备（Shandon， UK)将其包埋在石蜡中。随后将包埋在石蜡中的皮肤活组织用切片刀切成4 μπι厚的切片， 并且转移到载玻片上。用100%的二甲苯从石蜡中移除这些切片，接着在连续醇浴中再水 化：2个100%乙醇浴（EtOH)进行2分钟，1个95%乙醇浴进行2分钟，1个90%乙醇浴进 行2分钟和1个水浴进行5分钟。将载玻片浸没在pH 6的0.0 lM朽1檬酸缓冲液中并且加 热至轻微沸腾，以促进抗体进入所关注的蛋白质。将切片用5% BSA孵育30分钟，然后用 在PBS中稀释至1/500的第一抗体（抗"DEFB1"多克隆兔抗体abl4425 (Abeam，Cambridge， UK))或者用在PBS中稀释至1/100的抗"LL-37"单克隆小鼠抗体sc-166770 (Tebu Santa Cruz，CA，USA)孵育I. 5小时，同时在室温下搅拌。用PBS洗涤几次之后，将这些切片用在 PBS中稀释至1/1000的第二焚光抗体（抗兔抗体Alexa Flour 488 A21206(Invitrogen， Fisher))在室温下孵育1小时。用0.3 μΜ f，6;-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)(分子 探针）标记细胞核。用PBS漂洗该切片5分钟。通过使用荧光显微镜（40 X物镜）检测抗 微生物蛋白DEFBl和抗微生物蛋白LL-37的表达。
[0121] MM.
[0122] 一组结果显示在附图1中。
[0123] 经由免疫组织化学对该切片获得的荧光的评估表明，与未处理的皮肤活组织相 比，用实施例1的亚麻子提取物处理的皮肤活组织具有明显更高的DEFBl的表达水平 (+240% )和 LL-37 的表达水平（+140% )。
[0124] 结论
[0125] 作为用实施例1的亚麻子提取物对人皮肤活组织处理的结果，可以获得对抗微生 物蛋白DEFBl的表达和抗微生物蛋白LL-37的表达的正向效果。
[0126] 实施例5 :证明实施例1的亚麻子提取物对离体皮肤中板层小体的数量和分泌活 件的作用
[0127] 此项研宄的目的是确定实施例1的亚麻子提取物对存在于颗粒层和角质层的界 面的板层小体的数量、抗微生物蛋白存储位点的影响。为了观察板层小体，生成从离体皮肤 切片获得的电子显微镜图像。
[0128] 7f#
[0129] 将人皮肤活组织离体培养，然后通过局部施用20 μ 1 1%的实施例1的亚麻子提 取物进行处理或不进行处理，每天1次，持续24小时。
[0130] 然后在室温下用 Karnovsky 固定缓冲液（Electron Microscopy Sciences， Hatfield，UK)固定该皮肤活组织，持续1小时，接着在4°C下过夜。随后用0.1 M的二甲胂 酸钠缓冲液（Sigma，Steinheim，Germany)洗绦，然后将该活组织后固定（post-fix)在1% 的四氧化锇0s04中1小时，然后漂洗并在连续醇浴中再水化。样品被渗透并且包含在低粘 度的Epon-Epoxy混合物中。
[0131] 用装配有钻石刀片的切片刀生产该切片。然后用乙酸双氧铀和柠檬酸铅将切片染 色。使用60KeV的透射型电子显微镜进行观测。
[0132] MM.
[0133] 电子显微镜图像的观测表明，与未处理的皮肤活组织相比，用实施例1的亚麻子 提取物处理的皮肤活组织在颗粒层和角质层的界面上具有更多数量的板层小体。
[0134] 结论
[0135] 作为用实施例1的亚麻子提取物处理的人的皮肤活组织的结果，可以观测到对板 层小体的数量、抗微生物肽存储位点的正向效果。
[0136] 实施例6 :证明实施例1的亚麻子提取物在角质形成细朐中所产牛的对金昔色葡 萄球菌（Stayhylococcus aureus)的细菌牛长的抗微牛物作用
[0137] 此项研宄的目的是确定由于实施例1的亚麻子提取物1刺激金黄色葡萄球菌的细 菌生长所导致的增加角质形成细胞所产生的抗微生物蛋白合成的作用。为此，进行了径向 扩散试验。
[0138] 7f#
[0139] 用或不用（对照）实施例1的亚麻子提取物处理NHK细胞（正常原代人角质形成 细胞），每天两次，持续24小时。为了产生阴性对照，使用没有与细胞进行过任何接触的NHK 培养基。随后回收细胞上清液，并且使用150 μ 1细胞上清液浸透直径6mm的圆片。然后将 该圆片放置在整体上接种有金黄色葡萄球菌的培养物上（每种条件和培养皿4个圆片）。 48小时后，观测到径向扩散区。使用QImaging Micropublisher 3. 3RTV相机拍摄抑制区域 的照片并且通过Q-capture Pro7?软件程序计算它们的直径。
[0140] MM.
[0141] 结果表明，与未处理的角质形成细胞相比，在施用了用1%的实施例1的亚麻子提 取物处理24小时的角质形成细胞的培养物所产生的上清液之后，细菌生长抑制区域的直 径增加了 19%。
[0142] 结论
[0143] 实施例1的亚麻子提取物能够抑制细菌生长。
[0144] 实施例7 :证明实施例1的亚麻子提取物在角质形成细朐中所产牛的对金昔色葡 萄球菌的细菌牛长的抗微牛物作用
[0145] 此项研宄的目的是确定由于实施例1的亚麻子提取物1刺激金黄色葡萄球菌的细 菌生长而导致的增加角质形成细胞产生的抗微生物蛋白的合成的作用。为此，进行了细菌 生长抑制试验。
[0146] 方案
[0147] 用或不用（对照）实施例1的亚麻子提取物处理NHK细胞（正常原代人角质形 成细胞），每天两次，持续48小时。为了产生阴性对照，使用没有与细胞进行过任何接触 的NHK培养基。随后回收细胞上清液，并且使用200 μ 1细胞上清液并被金黄色葡萄球菌 (S. aureus)溶液污染。将该上清液/金黄色葡萄球菌混合物在37°C下孵育3小时，随后在 TSA琼脂平板中扩散。48小时后，已出现金黄色葡萄球菌的菌落并且是肉眼可见的。使用 Qlmaging Micropublisher 3. 3RTV相机拍摄该平板的照片。
[0148] MM.
[0149] 结果表明，与未处理的角质形成细胞相比，在从用1 %的实施例1的亚麻子提取物 处理24小时后的角质形成细胞的培养物获得上清液的条件下，出现的金黄色葡萄球菌菌 落的数量降低了 79%。
[0150] 结论
[0151] 实施例1的亚麻子提取物能够减少细菌菌落的数量。
[0152] 实施例：组合物的制各
[0153] 保护件舒缓日霜
[0154]
[0156] 制备A相并加热至75°C。通过在搅拌下先后分散卡波普和黄原胶来制备B相。静 止直至获得完全的均质。加热B相至75°C。
[0157] 在75°C下，在转子-定子搅拌下在B相中乳化A相。在快速搅拌下用C相中和。 冷却至40°C，任何加入清澈的D相，然后加入E相（预热至40°C并且均质直至完全澄清）。 在轻微搅拌下持续冷却至25°C，并加入F相。
[0158] 2-身体乳液
[0159]
[0160] 将A相和B相的组分分别在70°C至75°C加热。在搅拌下使A相在B相中乳化。在 45°C，增加搅拌速度下加入C相。随后当温度低于40°C时，加入D相和E相。在剧烈搅拌下 持续冷却至25 °C。
【主权项】
1. 由亚麻子蛋白质水解获得的亚麻子提取物，其在药学上用作治疗由微生物侵袭所导 致的皮肤和皮肤附件的刺激的活性抗微生物剂。2. 根据权利要求1的亚麻子提取物，其特征在于所述亚麻子提取物包含按照干提取物 的重量计至少0. l_5g/l的肽化合物、按照干提取物的重量计0. l_2g/l的糖，并基本上包含 分子量低于5kDa的肽化合物。3. 根据权利要求1或2之一的亚麻子提取物，其用于提高抗微生物肽的表达水平。4. 根据权利要求1至3之一的亚麻子提取物，其用于刺激皮肤的免疫防御。5. 根据权利要求1至4之一的亚麻子提取物，其用于治疗皮肤和皮肤附件的金黄色葡 萄球菌（Staphylococcus aureus)感染。6. 由亚麻子蛋白质水解获得的亚麻子提取物用于增强健康和/或敏感皮肤和皮肤附 件的化学屏障功能的美容用途。7. 根据权利要求6的亚麻子提取物的美容用途，其用于保护皮肤和皮肤附件的共生微 生物菌群和/或限制所述共生微生物菌群的失衡。8. 根据权利要求6至7之一的亚麻子提取物的美容用途，其特征在于所述亚麻子提取 物包含按照干提取物的重量计至少0. l_5g/l的肽化合物、按照干提取物的重量计0. l_2g/ 1的糖，并基本上包含分子量低于5kDa的肽化合物。9. 用于保护共生微生物菌群和/或限制共生微生物菌群的失衡的美容治疗方法，其特 征在于将包含在生理学可接受的介质中的作为活性剂的根据权利要求6至8之一的亚麻子 提取物的组合物局部施用到健康皮肤和/或敏感皮肤上。
【专利摘要】本发明旨在用于化妆品和药学领域，更特别地用于皮肤病学领域。本发明涉及用于保护皮肤及附件免受微生物侵袭的亚麻提取物。本发明还涉及用于提高抗微生物肽的表达率的亚麻提取物。
【IPC分类】A61P31/00, A61K36/55, A61P17/00
【公开号】CN104884074
【申请号】CN201380056038
【发明人】J-M·博托, N·东洛热, F·波尔托兰
【申请人】Isp投资公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年10月25日
【公告号】EP2911680A1, US20150290273, WO2014064397A1