一种用于治疗肝癌的药物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药生物技术领域，特别涉及一种用于治疗肝癌的药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]原发性肝癌，俗称肝癌，是世界上第五大常见的恶性肿瘤，其死亡率高居第三位。据美国癌症学会报道，在2012年，美国大约有28720例新发肝癌病例和20550例肝癌死亡病例。尽管近年来全世界在肝癌治疗领域取得了巨大的发展，但是由于耐药性和肝癌易转移等问题的存在，使得目前仍然缺乏一种行之有效的方法来治疗这类疾病，因此迫切需要发展一种全新的且能够有效杀死肝癌细胞的药物。近年来，植物药由于具有来源广泛、毒性低且生物活性高等优点，因而被认为是抗癌药物的主要天然来源。
[0003]姜黄，是姜科姜黄属多年生草本植物，同时也是一种常用的药食两用的植物。姜黄中含有大量的化学植物物质(phytochemicals)，包括姜黄素(curcumin)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)、双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin)、姜稀(zingiberene)、姜黄酸(curcumenol)、姜黄醇(curcumol)、丁香酸(eugenol)、四氢姜黄素(tetrahydrocurcumin)、三乙基姜黄素(triethylcurcumin)、姜黄酉同(turmerones)等。其中，姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素在姜黄中的含量最高，分别达到了 77%、17%和3%，构成了姜黄素类化合物的三种主要成分。姜黄素类化合物除了在姜黄(Curcumalonga L.)中存在外，还主要分布在莪术(Curcuma zedoaria)、郁金(Curcuma aromatica)、闭革肖姜(Costus spec1sus)、黄红姜黄(Curcuma xanthorrhiza)、火炬姜(Etlingeraelat1r)和卡萨蒙纳姜(Zingiber cassumunar)等姜黄属植物的根和莖中。现代研究表明，姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素这三种姜黄素类化合物具有相似的生物活性和物理性质。药理研究发现，姜黄素类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性。然而其水溶性低、血药浓度低、生物利用度低等问题导致其抗肿瘤活性低，严重限制了其在抗肿瘤领域的应用。
【发明内容】
[0004]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于治疗肝癌的药物。
[0005]本发明的另一目的在于提供所述用于治疗肝癌的药物的制备方法。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种用于治疗肝癌的药物，由活性组分组成或是由活性成分和载体组成；其中，活性成分为姜黄素类化合物与右旋龙脑。
[0007]所述的姜黄素类化合物为姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素中的至少一种。
[0008]所述的右旋龙脑的英文名为natural borneol，分子式:C1QH170H，分子量为154.24，对人体无明显的毒副作用。
[0009]所述的右旋龙脑和所述的姜黄素类化合物按质量摩尔比2?8 μ g:2?Snmol配比。
[0010]优选地，所述的右旋龙脑和所述的姜黄素按质量摩尔比I μ g =Inmol配比；所述的右旋龙脑和所述的去甲氧基姜黄素按质量摩尔比I yg:2nmol配比；所述的右旋龙脑和所述的双去甲氧基姜黄素按质量摩尔比I yg:2nmol配比。
[0011]所述的载体是用于将所述的用于治疗肝癌的药物制备成不同剂型的药物辅料。
[0012]所述的用于治疗肝癌的药物的剂型包括缓释片剂、颗粒剂和凝胶剂。
[0013]所述的用于治疗肝癌的药物的制备方法，包括如下步骤:按剂型不同，将右旋龙脑、姜黄素类化合物与载体混合，按不同剂型的制备方法制备得到；对于剂型为缓释片剂时，制备原则是先释放右旋龙脑，再释放姜黄素类化合物，更为有利于姜黄素类化合物的吸收和利用。
[0014]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:通过研究发现，本发明提供的药物作用肝癌细胞H印G2后能有效的诱导细胞发生G2/M细胞周期阻滞导致细胞凋亡以及通过诱导细胞内活性氧ROS的过量产生导致细胞凋亡。因此，本发明提供的药物能有效的治疗肝癌，且右旋龙脑和姜黄素联合用药对人体正常细胞毒性低，基本无明显影响。
【附图说明】
[0015]图1是右旋龙脑与姜黄素的不同处理方式对HepG2细胞存活率的影响结果图；不同字母表示统计学上有显著性差异(P〈0.05)，相同字母表示统计学上没有显著性差异。
[0016]图2是右旋龙脑与姜黄素的不同处理方式对!fepG2细胞周期的影响结果图。
[0017]图3右旋龙脑与姜黄素的不同处理方式对HepG2细胞内ROS变化的影响结果图。
[0018]图4是右旋龙脑与去甲氧基姜黄素的不同处理方式对H印G2细胞存活率的影响结果图；不同字母表示统计学上有显著性差异(P〈0.05)，相同字母表示统计学上没有显著性差异。
[0019]图5是右旋龙脑与去甲氧基姜黄素的不同处理方式对H印G2细胞周期的影响结果图。
[0020]图6是右旋龙脑与去甲氧基姜黄素的不同处理方式对IfepG2细胞内ROS变化的影响结果图。
[0021]图7是右旋龙脑与双去甲氧基姜黄素的不同处理方式对H印G2细胞存活率的影响结果图；不同字母表示统计学上有显著性差异(P〈0.05)，相同字母表示统计学上没有显著性差异。
[0022]图8是右旋龙脑与双去甲氧基姜黄素的不同处理方式对H印G2细胞周期的影响结果图。
[0023]图9是右旋龙脑与双去甲氧基姜黄素的不同处理方式对IfepG2细胞内ROS变化的影响结果图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0025]实施例1右旋龙脑联合姜黄素对IfepG2细胞的影响
[0026]—、体外细胞存活率检测
[0027](I)实验材料
[0028]本实验中所用的肝癌细胞H印G2购自于美国模式培养物集存库(ATCC，Manassas, VA);姜黄素(Cur)，购于Sigma公司；右旋龙脑(NB)，购于中国药品与生物制品检定所；四甲基偶氮唑蓝(MTT)粉末及二甲基亚砜(DMSO)，购于美国Sigma公司；DMEM培养液及胰酶，购于美国Invitrogen(Carlsbad, CA)公司。
[0029](2)实验方法
[0030]取对数生长期的H印G2细胞进行细胞传代，调整细胞密度，以2X 104cellS/ml接种于96孔培养板中，每孔100 μ I ;24h后，对细胞进行不同方式处理，对照组为不添加姜黄素和/或右旋龙脑处理，实验组如下:一组加入100 μ I浓度分别为20、40、80 μΜ的姜黄素处理24小时，一组加入100 μ I浓度分别为20、40、80 μ g/ml的NB处理24小时，第三组先用50 μ I浓度分别为20、40、80 μ g/ml的NB处理12小时后再加入50 μ I浓度分别为20、40、80 μ M的姜黄素继续处理24小时；24h后，每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ I，放入培养箱中继续培养4h。4h后小心吸去孔内的上清液。之后每孔加入150 μ I DMSO溶解难溶性甲瓒，震荡10min，570nm测吸光值。计算细胞存活率，细胞存活率=(0D实验-OD空自)/咖对照-OD空白)X 100%。每实验重复二次。
[0031](3)实验结果
[0032]如图1 (图1中的浓度表示不同处理组中NB和/或Cur在细胞中的终浓度；柱形图上的a、b、c、d分别表示两组之间对比统计学上显著性分析)所示，当先加入20 μ g/mlNB处理12h再加20 μ M Cur处理24h之后对肝癌细胞毒性最大。当姜黄素(Cur)浓度为20 μ M时，IfepG2细胞存活率为91.87%，然而当先加入20 μ g/ml NB处理12h再加20 μ MCur处理24h之后，其细胞存活率从91.87 %下降到54.25 %，下降了 37.62 %。表明，添加NB之后，能显著提高姜黄素对HepG2细胞的细胞毒性。
[0033]二、流式细胞分析
[0034](I)实验材料
[0035]PI 染料
[0036](2)实验方法
[0037]取对数生长期的H印G2细胞，经胰酶(常规操作，工作液浓度为0.25%，下同)消化，计数，以2X 14个细胞/孔接种于6孔板，置于培养箱中(37°C，5% CO2)培养24h，接着分别加入 20 μ g/ml NB 100μ1、20μΜ Cur 100 μ I 和 50 μ 120 μ g/ml ΝΒ+50 μ I 20 μMCur (NB先处理12h，再加入Cur处理24h)处理24h，再抽去培养基，加入ImL PBS (0.01M、PH7.2，下同)清洗细胞3遍除去细胞外的右旋龙脑和姜黄素，然后加入胰酶消化，1500rpm离心5min，收集细胞，加入_20°C预冷的70%乙醇lmL，混勾，4°C过夜固定，次日，1500rpm离心5min，去上清，用PBS洗2遍，加500 μ I 50 μ g/ml PI染液，混匀后避光静置20min后，过300目筛，上机检测。每个样品至少分析10000个细胞。每次实验重复三次。
[0038](3)结果与分析
[0039]如图2所示，相比对照组(不用NB和/或Cur处理)而言，NB组内并没有出现明显的凋亡细胞峰，其SubG-1仅为0.6%，且G2/M期细胞数目为11.7% ；Cur组处理后凋亡细胞峰为1.8%，且62肩期细胞数目为31.3%，相比Cur组，NB+Cur组中的细胞凋亡峰并没有显著提高，仅为4.1 %，而G2/M期细胞从31.3%提高到44.6%，表明加入NB后，能显著提高Cur诱导细胞内的G2/M期细胞阻滞，而SubGl峰的数目并没有显著增加，表明NB和Cur并不是通过诱导细胞凋亡来抑制细胞增殖。
[0040]三、ROS活性检测
[0041](I)实验材料
[0042]DHE荧光探针
[0043](2)实验方法
[0044]收集生长状态良好的对数期HepG2细胞，用PBS洗2次，离心去上清，加无血清培养基重悬，计数，调整细胞密度为10X104cells/ml，然后加入一定量的DHE使之终浓度为10μM，于37°C培养箱孵育 30min，每隔5min摇晃一次，到达时间后，取出细胞离心，倒掉上清液，加等量的PBS重悬，用PBS配制不同浓度的NB、Cur和NB+Cur (该组先用50 μ I NB处理，再用50 μ I Cur处理，总体积为100 μ I)，以每孔100