂物、洗净；
[0023] 步骤（2)、负压提取：将所述步骤（1)处理的竹叶放入负压容器中，加入PH值为 2. 0、质量分数为65%的乙醇溶液（所述竹叶和乙醇溶液按照1:10(g/ml)的料液比浸提，即 按照Ig竹叶添加 IOml乙醇溶液的比例）；在负压容器中浸提2h后过滤并收集滤液，浓缩 至比重10 (波美计测量），得本发明所述的竹叶异荭草素提取物。所述负压提取的条件为： 负压-0. 065Mpa，温度 35°C。
[0024] 经HPLC测定，最终竹叶异荭草素提取物中，异荭草素的纯度为8. 3%。
[0025] 实施例2 :
[0026] 一种竹叶异荭草素提取物，采用以下步骤制备得到：
[0027] 步骤（1)、原料处理：将竹叶除去杂物、洗净；干燥后粉碎过50目筛，得到竹叶粉；
[0028] 步骤（2)、负压提取：向所述步骤（1)的竹叶粉中加入PH值为2.0、质量分数为 70%的乙醇溶液（所述竹叶粉和乙醇溶液按照1:10 (g/ml)的料液比浸提，即按照Ig竹叶 粉添加 IOml乙醇溶液的比例）；在负压容器中浸提I. 5h后过滤并收集滤液，浓缩，得本发 明所述的竹叶异荭草素提取物。所述负压提取的条件为：负压-〇. 〇65Mpa，温度30°C。
[0029] 经HPLC测定，最终竹叶异荭草素提取物中，异荭草素的纯度为11.8%。
[0030] 实施例3 :
[0031] 一种竹叶异荭草素提取物，采用以下步骤制备得到：
[0032] 步骤（1)、原料处理：将竹叶除去杂物、洗净；
[0033] 步骤（2)、负压提取：向所述步骤（1)的竹叶中加入PH值为2.0、质量分数为 75%的乙醇溶液（所述竹叶和乙醇溶液按照l:12(g/ml)的料液比浸提，即按照Ig竹叶 添加12ml乙醇溶液的比例）；在负压容器中浸提I. 5h后过滤并收集滤液，浓缩浓缩至比 重10 (波美计测量），得本发明所述的竹叶异荭草素提取物。所述负压提取的条件为：负 压-0.075Mpa，温度 30°C。
[0034] 经HPLC测定，最终竹叶异荭草素提取物中，异荭草素的纯度为8. 5%。
[0035] 实施例4 :
[0036] 一种竹叶异荭草素提取物，采用以下步骤制备得到：
[0037] 步骤（1)、原料处理：将竹叶除去杂物、洗净；干燥后粉碎过20目筛，得到竹叶粉；
[0038] 步骤（2)、负压提取：向所述步骤（1)的竹叶粉中加入去离子水（所述竹叶粉和去 离子水按照l:15(g/ml)的料液比浸提，即按照Ig竹叶粉添加15ml去离子水的比例）；在 负压容器中浸提I. 5h后过滤并收集滤液，浓缩，得本发明所述的竹叶异荭草素提取物。所 述负压提取的条件为：负压-〇. 〇65Mpa，温度30°C。
[0039] 经HPLC测定，最终竹叶异荭草素提取物中，异荭草素的纯度为8. 6%。
[0040] 实施例5嗜酸粒细胞性细胞凋亡诱导试验和MBP激酶活性实验
[0041 ] 嗜酸粒细胞性细胞凋亡诱导试验：试验根据Vermes等的方法（Journal of Immunological Methods 184卷39-51页1995年）进行。使嗜酸粒细胞性细胞HL-60细 胞悬浮于RPMI1640培养基中，细胞浓度为1-3 X IO6细胞/ml。向该细胞悬浮液500 μ 1中 添加被检测物质（上述实施例1-4中最后收集得到的竹叶异荭草素提取物）或培养基，使 竹叶异荭草素提取物在细胞悬浮液中的浓度为100 μ g/ml，在37°C、5% CO2的条件下培养6 小时或24小时。离心洗净后，加入磷脂酞结合蛋白（Annexin)V缓冲液，然后添加5ul磷脂 酞结合蛋白V-FITC。通过流动血细胞计数法，以磷脂酞结合蛋白V阳性细胞作为细胞凋亡 诱导细胞，用相对总细胞数的百分比评价。
[0042] MBP激酶活性试验：试验根据De Souza等的方法（Blood 99卷3432-3438页2002 年）进行。将嗜酸粒细胞性细胞HL-60细胞悬浮于RPMI 1640培养基，细胞浓度为1-3 X IO6 细胞/ml。该细胞悬浮液500 μ 1中添加被检测物质或培养基，使浓度为100 μ g/ml，在37°C、 5% CO2的条件下培养6小时或24小时。离心洗净后，添加可溶解缓冲液，溶解细胞，使用含 有MBP 5mg/ml的凝胶进行电泳。凝胶经脱变性、再变性处理后，用32P-ATP标记，实施3小 时的磷酸化反应。凝胶干燥后，使用图象分析仪解析放射活性。在36kDa生长出标记带时， 记做MBP激酶活化阳性（+)。
[0043] 竹叶异荭草素提取物在HL-60细胞中观察到了浓度依赖性的细胞凋亡诱导。另外 进行凝胶MBP激酶分析（In-gel MBP kinase assay)时，竹叶异赶草素提取物激活36kDa MBP激酶。以上结果提示。竹叶异荭草素提取物对嗜酸粒细胞能诱导细胞凋亡，该细胞凋亡 与36kDa MBP激酶有关。由此推断本发明竹叶异荭草素提取物中含有可以用于抗嗜酸粒细 胞性炎症作用药物的成分。
[0044] 所得结果如下表1所示：
[0045] 确认实施例2具有强的细胞凋亡诱导活性，并伴有MBP激酶的活化。
[0046] 表 1
[0047]
【主权项】
1. 一种竹叶异荭草素提取物，其特征在于，采用以下步骤制备得到： 步骤（1)、原料处理：将竹叶除杂、洗净； 步骤（2)、负压提取：将所述步骤（1)处理的原料放入负压容器中，加入提取溶剂，在所 述负压容器中浸提l-2h后过滤并收集滤液，浓缩，得本发明所述的竹叶异荭草素提取物； 所述负压提取的条件为：负压为-〇. 〇65Mpa?-0. 075Mpa，温度30?35°C;所述原料和 提取溶剂按照1:10?1:15(g/ml)的料液比浸提。
2. 如权利要求1所述的一种竹叶异荭草素提取物，其特征在于，所述步骤（1)中，所述 原料除杂后，还进行以下处理：将洗净后的竹叶干燥后粉碎过20-60目筛。
3. 如权利要求1所述的一种竹叶异荭草素提取物，其特征在于，所述步骤（2)中，所述 提取溶剂为去离子水、或者PH值为1. 0-3. 0、质量分数为65-85%的乙醇溶液。
4. 如权利要求1所述的一种竹叶异荭草素提取物，其特征在于，所述步骤（2)中， 所述负压提取的条件为：负压为-〇. 〇65Mpa，温度35°C ; 所述提取溶剂为所述乙醇溶液为PH值为2. 0、质量分数为65%的乙醇溶液； 所述原料和提取溶剂按照1:10(g/ml)的料液比浸提。
【专利摘要】本发明公开了一种竹叶异荭草素提取物，采用以下步骤制备得到：步骤(1)、原料处理：将竹叶除杂、洗净；步骤(2)、负压提取：将所述步骤(1)处理的原料放入负压容器中，加入提取溶剂，在所述负压容器中浸提1-2h后过滤并收集滤液，浓缩，得本发明所述的竹叶异荭草素提取物；所述负压提取的条件为：负压为-0.065Mpa～-0.075Mpa，温度30～35℃；所述原料和提取溶剂按照1:10～1:15(g/ml)的料液比浸提。本发明采用负压提取，通过控制负压提取时的料液比、负压条件和温度条件等因素，制备得到高纯度的竹叶异荭草素提取物。
【IPC分类】A61P37-08, A23L1-30, A61P29-00, A61K127-00, A61K36-899, A61K31-352
【公开号】CN104587274
【申请号】CN201510078417
【发明人】季进军
【申请人】宁波杰顺生物科技有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月13日