松花粉总皂苷的提取工艺及测定方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及松花粉提取技术领域，具体地讲是松花粉总皂苷的提取工艺及测定方法。
[0002]【背景技术】:
松花粉又称松黄、松花，松花粉营养物质丰富，并且含有多种功能性物质，现代的一些药理试验已经证明松花粉具有抗疲劳、提高免疫力、抗衰老、抗肿瘤、抗氧化等活性，具有很高的保健价值。在国内外已被广泛地应用于保健品、药品、化妆品和饲料添加剂等领域。
[0003]松花粉自古就是食疗中的珍品，因为它包含了多种营养物质、生物活性物质。松花粉对人体具有很好的调解、修复的作用，对神经系统、消化系统、循环系统、内分泌系统、生殖系统和免疫系统具有非常好的调整功能，有很高的保健价值，。
[0004]目前对于松花粉的生理功能的研宄主要有以下几个方面:抗疲劳、提高免疫力、抗衰老、降血糖、护肝、通便、抗氧化等作用。
[0005]松花粉营养物质、活性物质含量丰富，目前有关松花粉化学成分的研宄，主要集中在多肽、多糖、黄酮等，而关于松花粉皂苷的研宄，尤其是作为保健食品原料的松花粉中皂苷的含量以及主要皂苷成分及其结构的研宄尚未开展。研宄表明，皂苷作为重要的生物活性物质，具有广泛的药理作用和生理生化作用，如抗癌活性，抗氧化活性，改善心脑血管供血不足，增加机体免疫力，抗菌消炎、抗病毒的作用，调节机体的代谢作用等。皂苷生理功能，具有抗癌活性、抗氧化活性、抗血脂、抗糖尿病及对中枢神经系统有“神经营养因子样”的作用。因此皂苷是非常重要的功能性因子在保健品中起着极其重要的作用。研宄松花粉皂苷对于进一步深化和了解松花粉的生理生化和保健功能具有重要的意义。
[0006]目前皂苷的分离方法，主要有水提法、有机溶剂(非极性)提取法、乙醇提取法、微波提取法、超临界萃取法。水提法具有成本低、简单安全的特点，但提取效率比较低；有机溶剂提取法虽然其提取效果有一定优势，但提取物质太杂，难于获得纯皂苷；利用乙醇与水特殊互溶性，采用加热法进行提取，虽因需要加热相对于水提取和有机溶剂提取对设备要求高一些，但时间相对缩短，提取率及效果较好，后处理相对容易，其设备的工业化应用程度较高，可操作性强，应用前景看好；微波提取法和超临界萃取法优点是萃取能力强，提取率高，生产周期短，有效成分不被破坏，没有溶剂残留，产品质量稳定等，但是实际应用中，特别是工业化生产中由于设备制造技术和成本的局限性，工业化受到很大局限性，提取效果达不到预期，至今没有在工业生产中得到规模化的应用。
[0007]
【发明内容】
:
本发明的目的是克服上述已有技术的不足，而提供一种松花粉总皂苷的提取工艺。
[0008]本发明的另一目的提供提取松花粉总皂苷的测定方法，
本发明主要解决现有的松花粉皂苷未展开研宄的问题。
[0009]本发明的技术方案是:松花粉总皂苷的提取工艺，其特殊之处在于，包括如下工艺步骤:
a脱脂，取经破壁的干燥松花粉，按松花粉质量和石油醚体积1:10的固液比脱脂2次，每次2-3h，脱脂后的松花粉烘干得脱脂松花粉； 提取，脱脂松花粉用60%乙醇提取，脱脂松花粉质量和乙醇体积的料液比为1:20-25，温度70°C，提取120-150min，重复提取两次；
b提取液分别抽滤后，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇，至无醇味；
c浓缩物用蒸馏水溶解后，将溶解液转移到分液漏斗中，用正丁醇反复萃取至无色，溶解液与正丁醇的体积比为1:10-30，合并正丁醇，减压浓缩，回收正丁醇，冷冻干燥，得松花粉总皂苷产品。
[0010]本发明的松花粉总皂苷的测定方法，其特殊之处在于，包括如下工艺步骤:
1)精确称取脱脂松花粉1.0OOg，采用权利要求1的总皂苷提取工艺获得冻干后的松花粉总皂苷产品，将得到的松花粉总皂苷产品用甲醇溶解，转移到25 mL容量瓶中，甲醇定容得样品溶液；
2)对照品溶液的制备:准确称取干燥的人参皂苷Re标准品6mg,以甲醇为溶剂，准确定容到5 mL，摇匀得到人参皂苷Re标准品的储备液；再精确移取储备液2 mL定容至10 mL,甲醇定容摇匀，得到浓度为0.24 mg/mL的人参皂苷Re对照品标准溶液；
3)检测波长的选择:人参皂苷Re对照品标准溶液和样品溶液在400nm-600 nm范围内进行波长扫描，人参皂苷Re对照品标准溶液和样品溶液显色后的吸收光谱基本一致，在560nm处有最大吸收，选取人身皂苷Re为对照品，选用560nm为最大吸收波长；
4)标准曲线的制备:分别精确量取人参皂苷Re对照品标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，水浴蒸干，分别加入5%香草醛醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，60°C水浴加热15 min，冰水冷却10 min，加冰醋酸5 mL，摇勾，随行试剂做空白项，然后用分光光度计在560nm波长处测吸光度值，以体积为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；得回归线方程y = 0.8878x-0.0102，R2 = 0.9998 ；
5)稳定性试验:精确量取样品溶液0.3 mL，每隔10 min中测量一次吸光度值，计算RSD值为0.73% ；
6)重复性试验:精确称取脱脂松花粉6份，每份1.000 g，用权利要求1的总皂苷提取工艺获得冻干后的松花粉总皂苷产品，将得到的松花粉总皂苷产品用甲醇溶解，转移到25mL容量瓶中，甲醇定容得样品溶液；然后进行吸光度的测定，计算RSD值为0.89% ；
7)精密度试验:精确量取0.3 mL人参皂苷Re对照品标准溶液，按照标准曲线项下的方法测量吸光度；计算RSD值为0.58% ；
8)加样回收率试验:分别称取样品溶液，加入人参皂苷Re对照品标准溶液，按照标准曲线制备下的方法进行测量吸光度和浓度，计算加样回收率为95%，RSD值为1.6% ；
9)样品的测定:吸取0.3 mL样品溶液，加入试管中，蒸干溶剂，用标准曲线制备的方法进行测量；测量吸光度，依据人参皂苷Re标准曲线方程，计算松花粉中总皂苷含量，计算提取率。
[0011]本发明所述的一种松花粉总皂苷的提取工艺及测定方法与已有技术相比具有突出的实质性特点和显著进步，1、采用乙醇提取的方法提取松花粉总皂苷，总皂苷的提取率高，原料利用率高，后处理简便，且含有乙醇的提取液不容易发生霉变，提取液乙醇易于回收，重复使用，从而降低成本，减少排放，松花粉总皂苷提取率高达原料重量的0.93% ;2、采用正丁醇萃取松花粉皂苷，萃取效果理想，即不仅将总皂苷全部萃取，且很好的除去了杂质。有利于后续进一步分离纯化；3、测定松花粉总皂苷含量的测定方法简单易操作，精确度高，数据可靠、重复性好。
[0012]【具体实施方式】:
为了更好地理解与实施，下面结合实施例详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的保护范围。
[0013]采用烟台新时代健康产业有限公司提供的破壁松花粉，上海融禾医药科技有限公司提供的人参皂苷Re标准品(131204)。
[0014]实施例1，松花粉总皂苷提取工艺如下:准确称量50.0Og破壁的干燥松花粉，按松花粉质量和石油醚体积I: 10的固液比脱脂2次，每次2.5h,脱脂后的松花粉烘干得脱脂松花粉；脱脂松花粉，用60%乙醇、料液比(固液比)按1:22.5、温度70°C加热提取135min，反复提取两次；分别抽滤后，合并滤液，减压浓缩到无醇味(回收乙醇)，用蒸馏水溶解，将溶解液转移到分液漏斗中，用正丁醇反复萃取至无色，溶解液与正丁醇体的积比为1:25，合并正丁醇，减压浓缩至干(回收正丁醇)，冷冻干燥，得松花粉总皂苷产品。
[0015]实施例2，松花粉总皂苷提取工艺如下:准确称量50