[0238]
[0239] 淘汰政策
[0240] 在动物期完成之前不自研究淘汰动物。
[0241] 识别测试动物
[0242] 由与处理组无关之双重耳标识别所有测试动物。
[0243] 动物管理及圈养
[0244] 将动物根据其标准操作程序圈养于VeterinaryResources,Inc?之设施中。
[0245] 动物看护
[0246] 在研究开始前，认为动物处于良好健康及营养状态。研究者在随机化程序之前进 行健康检查。
[0247] 由于CD/CD动物易受影响，因此所有仔猪在接种前六天（D-6)根据标签说明接受 一剂量之PfizerEXCEDE?。另外，在D-6 至D0 对仔猪喂饲PURINA?MillsSenior 加药饲料。自D1至研究结束，仔猪接受PURINA?MillsSenior饲料。
[0248] 食物及水管理
[0249] 根据设施标准操作程序，饲料定量适合测试动物之年龄、状况及物种。在整个研究 期间随意提供水。
[0250] 研究用兽医产品（IVP)
[0251] 藉由在经修饰最低必需培养基（mMEM)中以2%FBS感染AKMA-104细胞来制备 PRRSV克隆。使培养物在37 °C下培育直至CPE彡80 %，此时将其置于-70 °C下。在接种当日 (D0)，自冷冻器移除烧瓶且使其在室温下解冻。随后将每种克隆之悬浮液转移至塑料之瓶 塞盖疫苗瓶中且标记为T1、T2或T3(参见表1)。随后直接将其于冰上递送至研究地点。测 试所有克隆制剂且在接种前及接种后由TCID5。分析定量。对于对照组C而言，使用1XPBS 作为安慰剂。在D0对猪投予2.OmL頂之适当IVP或安慰剂。在接种后将任何剩余之IVP 返回至BIVI-Ames。关于PRRSV克隆IVP之详情，参见表8、9及10。
[0252] 表8 :研究用兽医产品，PRRSVIsolateY-6
[0253]
[0257]表 10 :研究用兽医产品，PRRSVWetzelClone9p48
[0258]
[0259]藉由油脂精炼处置所有安乐死研究猪之尸体。在接种后或验尸前不自研究移除测 试动物。在投予所有剂量之研究用兽医产品之后，将剩余IVP返回研究监控人员进行适当 处置。
[0260]评估克隆安全性
[0261] 基于对PRRSV血清阳转、病毒血症及与PRRSV相关之肺部病变的存在性/严重性 来评估克隆之安全性。接种后在任意时间点单次发生病毒血症将猪分类为病毒血症阳性。 根据12. 3. 1部分中所述之程序计算每只动物肺部之病理学百分比。将每个测试组之结果 与对照组之结果相比较。亦对猪评估PRRSV在血清及肺部灌洗液中之分离、临床观测/计 分值及死亡率。
[0262] 使用无菌18_20gXl英寸（2.54cm)至1.5英寸 (3. 81cm)l-l1//VACCUTAINER?针、VACCUTAINER?针钳及 13mL血清分离 管（SST)，由研究、研究者或指定人员经由前腔静脉自每只猪收集不超过10mL之静脉全血。 在接种前及在第7天及第14天收集血液。对每个血液管标记以动物之ID号、研究编号、收 集日期、研究日及样本类型。
[0263] 藉由PCR测试血清样本之PRRSV病毒血症且使用市售测试-IDEXX_?PRRS ELISA测试血清样本之PRRSV抗体。亦藉由病毒分离（VI)测试血清样本是否存在PRRSV。 每只动物在接种疫苗之前均为PRRS血清阴性（ELISAS/P比率〈0. 4)，指示有效研究。病毒 分离结果报导为阳性或阴性。
[0264] 临床观测
[0265] 由研究者或指定人员在第-1天至第14天每天观测猪之总体健康状况及与PRRS 疾病相关之临床征象。特定而言，每天检查猪之呼吸、行为及咳嗽，每一类定级〇为正常且 1为异常（参见表11)。每只猪之每日总分为其在特定日之呼吸计分值、行为计分值及咳嗽 计分值之总和。在研究期间未发生死亡。
[0266] 呼吸、行为、咳嗽及观测计分值计分如下：呼吸计分值：0=正常呼吸、1=异常呼 吸；行为计分值：〇=正常行为、1 =异常行为；咳嗽计分值：〇=未注意到咳嗽、1 =存在咳 嗽。
[0267]在验尸当日，在收集数据及样本之后，由研究者或指定人员对每只猪施以安乐死 且进行验尸。安乐死之后，研究者或指定人员完整移除肺部及气管，沿气管置放一夹钳以防 止血液交叉污染。观测肺部病理学之一般描述且记录每个肺叶中之病理学百分比。藉由每 个肺叶之肺部病理学百分比总和确定每只猪之肺部病理学总％。
[0268] 在评估肺部之病理学之后，由研究者或指定人员自每一组肺收集肺部灌洗样本。 对每个样本标记以动物编号、研究编号、样本类型、收集日期及研究日。对此研究而言，未收 集肺部组织样本。
[0269]结果：
[0270] 在第0天，所有猪之ELISA结果均为阴性（S/P〈0. 400)，表示在接种时没有母性 抗体存在。第〇天，T1组、T2组、T3组及C组之平均值分别为-0. 070、-0. 042、-0. 037 及-0. 032。所有猪在第7天仍为阴性，T1组、T2组、T3组及C组之平均值分别 为-0. 069、-0. 038、-0. 023 及-0. 053。在第 14 天，T1 组中四只阳性猪（4/6,66. 7% )、T2 中五只阳性猪（5/6,83.3%)且T3组中一只阳性猪（1/6，16.7%)。然而，C组仍为全部阴 性（0/5,0. 0% )。T1组、T2组、T3组及C组在第14天之平均值分别为1. 122、1. 024、0. 247 及-0.045。ELISA资料可见于表11中。
[0271]表 11PRRSV 1DEXX?ELISA样本与阳性比
[0272]
[0273] * 阳性样本=S/P>0. 400
[0274] 在第0天，所有猪均为PCR阴性，表示在接种时没有暴露到PRRSV。在第7天， T1组（6/6，100% )及T2组（6/6，100% )中之所有猪均为阳性，而T3组（0/6,0.0% )及 (：组（0/5,0.0%)全部为阴性猪。第14天，每组中阳性猪之数目为116/6(100%)、丁2 6/6(100% )、T32/6(33. 3% )及C0/5(0. 0% )。对照组C在整个研究期间没有阳性猪，表 示该环境没有暴露到PRRSV。PCR总数可见于表12中。
[0275]表 12 :NA_PRRSV多重PCR结果
[0276]
[0277]*Neg=阴性、Pos=阳性
[0278] 由于T3组直至第14天尚未展示任何PCR阳性猪之事实，因此进行测序以证实88 及97号猪受WetzelClone9感染。比较由上文所列之猪分离之PRRSV与此研究中所用之 三个PRRSV克隆之间的0RF5序列。来自88及97号猪之结果与WetzelClone9同源。序 列结果可见于图5中。
[0279] 血清样本上之病毒分离与PCR结果类似。在第0天，由CPE及FA显示所有猪均 为阴性。在第7天，对于CPE及FA而言，T1组、T2组、T3组及C组每组中之阳性猪分别为 6/6(100% )、6/6(100% )、2/6(33. 3% )及 0/5(0. 0% )。在第 14 天，对于CPE及FA而言， !1组、了2组、了3组及(：组每组中之阳性猪分别为5/6(83.3%)、2/6(33.3%)、5/6(83.3%) 及0/5(0.0%)。对照组C在整个研究期间再次保持阴性，表示没有暴露到PRRSV。参见表 13中之病毒分离-血清结果。亦在验尸时获得之支气管-肺泡灌洗样本上进行病毒分离。 结果显示！1组、了2组、了3组及(：组分别为2/6(33.3%)、3/6(50.0%)、1/6(16.7%)及 0/5 (0.0%)阳性猪。关于病毒分离-灌洗结果，参见表14。
[0280] 表13 :病毒分离-血清
[0281]
[0282]
[0283] *Neg=阴性、Pos=阳性；CPE=细胞病变效应、FA=荧光抗体
[0284] 表14 :病毒分离-灌洗
[0285]
[0286] *Neg =阴性、Pos =阳性；CPE =细胞病变效应、FA =荧光抗体
[0287] 临床观测
[0288] 所有猪均具有0之临床计分值，意谓未观测到异常之临床呼吸征象、异常行为或 咳嗽。关于观测计分值，参见表15。
[0289] 表15 :临床观测计分值
[0290]
[0291]
[0292] 所有猪均具有0之肺叶病理学％计分值，意谓在经大体病理学检查后在任何肺叶 上均无可见病变。关于肺部病变计分值参见表16,且关于IVP滴定参见表17。
[0293] 表16 :肺部病变计分值
[0294]
[0295]
[0296] *RA=右顶叶、RC=右心叶、RD=右膈叶、LA=左顶叶、LC=左心叶、LD=左膈 叶、Int =中叶
[0297] 表17:IVP滴定结果
[0298]
[0299] * 效价表述为Logl0TCID50/mL
[0300]结论：
[0301]此研究之目标在于评估 PRRSV 克隆 Isolate Y_6、Wetzel Clone 3 p51 及 Wetzel Clone 9 p48在5周大仔猪中之安全性以确定其作为疫苗候选物之活力。尽管在接种14天 后无可见之肺部病变，但对于两个克隆（Isolate Y-6及Wetzel Clone 3 p51)而言，到第7 天时存在PRRS病毒血症。接种第三种克隆（Wetzel Clone 9 p48)之两只仔猪在第14天 时测试PCR阳性。另外，在病毒血症存在一周后，直至第14天，在任何IVP仔猪中均未检测 到PRRSV抗体。尽管仔猪到第14天时发生病毒血症，但数据显示此研究中所用之PRRSV克 隆并未导致肺部病变和/或PRRSV感染之临床征象。认为该等克隆在5周大仔猪体内系安 全的。未来研究应包括接种疫苗-攻毒模型以确定该等克隆在以PRRSV进行毒性攻毒后减 少肺部病变之能力。
[0302] 实施例3 :减毒PRRS病毒（Wetzel减毒）在呼吸道攻毒模型中功效
[0303] 此研究之目标在于评估INGELVACPRRS? MLV及实验疫苗在呼吸道攻毒模型中 针对最近之NA-PRRSV攻毒分离株的功效。评估包括死亡率、临床计分值（呼吸窘迫、行为、 咳嗽等）、病毒血症、肺部病变、血清学、病毒分离、平均每日增加及直肠温度。
[0304] 此研究之目标在于评估INGELVACPRRS? MLV及实验疫苗在呼吸道攻毒模型中 针对最近之NA-PRRSV攻毒分离株的功效。评估包括死亡率、临床计分值（呼吸窘迫、行为、 咳嗽等）、病毒血症、肺部病变、血清学、病毒分离、平均每日增加及直肠温度。在表18中提 供事件进程。
[0305] 表18 :事件进程
[0306]
[0308]个别地识别65只易受PRRS影响之研究猪且由研究者进行检查，且认为健康以供 录用。将猪随机分为四组，如表19中所示。
[0309] 表19.处理组
[0310]
[0311] 在第0天，在研究之第0天（DO)，对第2组及第3组分别根据标签说明以 INGELVAC PRRS⑧MLV或2. OmL实验疫苗经頂进行疫苗接种。第1组以相同方式接受 等剂量之安慰剂。SC组充当严格对照且不接受处理。在多3周大时对猪进行疫苗接种。在 D22,以1-4-4分离株对第1组、第2组及第3组进行攻毒。在攻毒期间仅两个室可用。将第 1组与第2组圈养在一起且第3组留在其初始室中。攻毒途径及剂量为1. 0ml经鼻内（每 鼻孔0. 5mL)。在攻毒当日滴定攻毒病毒之效能，结果指示每次给药递送5. 131og之剂量。 攻毒后第14天（D36)，对所有猪施以安乐死并验尸。移除肺部及气管，且观测肺部病理学之 一般描述。记录每一肺叶中之病理学百分比。计分之后，收集肺部灌洗。藉由PCR测试个 别肺部灌洗液中是否存在PRRSV。
[0312] 获取直肠温度且自攻毒前一天（D21)至验尸日（D36)对动物进行观测；观测系关 于死亡率、呼吸窘迫、行为及咳嗽。在D0接种疫苗之前且在D7、14、21、D28及D35收集血 清。藉由IDEXX_ ELISA个别地测试血清样本之PRRSV抗体且藉由PCR、qPCR及VI测 试血清样本之病毒血症。另外，收集固定肺部组织且若必要保留用于组织测试。在研究开 始时（第〇天）、攻毒时（第22天）及在验尸之前（第36天）对动物进行称重。在此研究 中使用65只混合育种、混合性别、个别识别之猪，其在研究中分配之前系PRRSV抗体与病毒 血症阴性的。将动物根据适当之S0P圈养于BSL2设施中。为消除各组间散毒，在研究持续 期间将疫苗组与对照分房置放，参见表1。又，SC组与未经接种疫苗之第1组保持在一起直 至攻毒日且在第22天进行验尸。
[0313] 根据这些区域可接受之动物管理实践，动物空间适合猪之大小及数目。根据设施 标准操作程序，饲料定量适合测试动物之年龄、状况及物种。在整个研究期间随意提供水。 在研究期间未向猪投予方案以外之生物剂或医药剂。
[0314] 疫苗、安慰剂及攻毒病毒
[0315] 关于此研究中所用之疫苗、安慰剂及攻毒病毒，参见表20、21、22及23。
[0316]表 20.疫苗、INGELVAC_P_RRS?MLV
[0317]
[0322] 表23.攻毒病毒、北美PRRSV(NA-PRRSV)攻毒分离株
[0323]
[0324] 有效性评估
[0325] 基于PRRSV病毒血症及与PRRSV相关之肺部病变总百分比的减少来评估疫苗功 效。接种疫苗后在任意时间点单次发生病毒血症将猪分类为病毒血症阳性。根据实验方案 中所述之程序计算每只动物肺部之病理学百分比。亦对猪评估PRRSV在血清及肺部灌洗液 中之分离、临床观测/计分值、血清学、死亡率、平均每日增加（ADG)及直肠温度。
[0326]结果：
[0327] 在验尸报导记录上记录肺部病理学之一般描述及每一肺叶中之病理学百分比。藉 由总和每一肺叶之肺部病理学百分比来确定每只猪之肺部病理学总百分比。附录中包括个 别肺部病变计分值。概括性统计学列于表24中。使用3型测试及最小均方差值，在混合程 序中使用SAS来分析肺部计分值；处理及空间由于圈养限制而混乱。在与攻毒对照组相比 时，两个接种疫苗之组中具有统计学上显著较低之肺部计分值。未提交组织病理学。
[0328] 表24 :具有个别值散布图之肺部计分值概括统计学
[0329]
[0330] 在评估肺部之病理学之后，由研究者或指定人员自每一组肺收集肺部灌洗样本。 藉由PCR、qPCR及VI测试肺部灌洗样本之PRRSV。基于qPCR，所有BAL样本对于攻毒病毒 而言均为阳性的。在BAL中检测之病毒量在统计学上无差异。
[0331] 在D0、D7、14、22、D28及D36收集血液。自每一管收获血清且转移至低温小瓶中用 于保留且转移至HMC中用于测试。将BIVI-Ames处之血清样本保持在2-8°C下直至测试且 保持在_70±10°C下用于保留。
[0332] 血清样本系用于使用市售测试（IDEXX?PRRS ELISA)之PRRSV抗体。ELISA 结果记录为样本与阳性（S/P)比。S/P比彡0.4被认为系阳性。结果展示于图6中。
[0333] 由PCR及qPCR测试对于PRRSV而言之病毒血症。结果报导为阳性或阴性，其使 用用于任何PRRS病毒之通用引物。接种疫苗后在任意时间点单次发生病毒血症将猪分类 为病毒血症阳性。藉由使用经特定设计用以在不检测每一疫苗病毒之情形下检测攻毒144 PRRS病毒之引物的qPCR测试来确定PRRS病毒之相对拷贝数。使用3型检验及最小均方差 值，在混合程序中使用SAS来分析定量数据；处理及空间由于圈养限制而混乱。在第29天， W96117#9 p42接种疫苗组之血清中具有比攻毒对照组显著较少之病毒（p-值=〈0. 0001)。 在第36天，经INGELVACPRRS1? MLV接种疫苗之组比攻毒对照组具有显著较少之病毒血 症（P-值=〇. 0089)。结果展示于图7中。
[0334] 临床观测
[0335] 由研究者或指定人员自攻毒前一天（D27)至验尸当日（D36)每天观测猪之总体健 康状况及与PRRS疾病相关之临床征象。特定而言，每天检查猪之呼吸、行为及咳嗽，每一类 正常定级为〇且异常定级为1。结果展示于图8中。
[0336] 自D22至D36,每天获取直肠温度。使用JMP8.0学生检验分析数据。在比较经 W96117#9 p42疫苗接种疫苗之组的温度反应时，平均温度与攻毒对照组相比在第22至25 天显著较高，且在第26、33至35天显著较低。在比较经接种疫苗之组时，在第24天及第29 天具有比攻毒对照猪显著较高之平均温度；在第22、33至35天之平均温度显著较低。在此 研究中，攻毒对照组之一只猪在第35天时由于发病而被施以安乐死。结果展示于图9中。
[0337] 在第0天、第22天及第36天对动物进行称重。计算接种疫苗期间及攻毒期间之 总的平均重量增加。使用3型测试及最小均方差值，在混合程序中使用SAS来分析重量增 加数据；处理及空间由于圈养限制而混乱。经INGELVACPRRS? MLV接种疫苗之组与攻 毒对照组相比在接种疫苗期间具有统计学上较低之增加（P-值=〈0.0001)且在攻毒期间 具有统计学上较高之增加（P-值=〇. 0039)。W96117#9 p42组在攻毒期间具有比攻毒对照 组显著较高之增加（P-值=〈0.0001)。结果展示于图10中。
[0338] 论述：
[0339] 此研究之目标在于评估INGELVACPRRS? MLV及实验疫苗在呼吸道攻毒模型 中针对最近之NA-PRRSV攻毒分离株的功效。攻毒分离株具有高度毒性且产生极高（高达 100 %之肺部病变计分值，指示肺炎）肺部病变及明显之临床疾病，包括重量损失及死亡。
[0340] 在毒性攻毒存在下评估两种疫苗之功效。通常推荐在预期攻毒期之前4周对猪接 种疫苗。然而，在此研究中，在接种疫苗后22天时对猪进行攻毒。两种疫苗均导致统计学 上显著减少之肺部病变，重量增加在攻毒后之时期内得以改良且病毒血症在攻毒后减少。
[0341] 在此研究之过程中，研发一种特定半定量性PCR来特异性检测144攻毒病毒。以 此工具，血清病毒血症数据可对攻毒病毒具特异性且不检测疫苗病毒。证实未经接种疫苗 之组在移至具有经接种疫苗之动物之室中之后在攻毒期间无可检测之疫苗病毒。
[0342] 实施例4 :Wetzel预减毒（p3 Wetzel (SEQ ID NO: 1之核苷酸序列））与Wetzel减 毒（(SEQ ID N0:2之核苷酸序列））之核苷酸及由其编码之蛋白质序列
[0343] 核苷酸序列
[0344] 此研究之目的在于为PRRSV分离株预减毒Wetzel病毒株（p3)及减毒后疫苗 Wetzel病毒株（p41)提供PRRSV全基因组序列。预减毒及减毒后疫苗病毒株之基因组测序 可提供有助于理解病毒适应性之生物决定子及病毒恢复所需之界限的重要信息。注意，尽 管PRRSV病毒系单链RNA病毒，但本文揭示DNA等效物（其中T取代实际RNA病毒序列中 之U)与NCBI GenBank用法一致。
[0345] 基因组测序
[0346] 采用一种病毒宏观基因组学方法，其中使每种PRRS病毒之组织培养物质经受病 毒颗粒保护之核酸提取及随机引发扩增子之454-测序。总计尝试6种病毒株：1-4_4 (资 料未展不）、第 3 次传代 Wetzel(p3)、pl0 Wetzel、p20 Wetzel、p30 Wetzel、p40 Wetzel 及 疫苗病毒株p41 Wetzel。在7次尝试中，对于6种病毒株之完全/近完全基因组分析实现 充分测序，其中p20 Wetzel失败。表25显示每种分离株之序列数及平均覆盖深度。获得 高百分比之PRRSV序列且在任何样本中均未检测到其它病毒。p3 Wetzel及p41 Wetzel之 基因组序列在下文中分别列为序列ID 1及2。
[0347] 表25 :测序概述
[0348]
[0349] 减毒之组分
[0350] 对在减毒期间测试之每次传代时经修饰或具多态性的那些位置进行详细分析；基 于测序数据，在疫苗病毒株中确定无大规模之缺失。如表26中概述，在p3与p41之间识别 33个点突变，大部分（19/33)系沉默的或具多态性。
[0351] 表26 :p3相对于p41之变化概述
[0352]
[0353] 蛋白质序列：
[0354] 来自Wang等人（22)(删除内部参考；明确以引用方式并入本文中）：PRRSV系一种 包括编码九个0RF之约15kb基因组的小包膜单一正链RNA病毒。PRRSV基因组包含两个 聚合酶基因（〇RF la与lb)及七个结构基因（01^2&、213、3、4、5、6及7)。01^13与01^让 占病毒基因组之约75%，且由翻译为大的聚合蛋白质之核糖体框架移位方法来表征；其自 身裂解产生包括RNA依赖型RNA聚合酶之非结构蛋白质（NSP)。开放阅读框架2a、3、4及 5均编码糖基化蛋白质，分别指定为GP2a、GP3、GP4及GP5。最新定义之0RF2b编码指定为 GP2b之病毒颗粒的最小蛋白质。0RF7编码非糖基化核衣壳蛋白质（N)，占病毒颗粒之蛋白 质含量的20-40%。0RF6编码类似非糖基化基质蛋白质（M)。
[0355] 鉴别由SEQ ID NO: 1及2之核苷酸序列编码之多肽，且示于如下：
[0356] 由SEQ ID NO: 1编码之p3 Wetzel蛋白质序列
[0357]
[0358]
[0360] 由SEQ ID NO: 2编码之不同于p3序列之p41减毒Wetzel蛋白质
[0361] 序列
[0362]
[0363]
[0364] 参考文献：
[0365] 以下参考文献以对本文所述之内容提供例示性程序或其它详细补充之程度而具 体以引用的方式并入本文中。
[0366] (1)Cavanagh D. Nidovirales:a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae. Arch Virol 1997 ； 142 (3):629-33.