手掌参抗肿瘤提取物及其组合物的医药用途和制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药手掌参抗肿瘤提取物及其组合物 的医药用途和制备方法以及它在制备预防及治疗脑胶质瘤、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺 癌、乳腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 手掌参拉丁名Gymnadeniaconopsea(L. )R.Br?，又称手参、掌参、手儿参、佛手 参，为兰科植物手参或粗脉手参的块根。青藏高原稀有药材，生长在海拔3000-4000米高山 灌木丛中，因为外形像手掌而得名。生于海拔265-4700米的山坡林下、草地或砾石滩草丛 中。干燥块茎形如手掌，指状分裂，通常4~6裂不等，稍扁，长2. 5~3. 5厘米，径2~2. 5 厘米，表面皱缩，淡黄色，有时茎痕周围有1褐色环。
[0003] 手掌参的全草含挥发油6%，内有甲基香醛，向日葵素。块根中含粘液质、淀粉、蛋白 质、糖分、草酸钙、无机盐。性平味甘，止咳平喘；益肾健脾；理气和血；止痛。治肺虚咳喘， 虚劳消瘦，神经衰弱，久泻，失血，带下，乳少，慢性肝炎。手参地下茎的水提取物对兔、犬有 利尿作用，但剂量过大反能降低尿量。对蛙下肢血管呈收缩作用，对小鼠的全身状态则呈 抑制作用。
[0004] 本发明在深入地研宄手掌参的抗癌活性时意外地发现，手掌参除了具有诱导白血 病细胞凋亡的功效外，亦具有很好的脑胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、 胰腺癌等恶性肿瘤的预防及治疗作用，该活性提取物及其组合物有望应用到多种癌症的预 防和治疗上。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题是提供一种手掌参提取物。
[0006] 本发明还提供了以手掌参提取物为主要活性成分的组合物。
[0007] 本发明同时提供了手掌参提取物及其组合物的制备和应用。
[0008] 本发明是通过如下技术方案实现的： 维吾尔药手掌参经水超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（SiO2)柱分离，上样后的硅胶 柱，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱（二氯甲烷-甲醇，比例见表1)，各二氯甲烷-甲 醇比例混合溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外抗肿瘤活性筛选体系测试其抗肿瘤活性， 意外地发现先用二氯甲烷-甲醇混合溶剂(二氯甲烷-甲醇，100:0,体积比)洗脱，继用二氯 甲烷-甲醇混合溶剂(二氯甲烷-甲醇，100:1，体积比)洗脱，洗脱得到的二氯甲烷-甲醇混 合溶剂(二氯甲烷-甲醇，100:1，体积比）洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为抗肿瘤活性提 取物，而其他比例的洗脱组分，不具有抗肿瘤活性。特别地，优选为先用二氯甲烷-甲醇混 合溶剂（二氯甲烷-甲醇，100:1，体积比）洗脱10倍柱体积，继用二氯甲烷-甲醇混合溶剂 (二氯甲烷-甲醇，100:1，体积比）洗脱15倍柱体积，洗脱液干燥后即为本发明抗肿瘤活性 的提取物。抗肿瘤活性的提取物可以通过以上方法得到富集，从而与其他杂质类成分分离 开。该抗肿瘤活性提取物从未见文献报道，其薄层谱色谱（TLC)分析表征如图1，TLC分析 条件：GF254硅胶板，展开系统：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（6:1:1)。显色方法：香草醛浓硫 酸显色。
[0009] 具体，发现过程如下： 1、手掌参经甲醇超声提取物的制备 取维吾尔药手掌参20g，经100ml水超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0215B0. 2076g，二氯甲烷-甲醇系统洗脱。
[0010] 2、二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱方法和结果 取维吾尔药手掌参20g，经100ml水超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0215B0. 2076g。上柱，甲醇溶解，共用甲醇15ml。上硅胶柱色谱，拌样硅胶0. 6g，空白 硅胶5g，玻璃柱内径I. 5cm，二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱(条件见表1)，柱体积11ml，每个 梯度洗脱100ml，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱提取物，TLC分析结果见图2,，图3。图2的TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统： 二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（6:1:1)。显色方法：香草醛浓硫酸显色。图3的TLC分析条件： GF254硅胶板，展开系统：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（1:1:1)。显色方法：香草醛浓硫酸显色。
[0011]
3、抗肿瘤活性筛选方法和结果 1)实验条件a)细胞株信息 大鼠脑胶质瘤细胞株C6购于中国典型培养物保藏中心细胞库。
[0012] b)药品及试剂 样品无菌条件下，DMSO溶解配置成母液浓度为100mg/mL，使用时用RPMI-1640培养 液稀释至所需浓度（DMSO彡1 %。）。
[0013] RPMIMedium1640培养基干粉购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于北京元亨圣马 生物技术研宄所。Trypsin1:250、二甲基二苯基四氮唑溴盐（MTT)。
[0014] c)仪器 CO2培养箱（SANYO,日本） 垂直层流洁净工作台（上海上净净化设备有限公司） 倒置生物显微镜(重庆光电仪器有限公司） 低/高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂） 电子天平(奥豪斯仪器有限公司） 酶标仪(伯乐生命医学产品有限公司） 立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂） 鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂） PH计（SART0RIUS，德国） 2) 实验方法和过程 大鼠脑胶质瘤细胞C6以4000/孔的密度铺于96孔板，每孔IOOul，12h后使用。各 组分以DMSO溶解为lOOmg/mL储存液，保存于-20°C待用。铺板后12h，观察细胞汇合率 约为40%，加药，浓度均为100yg/mL，每个组分3个复孔。每板细胞设立二个对照组（培 养基+细胞；含〇. 1%DMS0培养基+细胞），3个空白孔（只有培养基）。加入药物24小时 后，加入20y1四甲基偶氮唑盐化学名为3-(4, 5-二甲基噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐 (3_ (4, 5-dimethyl_2thiazolyl) _2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide，MTT)，继续培养 4 小时。完全弃去上清液，加入IOOylDMS0,混匀使MTT完全溶解，去气泡。490nm测定OD 值。
[0015] 抑制率（IR) =(A对照一A试验）/(A对照一A空白）X100% 3) 实验结果 表2
结果发现： 本发明最优方案为：维吾尔药手掌参经水超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上 样后的硅胶柱，先用二氯甲烷-甲醇混合溶剂（二氯甲烷-甲醇，100:0,体积比）洗脱，继用 二氯甲烷-甲醇混合溶剂(二氯甲烷-甲醇，100:1，体积比)洗脱，用二氯甲烷-甲醇混合溶 剂(二氯甲烷-甲醇，100:1，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，得到的高活性提 取物，即为该抗肿瘤的提取物。该抗肿瘤活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图 1〇
[0016] 4、抗肿瘤有效提取物的提取方法研宄 1)提取溶剂的种类研宄 分别用甲醇、乙醇、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机 溶剂提取，并测试提取物对MCF7细胞的抗肿瘤活性，结果如下： 表3
研宄结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、乙醇、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混 合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0017] 2)提取溶剂的用量研宄 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取，并测试提取物对MCF7 细胞的的抗肿瘤活性，结果如下： 表4
提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0018] 3)干燥方法的研宄 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抗 肿瘤活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、冷冻干燥法、 鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对MCF7细胞抗肿瘤活性提取物进行干燥，其中，最 优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0019] 表 5
优选地，手掌参抗肿瘤提取物的制备方法为： 维吾尔药手掌参经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先 用二氯甲烷-甲醇混合溶剂（二氯甲烷-甲醇，100:0,体积比）洗脱2-50倍柱体积，继用二 氯甲烷-甲醇混合溶剂（二氯甲烷-甲醇，100:1，体积比）洗脱2-50倍柱体积，用二氯甲 烷-甲醇混合溶剂（二氯甲烷-甲醇，100:1，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥， 得到的高活性提取物，即为该抗肿瘤的提取物。以上条件最优为先用二氯甲烷-甲醇混合 溶剂(二氯甲烷-甲醇，100:0,体积比)洗脱10倍柱体积，继用二氯甲烷-甲醇混合溶剂(二 氯甲烷-甲醇，100:1，体积比）洗脱15倍柱体积。其中， 1)提取物提取用溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、水、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙 醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。提取物提取用溶剂用量为药材重量的2-50倍 (重量/体积比)。
[0020] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0021] 5.手掌参抗肿瘤有效提取物(洗脱液为100 :1时干燥后所得的提取物）的抗肿瘤 活性研宄 利用各种肿瘤细胞，如乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝癌等 恶性肿瘤细胞株，分别测试手掌参抗肿瘤提取物的抗肿瘤活性，IC5tl结果如下： 表6
因此，我们发现，手掌参抗肿瘤提取物具备抗肿瘤活性，可望用于各种肿瘤如脑胶质 瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肝癌等恶性肿瘤细胞株的预防及治疗。
[0022] 6、手掌参抗肿瘤有效提取物的组合物及其制备方法研宄 1)固体分散体 处方 手掌参提取物 20g 聚乙烯吡咯烷酮 80g 固体分散100g制备方法： 称取手掌参提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的质量比分别 放入烧杯中，加入无水乙醇，磁力搅拌器搅拌至手掌参提取物和载体完全溶解，转入旋蒸仪 中除去溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得手掌参提取物PVP包合物。
[0023] 2)环糊精包合物 处方： 手掌参提取物 20g 0 -环糊精 80g 包合物100g制备方法： 将0-环糊精与1-5倍水研匀，加手掌参提取物（水难溶性的应先溶于少量有机溶 剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0024] 3)分散片处方： 手掌参提取物 1〇〇 十>烷基硫酸纳 1 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酮 10 微晶纤维素 10 微分硅胶 0. 3 滑石粉 1 100片 制备方法： 1. 手掌参提取物淀粉分散体的制备，精密称取手掌参提取物，加入适量的十二烷基硫 酸钠，用70%的乙醇溶解加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的温度下蒸干，粉 碎，过100目筛； 2. 称取处方量，手掌参提取物淀粉分散体，交联聚维酮，预胶化淀粉，用70%乙醇做湿 润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min后，60°C烘箱烘干45min， 16目筛整粒，加入