丝蛋白支架材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程技术领域，尤其是涉及一种丝蛋白支架材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]各种创伤、疾病等引起的组织器官的缺损、病变等是影响人类健康的一大问题。目前，临床上常采用器官移植的方法对组织器官的缺损进行治疗。组织、器官移植中供体不足、组织和器官的缺损修复和功能重建等问题，已成为生命科学领域研宄亟需解决的问题。组织工程基本原理是利用三维支架材料模拟体内生理环境，对细胞进行体外培养，然后将细胞-支架材料复合物植入体内替代病变的组织器官，以达到创伤修复和功能重建的目的。
[0003]而构建具有修复大组织和复杂器官的功能性生物材料是急需解决的问题。大组织、复杂器官不像简单的薄层组织可以通过小分子扩散获得营养物质和氧气，它们需要通过庞大的血管系统才能获得营养物质和氧气。微血管系统是由单层内皮细胞组成，营养物质和氧气可通过内皮细胞扩散到组织中。修复损伤的大组织和复杂器官的生物材料必须具有促血管形成的能力才能使大组织和复杂器官具有生物功能。
[0004]现有技术的解决方案主要有两种:一种方法是以材料为基础的，现已开发应用的作为组织工程支架的生物医用材料主要分为两大类:合成生物材料与天然生物材料。硅橡胶、聚氨酯等合成材料在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及缓释性等方面尚有许多不足，部分降解产物有一定的毒性，不利于细胞黏附和识别，作为组织工程支架材料推广使用仍有诸多关键问题需要继续解决。而天然生物材料的机械性能不易控制，但其生物相容性优异，种类繁多，来源广泛，在组织的再生修复领域逐渐获得越来越广泛的应用。另一种方法是以细胞为基础的，体外构建支架再接种上内皮细胞，体外培养再移植入体内前诱导血管化，但这种方法需要生长因子或黏着蛋白或细胞外基质蛋白或细胞共培养，培养时间长，过程繁琐，花费较高，不能量化。
[0005]蚕丝中富含的丝蛋白以其特殊的生物学特性和良好的人体亲和性越来越受到人们的关注。丝蛋白的构象主要分为:无规结构、α -螺旋和β-折叠。而现有技术中盐析法和甲醇等有机溶剂诱导制备的丝蛋白多孔支架存在硬度高，结晶度高，多孔支架孔壁表面结构无法调控的问题，不适用于内皮细胞的增殖及血管形成。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种丝蛋白支架材料的制备方法，本发明提供的丝蛋白支架材料的制备方法制备得到的丝蛋白支架材料生物降解性好、孔隙率高、可以起到促进血管生成的作用。
[0007]本发明提供了一种丝蛋白支架材料的制备方法，包括:
[0008]Α)将丝蛋白溶液浓缩，得到浓缩后溶液，所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%?35% ；
[0009]B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶，所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%?0.6% ；
[0010]C)将步骤A)得到的浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合，得到混合液；调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料；所述pH值为3?4。
[0011]优选的，所述步骤A)浓缩温度为O?90°C。
[0012]优选的，所述步骤A)浓缩时间为I?168h。
[0013]优选的，所述步骤B)热处理温度为50°C?70°C。
[0014]优选的，所述步骤C)混合液中丝蛋白的质量浓度为I %?4%。
[0015]优选的，所述步骤C)调节pH值为用酸调节pH值，所述酸选自盐酸、和甲酸中的一种。
[0016]优选的，所述步骤C)搅拌时间为I?lOmin。
[0017]优选的，所述步骤C)冷冻温度为_10°C?_80°C，冷冻时间为I?48h，真空干燥时间为I?96h。
[0018]优选的，所述步骤C)后还包括将得到的支架材料浸泡、冷冻、干燥得到干态丝蛋白支架材料。
[0019]本发明提供了一种丝蛋白支架材料，由上述权利要求任意一项所述的制备方法制备得到。
[0020]与现有技术相比，本发明提供了一种丝蛋白支架材料的制备方法，包括:
[0021]A)将丝蛋白溶液浓缩，得到浓缩后溶液，所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%?35% ;B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶，所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%?0.6% ;C)将步骤A)得到的浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合，得到混合液；调节混合液PH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料；所述pH值为3?4。本发明通过特定质量浓度的丝蛋白浓缩后的溶液和特定质量浓度的水凝胶混合，利用丝蛋白的自组装行为改变丝蛋白的二级结构，使得本发明孔隙率高；本发明选用丝蛋白溶液，生物降解性好；并且本发明通过调节pH值，改变丝蛋白分子带电荷情况，破坏疏水作用力，使得本发明制备得到的丝蛋白支架材料力学性能低，结晶度低，更适合血管的生成。实验结果表明，
【附图说明】
[0022]图1中(a)和(b)为本发明实施例1制备得到的支架材料进行扫描电镜图；(c)为本发明比较例I制备得到的支架材料进行扫描电镜图；(d)为本发明比较例2制备得到的支架材料进行扫描电镜图；
[0023]图2为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的红外测试图；
[0024]图3为本发明实施例1和比较例制备得到的支架材料的X-射线衍射检测图；
[0025]图4为本实施例和比较例制备得到的支架进行压缩性能测定图；
[0026]图5为本实施例和比较例制备得到的支架进行酶降解处理测定图；
[0027]图6中a为本发明实施例1制备得到的支架材料动物皮下埋置第28天时的HE染色切片图山为本发明实施例1制备得到的支架材料动物皮下埋置第28天时CD34免疫组化切片图；
[0028]图7为本发明实施例3所述所得丝蛋白支架的电镜图。
【具体实施方式】
[0029]本发明提供了一种丝蛋白支架材料的制备方法，包括:
[0030]A)将丝蛋白溶液浓缩，得到浓缩后溶液，所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%?35% ；
[0031]B)将步骤A)得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶，所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%?0.6% ；
[0032]C)将步骤A)得到的浓缩后溶液和步骤B)得到的水凝胶混合，得到混合液；调节混合液pH值、搅拌、冷冻、干燥、得到支架材料；所述pH值为3?4。
[0033]本发明所述丝蛋白溶液为常规方法制备得到的丝蛋白溶液，优选的，所述制备方法具体为:
[0034]a)将蚕丝在碳酸钠溶液中加热脱胶、水洗、烘干得到脱胶蚕丝；
[0035]b)将所述脱胶蚕丝溶解于溶剂中热处理、透析得到丝蛋白溶液。
[0036]所述碳酸钠溶液的质量浓度优选为0.2 %?0.5 % ;所述步骤a)加热温度为90?110°C，所述加热时间为30?60min。
[0037]所述步骤a)水洗优选为去离子水洗，所述水洗的次数优选为2?5次，更优选为3次；所述烘干的温度优选为50?100°C，更优选为60?90°C ；
[0038]所述步骤b)溶剂选自由乙醇、氯化钙和水以摩尔比2:1:8的比例混合构成的三元溶液或溴化锂溶液中的一种；所述溶剂的质量浓度优选为9.3?9.5mol/L ;所述步骤b)热处理温度为60?70°C，热处理时间为4?8h ;所述透析袋的截留分子量优选为3000?12000 ;更优选为3500?10000 ;所述透析的时间优选为3d?4d ;所述透析时可以换水，所述换水的间隔优选为I?3h ;更优选为2h。最终得到的丝蛋白溶液的质量浓度优选为5%?10%，更优选为6%?8%。
[0039]本发明首先将上述丝蛋白溶液浓缩，得到浓缩后溶液，所述浓缩后溶液中丝蛋白的质量浓度为15%?35%。本发明对于所述浓缩方式不进行限定，本领域技术人员熟知的浓缩方式即可。所述浓缩后中丝蛋白的质量浓度优选为20%?30%;所述浓缩温度优选为O?90°C，更优选为30?80°C，最优选为40?70°C，最最优选为50?60°C ;所述浓缩时间优选为I?168h，更优选为40?150h，最优选为48h?130h ;最最优选为48h?120h.
[0040]将步骤A得到的浓缩后溶液稀释、热处理得到水凝胶，所述水凝胶中丝蛋白的质量浓度为0.2%?0.6%。本发明对于所述稀释方式不进行限定，加水稀释即可；稀释后热处理得到水凝胶，所述热处理的温度优选为50°C?70°C，更优选为60V?70°C ;所述热处理时间优选为24?48h ;所述稀释后质量浓度优选为0.3%?0.5%。