异叶青兰活性精细组分的分离方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及民族医药技术领域，尤其涉及异叶青兰活性精细组分的分离方法及其 应用。
【背景技术】
[0002] 异叶青兰Benth.)是国家部颁标准藏药收录的 品种，藏药名为吉孜青保，为唇形科青兰属草本植物，分布于青海、甘肃、西藏等地，以全草 入药，主要用于治疗黄疽性发烧、肝热、热性病头痛、口腔溃疡、支气管炎、高血压等多种病 症，是藏族的传统用药。
[0003] 肝炎作为一种传染性强、传播途径复杂的疾病，其发病率逐年上升。根据流行病学 调查，我国是病毒性肝炎的高流行区，约有1.2亿人感染乙肝病毒，7~9亿人感染过甲肝病 毒，3800万人感染丙肝病毒。据世界卫生组织报告，全世界原发性肝癌中大约80%都与HBV 慢性感染相关。中国是肝癌高发区，也是全球乙肝和肝癌负担最沉重的国家，每年用于乙肝 治疗的费用达1000亿以上，每年近30万人死于肝硬化、肝癌等肝脏相关疾病。
[0004] 现代研宄表明，异叶青兰含有挥发油、黄酮、多糖、帖类、木脂素等成分，具有抗肿 瘤、抗氧化、抗病毒、降血压、抑菌抗炎及免疫抑制等活性。至今尚无有关异叶青兰中抗肝炎 及对肝损伤有疗效的活性组分的研宄报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、有效成分质量稳定、易规模化 生产的异叶青兰活性精细组分的分离方法。
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供该活性精细组分的应用。
[0007] 为解决上述问题，本发明所述的异叶青兰活性精细组分的分离方法，包括以下步 骤： ⑴提取： 将异叶青兰全草阴干、粉碎后，用其质量8~20倍体积浓度为95%的乙醇溶液浸泡10~15 个小时，在80~90°C温度下加热回流提取2~4次，每次3小时，经减压干燥得异叶青兰醇提 物； ⑵硅胶柱层析分离： 将所述异叶青兰醇提物经硅胶柱色谱分离，用1〇~20倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混 合溶剂洗脱，按每份1〇〇~200 mL收集馏分，采用薄层色谱检测，其中展开剂为石油醚、乙酸 乙酯按1 :1的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液，合 并收集Rf值为〇. 1~〇. 6的馏分，该馏分经减压干燥，即得呈黄褐色粉末状的异叶青兰粗组 分； ⑶微孔树脂除杂： 将所述异叶青兰粗组分用其质量5~10倍的体积分数为90~100%的甲醇溶液溶解，过滤 得到滤液，该滤液上微孔树脂柱分离，用3~5倍柱体积且体积分数为90°/『100%的甲醇溶液 洗脱，收集90°/『100%的甲醇溶液洗脱物，该90°/『100%的甲醇溶液洗脱物经减压干燥，即得 呈黄色的异叶青兰精细组分；所述异叶青兰粗组分与所述微孔树脂比例为I g:30 mL。
[0008] 所述减压干燥条件是指真空度为0. 06~0. 09 MPa，温度为50~60°C。
[0009] 所述步骤⑵中石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂是指石油醚和乙酸乙酯按7 :3~3 :7 的体积比混合而成。
[0010] 所述步骤⑶中微孔树脂是指HP20SS型树脂柱、MCI型树脂柱、HP20型树脂柱中的 任意一种。
[0011] 如上所述的异叶青兰活性精细组分的分离方法制得的异叶青兰精细组分在肝病 治疗中的应用，其特征在于：该异叶青兰活性精细组分作为有效组分按常规方法与药学上 可接受的任何载体制成各类抗病毒性肝炎、急性重型肝炎、肝功能衰竭、自身免疫性肝炎、 药物性肝损伤和肝硬化的药用制剂。
[0012] 本发明与现有技术相比具有以下优点： 1、本发明原材料分布广泛，资源量丰富，易于批量备料。
[0013] 2、本发明用95%乙醇作为提取溶剂，能有效提取目标组分，同时保证糖类、鞣质等 生物大分子不被提取出来，溶剂价格低廉，操作过程简单，易于规模化。
[0014] 3、本发明采用硅胶柱层析分离，可直接将异叶青兰中弱极性类组分与挥发性成分 分开，同时去除部分强极性杂质。
[0015] 4、本发明采用微孔树脂除杂，可有效去除样品中的色素，且树脂柱可以再生循环 使用，平均价格低廉。
[0016] 5、本发明工艺简单、重复性好、质量稳定可控，所得到的异叶青兰活性精细组分经 测试，具有很好的抗肝炎和肝损伤治疗作用。
[0017] ⑴通过使用刀豆蛋白酶引起肝脏免疫系统对肝脏自身过度免疫反应，造成肝脏组 织损伤，来模拟病毒性肝炎中病毒引起的自身免疫失调造成的肝细胞坏死病理。在该病理 模型中，对异叶青兰中活性精细组分的药物功能进行研宄，通过检测对照组及异叶青兰中 活性精细组分药物组balb/ c小鼠转氨酶活性值变化判定该精细组分的药物效应，体内实 验分组如表1 : 表1
⑵通过联合注射多聚胞苷（Poly I :c)与D型半乳糖氨（D-GalN)，诱导小鼠肝组织大面 积坏死，引起严重的炎症，来模拟病毒肝炎引发的急性肝炎。在该病理模型中，对异叶青兰 中活性精细组分的药物功能进行研宄，通过检测对照组及异叶青兰中活性精细组分药物组 balb/c小鼠转氨酶活性值变化判定该精细组分的药物效应，体内实验分组如表2 : 表2
⑶结论：异叶青兰中活性精细组分药物组对机体自身性免疫反应引起的肝损伤有显 著的治疗作用，对病毒性肝炎引发的急性肝炎有明显的抑制作用。具体见附图1和图2。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0019] 图1为本发明异叶青兰活性精细组分的抗病毒性肝炎中病毒引起的自身免疫失 调造成的肝细胞坏死病理活性筛选结果。
[0020] 图2为本发明异叶青兰活性精细组分的抗病毒肝炎引发的急性肝炎的活性筛选 结果。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1 异叶青兰活性精细组分的分离方法，包括以下步骤： ⑴提取： 将I. 0 Kg异叶青兰全草阴干、粉碎后，用其质量10倍体积浓度为95%的乙醇溶液浸泡 10个小时，在90°C温度下加热回流提取3次，每次3小时，经减压干燥得异叶青兰醇提物 198. 4 g〇
[0022] 其中：减压干燥条件是指真空度为0. 06 MPa，温度为60°C。
[0023] ⑵硅胶柱层析分离： 将异叶青兰醇提物经硅胶柱色谱分离，用10倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂 洗脱，按每份100 mL收集馏分，采用薄层色谱检测，其中展开剂为石油醚、乙酸乙酯按I : 1 的体积比（mL/ mL)混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液，合并 收集Rf值为〇. 1~〇. 6的馏分，该馏分经减压干燥，即得呈黄褐色粉末状的异叶青兰粗组分 116. 3 g〇
[0024] 其中：石油醚-乙酸乙酯的混合溶剂是指石油醚和乙酸乙酯按5 :5的体积比（mL/ mL)混合而成。
[0025] 减压干燥条件是指真空度为0. 06 MPa，温度为60°C。
[0026] ⑶微孔树脂除杂： 将异叶青兰粗组分用其质量5倍的体积分数为100%的甲醇溶液溶解，过滤得到滤液， 该滤液上微孔树脂柱分离，用3倍柱体积且体积分数为100%的甲醇溶液洗脱，收集100%的 甲醇溶液洗脱物，该100%的甲醇溶液洗脱物经减压干燥，即得呈黄色的异叶青兰精细组分 98. 4 g〇
[0027] 其中：微孔树脂是指HP20SS型树脂柱。