猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法
【专利说明】猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法
[0001] 序列表
[0002] 本申请案包含序列表，其已根据37C.F.R. 1.821-1.825以ASCII的格式以电子方 式呈送。于2014年1月29日所产生的该六3(：11复本名为1〇-〇145-1〇-1-3￡〇41扒其大小 为124, 804字节。伴随本申请案的序列表全部通过引用并入本文。
[0003] 发明背景 A.技术领域
[0004] 本发明系关于猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)组合物及相关方法。
[0005] B.相关技术描述
[0006] 尽管大量努力针对病原体消除及控制策略，但养猪业仍因PRRSV而持续经 历主要的经济损失。PRRSV系一种分类为套式病毒目（Nidovirales)、动脉炎病毒科 (Arteriviridae)及动脉炎病毒属（Arterivirus)之包膜单链正义RNA病毒。该病毒导致 猪生殖与呼吸综合征（PRRS)，且亦称为神秘猪病（MysterySwineDisease)及SIR。PRRS 之症状包括育种雌性生殖失败及生长期猪之呼吸道疾病。生殖失败与中后期流产、木乃伊 胎与弱出生仔猪数量增加及健康出生仔猪较少相关。PRRSV之特征亦在于通常由显微镜可 见之如同间质性肺炎之厌食、发热及呼吸道疾病。因此，感染PRRSV对兽群之生产率可具有 显著之负面效应。据估计，PRRSV每年使美国养猪业耗费约5亿6千万美元。复合情形系 PRRSV在大多数猪生产国具地方性且在其它地方具有类似经济效应的事实。
[0007]目前用于预防病毒在兽群内及其之间传播的控制策略包括：适当管理育种动物、 移除受感染个体、严格生物安全措施（包括空气过滤系统）、血清接种及使用疫苗。灭活与 修饰（减毒）活疫苗两者均有市售。灭活疫苗产生高水平安全性，但一般认为无效或递送 极有限程度之功效。减毒活疫苗已广泛用于减少由野生型PRRS病毒引起之传播及临床疾 病。尽管修饰活疫苗之功效可针对异源分离株而变化，但其仍为可用于对抗疾病之最优选 疫苗接种选择。
[0008] 如同已报导疑似恢复毒性之若干种情形，减毒疫苗不带有任何风险。因此，新的疫 苗需要能够提供充分免疫保护以减少传播及临床疾病，同时亦展现高度安全性及对遗传改 变之抗性。
[0009] 为增加遗传稳定性，已研发在nsp2(非结构蛋白质2)区具有源自细胞传代之缺失 的病毒。nsp2蛋白质系最大之PRRSV蛋白质、具高度抗原性且具有最高遗传多样性之PRRSV 基因体。缺失突变之值源自其所赋予之稳定性增加。较短之序列导致恢复毒性之可能性较 小。缺失部分将需要插入以回复其初始状态，此比简单取代回到初始毒性形式更不可能发 生。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供克服本领域之缺陷之免疫原性组合物、疫苗及相关方法。该等组合 物及方法尤其提供遗传稳定之PRRSV之免疫原性缺失突变体，由其可制得疫苗，包括减毒 全病毒疫苗及多肽亚单位疫苗，其中该等疫苗赋予对由PRRSV感染引起之临床疾病之免疫 性、对此疾病之保护抗性、减少此疾病之传播和/或减少此疾病。
[0012] 本发明之例示性免疫原性组合物包含由SEQIDNO: 1(PRRSV之预减毒Wetzel分 离株）及SEQIDN0:2 (Wetzel分离株之减毒形式）之核苷酸序列编码之多肽序列中之任 一者或其片段，尤其为与其所源自之全长PRRSV蛋白质相比具有类似免疫原性特异性之在 生物学或功能上（例如在免疫学上）具有活性之片段。所述多肽优选具有免疫原性且在投 予多肽之动物体内诱发对PRRS病毒之免疫反应性反应，该反应对PRRSV具免疫保护性。
[0013] 在另一方面中，本发明提供编码一或多种多肽、抗体构建体或抗体缀合物之核酸 序列，包括DNA与RNA序列。编码多肽之基因序列包含与Wetzelp3ORFla(SEQIDN0:3)、 Wetzelp3ORFlb(SEQIDNO:4)^Wetzelp3GP2(SEQIDNO:5)^Wetzelp3GP3(SEQID N0:6)、Wetzelp3GP4(SEQIDN0:7)、Wetzelp3GP5(SEQIDN0:8)、Wetzelp3M(SEQ IDN0:9)、Wetzelp3N(SEQIDN0:10)、Wetzelp41ORFla(SEQIDN0:ll)、Wetzelp41 ORFlb(SEQIDN0:12)、Wetzelp41GP2(SEQIDN0:13)、Wetzelp41GP3(SEQIDN0:14)、 Wetzelp41GP4(SEQIDN0:7-与p3GP4 序列相同）、Wetzelp41GP5(SEQIDN0:15)、 Wetzelp3M(SEQIDN0:9-与p3M序列相同）及Wetzelp3N(SEQID勵：10-与卩3~序 列相同）之核酸序列至少95 %、90 %、85 %或甚至80 %同源和/或相同之核酸序列，或其对 猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)具免疫反应性或免疫原性之片段。与以上序列互补之核 酸序列系本发明之另一方面。
[0014] 此外，如本文所用之本发明之多肽包括但不限于包含以下之多肽：
[0015]i)包含SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、 SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 11、SEQIDNO: 12、SEQIDNO: 13、 SEQIDNO: 14或SEQIDNO: 15之氨基酸序列之多肽；
[0016]ii)与i)之多肽至少95%同源和/或相同之多肽；
[0017] 和/或ii)之多肽之片段；
[0018]iv)i)或ii)之多肽，或iii)之片段，其包含i)之多肽中任一者之氨基酸基序或 免疫原性表位；
[0019]v)包含至少5个、优选8个、更优选10个、甚至更优选15个或15个以上在i)之 序列中所包括之邻接氨基酸的iii)或iv)之片段；
[0020] vi)由包含SEQIDN0:1(预减毒Wetzel)或SEQIDN0:2 (减毒Wetzel)之序列 的多核苷酸编码之多肽；
[0021] vii)由与vi)之多核苷酸至少95%同源或相同之多核苷酸编码之多肽；或
[0022] viii)由包含至少15个、优选24个、更优选30个、甚至更优选45个或45个以上 在SEQIDNO: 1或SEQIDN0:2之序列中所包括之邻接核苷酸的多核苷酸编码之蛋白质片 段。
[0023] 包含至少一或多种如本文所定义之PRRSV多肽、杀死的或减毒病毒或基于DNA或 RNA之疫苗（例如编码该等免疫原）的本发明之免疫原性组合物可另外包含生理学上可接 受之媒介物，诸如医药学或兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。
[0024]本文所提供之任何PRRSV多肽或本文所提供之包含一或多种该等PRRSV多肽之任 何免疫原性组合物均可用作药物，优选用作疫苗或免疫原性组合物，最优选用于预防或治 疗个体抵抗PRRS感染。
[0025] 本领域技术人员将了解本文所用之组合物可并有已知可注射之生理学上可接受 之无菌溶液。为制备用于肠胃外注射或输注之即用型溶液，随时可用等张水溶液，例如盐水 或血浆蛋白质溶液。另外，本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括兽医学上可接受之载剂、 稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。
[0026] 本发明之方法包括（但不限于）在个体体内引发针对PRRSV感染之免疫反应的 方法，其包含向个体投予如本文所定义之包含一或多种PRRSV多肽之免疫原性组合物的步 骤。优选引发针对PRRSV之一种以上血清型或病毒株之免疫反应。本发明之组合物可用于 治疗或者预防PRRSV感染。该免疫反应优选减小与一或多种PRRSV血清型感染相关或由其 引起之一或多种临床征象的发生率或严重性。
[0027] 在本文中，适合之个体及需要投予本发明组合物之个体包括需要预防或治疗与病 毒、微生物、寄生虫、原虫、细菌或真菌相关之感染、疾病或病况之动物。藉由使用本发明之 组合物或方法刺激免疫反应之动物包括家畜（诸如猪、牛、家禽（例如，鸡、鸭、鹅或火鸡）、 山羊及绵羊）及家养动物（诸如小鼠、兔、狗、猫及马）。优选的动物包括猪。
[0028] 本发明亦提供一种减小与PRRSV感染相关或由其引起之一或多种临床征象之发 生率或严重性的方法，其包含投予包含如本文所提供之一或多种PRRSV肽且优选包含载剂 分子的本发明之免疫原性组合物的步骤，以使得PRRSV感染之临床征象的发生率或严重性 相对于未接受如本文所提供之免疫原性组合物的个体而言减小至少10%、优选至少20%、 甚至更优选至少30%、甚至更优选至少50%、甚至更优选至少70%、最优选至少100%。该 等临床征象包括育种雌性生殖失败及生长期猪之呼吸道疾病。生殖失败与中后期流产、木 乃伊胎与弱出生仔猪数量增加及健康出生仔猪较少相关。PRRSV之特征亦在于通常由显微 镜可见之如同间质性肺炎之厌食、发热及呼吸道疾病。
[0029] 根据另一方面，本发明亦系关于一种预防PRRSV感染之方法，其中该PRRSV感染可 由血清型PRRSV或任何其它血清型之PRRSV引起，其包含投予如本文所提供之包含一或多 种PRRSV肽的本发明之免疫原性组合物之步骤。
[0030] 本发明亦提供一种制备本文所提供之任何免疫原性组合物之方法，所述方法包含 将如本文所提供之一或多种PRRSV肽与载剂分子混合，优选使得一或多种PRRSV肽与载剂 分子彼此共价偶联或结合。所述缀合物可为多价或单价的。多价组合物或疫苗包括多种 PRRSV肽与载剂分子之免疫结合。在另一方面中，本发明提供一种产生一或多种PRRSSSV肽 之方法，所述方法包含以编码如本文所提供之任何PRRSV肽之核酸分子转化宿主细胞，优 选为原核细胞，诸如大肠杆菌（E.coli)。或者，宿主细胞可为真核细胞，诸如动物细胞、原 生生物细胞、植物细胞或真菌细胞。真核细胞优选为哺乳动物细胞（诸如CH0、BHK或C0S) 或真菌细胞（诸如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae))或昆虫细胞（诸如Sf9)。
[0031] 本发明之另一方面提供一种产生一或多种PRRSV肽之方法，所述PRRSV肽诱发针 对至少一种血清型之PRRSV且更优选两种或两种以上血清型之PRRSV的免疫反应。此方法 包含培养编码且表达本文所揭示之一或多种PRRSV肽之经转化的表达载体。该等表达的蛋 白质由表达生物体保留或经分泌至培养基中。在足以产生能够诱发对PRRSV之免疫反应之 PRRSV肽的条件下进行表达。
[0032] 本发明之又一方面系包含基于DNA和/或RNA之疫苗的组合物及制造与投予该等 疫苗之方法，包括编码赋予免疫性之多肽（免疫原性多肽）之核酸（或多核苷酸）或其中 该核酸本身系免疫原。制造及使用该等基于DNA和/或RNA之疫苗的方法在本领域中系熟 知的。
[0033]制造本发明组合物之方法可另外包含将一或多种PRRSV抗原与载剂分子之缀合 物与生理学上可接受之媒介物（诸如医药学或兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合）混 合。本领域技术人员将意识到媒介物、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人喜好及动 物种类来决定。
[0034] 在另一方面中，本发明提供一种诊断个体之PRRSV感染的方法。所述方法包含提 供一或多种PRRSV肽；使该一或多种PRRSV肽与由个体获得之样本接触；且若在样本中检 测到能够结合该一或多种PRRSV肽之抗体，则确定该个体患有PRRSV感染。
[0035] 在另一方面，本发明提供一种确定个体先前已暴露于PRRSV感染且能够对PRRSV 表现免疫反应之方法。所述方法包含提供一或多种PRRSV肽；使该一或多种PRRSV肽与由 个体获得之样本接触；且若在样本中检测到能够结合该一或多种PRRSV肽之抗体，则确定 该个体患有PRRSV感染。
[0036] 本发明亦提供试剂盒，其包含含有一或多种PRRSV肽优选与载剂分子一起之免疫 原性组合物；一用于封装免疫原性组合物之容器；一组印刷版说明书；及一能够将免疫原 性组合物投予动物之施配器（dispenser)。该一或多种PRRSV肽与载剂分子视情况可以缀 合物或单独化合物之形式封装。当单独供应时，亦供应一种使一或多种PRRSV肽与载剂分 子缀合之构件以及适当之印刷版说明书。
[0037] 本发明亦提供用于对动物接种疫苗之试剂盒，其包含一组印刷版说明书；能够将 本文所提供之包含一或多种PRRSV肽之免疫原性组合物投予动物之施配器；且其中至少一 种PRRSV肽使动物有效免疫以抵抗至少一种与PRRSV感染相关之疾病。该一或多种PRRSV 肽优选选自本文提供的那些。本发明之试剂盒可另外包含兽医学上可接受之载剂、佐剂或 其组合。
[0038] 本发明试剂盒中之施配器能够以液滴形式施配其内容物；且免疫原性组合物包 含试剂盒中所包括之如本文所提供之PRRSV肽，其在经鼻内、经口、皮内或肌肉内投予至动 物时能够减小至少一种PRRSV感染临床征象之严重性。与未经治疗之感染动物相比，临床 征象之严重性优选减小至少10%、优选至少20%、甚至更优选至少30%、甚至更优选至少 50%、甚至更优选至少70%、最优选至少100%。
[0039] 亦揭示治疗或预防由PRRSV引起之感染之方法。该方法包含向个体投予有效量之 本发明之免疫原性组合物，其中该治疗或预防系选自减轻PRRSV感染征象、减小PRRSV感染 临床征象之严重性或发生率、减小个体因PRRSV感染之死亡率及其组合。
[0040] 本发明之组合物另外包含兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。该等组合物可 用作疫苗且包含减毒疫苗、灭活疫苗或其组合。该等疫苗引发针对至少一种与PRRSV相关 之疾病的保护性免疫反应。
[0041] 本领域技术人员将了解，本文中所用之组合物可并有已知可注射之生理学上可接 受之无菌溶液。为制备用于肠胃外注射或输注之即用型溶液，随时可用等张水溶液，例如盐 水或血浆蛋白质溶液。另外，本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括医药学或兽医学上可 接受之载剂、稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。
[0042] 本发明之方法亦可包含将本发明之组合物与兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组 合混合。本领域技术人员将意识到媒介物、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人喜好 及动物种类来决定。
[0043] 本发明亦提供一种减小动物体内之PRRSV感染严重性的方法，其包含向动物投予 包含来自选自SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQ IDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQ IDNO: 14及SEQIDNO: 15之非毒性、杀死的或减毒免疫有效抗原（包括其片段）和/或其 组合的病毒培养物之分离物的组合物。
[0044] 亦揭示治疗或预防由PRRSV引起之感染之方法。该方法包含向动物投予有效量之 本发明之免疫原性组合物，其中该治疗或预防选自减轻PRRSV感染征象、减小PRRSV感染临 床征象之严重性或发生率、减小动物因PRRSV感染之死亡率及其组合。
[0045] 优选投药途径包括鼻内、经口、皮内及肌肉内。优选在饮用水中投药，最优选以单 次给药。本领域技术人员将意识到，本发明之组合物亦可以一或两次或两次以上给药以及 藉由其它投药途径来投予。举例而言，该等其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉 内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、叶内、髓内、肺内或阴道内。视治疗之所需持续时间及 有效性而定，可一次性或分若干次，亦间歇性地，例如在每日之基础上历时若干天、数周或 数月且以不同剂量来投予本发明之组合物。
[0046] 本发明亦提供用于对动物接种疫苗之试剂盒，其包含一组印刷版说明书；能够 将疫苗投予动物之施配器；及至少一种来自PRRSV或使动物有效免疫以抵抗至少一种与 PRRSV相关之疾病之免疫组合物的病毒培养物的分离株。本发明之试剂盒可另外包含兽医 学上可接受之载剂、佐剂或其组合。
[0047] 本发明试剂盒中之施配器能够以液滴形式施配其内容物；且试剂盒中所包括之分 离株在经鼻内、经口、皮内或肌肉内投予至动物时能够减小至少一种PRRSV感染临床征象 之严重性。在某些试剂盒中，分离株亦能够减小至少一种PRRSV感染临床征象之严重性。与 未经治疗之感染动物相比，临床征象之严重性优选减小至少10%。
[0048] 本发明之其它目标、特征及优势将自以下详细说明变得显而易见。然而应了解详 细说明及具体实施例尽管指示本发明之优选实施方案，但系仅以说明方式来给出，因为本 领域技术人员根据此实施方式将清楚了解本发明之主旨及范畴内之各种改变及修改。
[0049] 附图简述
[0050] 以下图式形成本说明书之部分且包括该等图式以进一步说明本发明之某些方面。 可藉由参考该等图式中之一或多者，结合本文提供之特定实施方案之详细描述来更好地理 解本发明。
[0051] 图1系来自实例1之呼吸道试验之肺病理图表。在第14天收集猪安全研究平均肺 计分值。字母"a"指示平均肺计分值高于阴性对照组，而字母"b"指示计分值低于Isolate X野生型组。
[0052] 图2系来自实例1之呼吸道试验之IDEXXELISA曲线图。若（S/P)比率至少为 0. 4,则认为样本对于PRRSV特异性抗体而言系阳性的。
[0053]图3系如经由AgPath-ID? NA与EU PRRSV Multiplex试剂盒，由RT-PCR所测定 之生殖试验之小母猪病毒血症的曲线图，具有实例1所检测之相对短期病毒血症。
[0054]图 4 系如经由AgPath-ID? NA与EU PRRSV Multiplex试剂盒，由RT-PCR所测定 之仔猪病毒血症的曲线图。在出生时不定程度之仔猪病毒血症，继而在来自实例1之生殖 试验之幼崽内部水平传播。
[0055] 图5系5￡〇10勵：1(预减毒恥七261卩3)与5￡〇10勵: 2(减毒恥七261口41)之 核苷酸序列（RNA病毒序列之DNA等同物）对比。
[0056] 图6系来自实例3之平均PRRSVELISAS/P的曲线图。
[0057] 图7系由PCR展示对于实例3之PPRSV之阳性百分比的曲线图。
[0058] 图8展示来自实例3之以受影响百分比表示之（A)呼吸道计分值（受影响％ )、 (B)行为计分值（％异常）及（C)咳嗽计分值（受影响％ )的曲线图。
[0059] 图9展示来自实例3之平均直肠温度。
[0060] 图10展示来自实例3之平均重量增加（以镑计）。
[0061] 发明详述
[0062] 本发明提供具有增强稳定性之减毒PRRSV病毒株。具体揭示SEQIDN0:3、SEQID N0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、 SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14 或SEQIDNO:15 之多肽及其 片段（包括但不限于上述序列中所包括之至少5个、优选8个、更优选10个、甚至更优选15 个邻接氨基酸）。另外，与上述多肽至少95%同源和/或相同的多肽。此外，亦揭示上述多 肽之相关多核苷酸。
[0063] 除非另外指示，否则本发明之实践将采用本领域中之分子生物学、微生物学、 重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学之习知技术。该等技术在文献中完整解释。例如 参见Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第 I、II及III卷，第 2 版（1989);DNACloning,第I及II卷（D.N.Glover编，1985); OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编，1984)；NucleicAcidHybridization(B. D.Hames&S.J.Higgins编，1984);AnimalCellCulture(R.K.Freshney编，1986); ImmobilizedCellsandEnzymes(IRL出版社，1986) ；Perbal,B. ,APracticalGuideto MolecularCloning(1984)；theseries,MethodsInEnzymology(S.Colowick及N.Kaplan 编，AcademicPress,Inc.)；Proteinpurificationmethods-apracticalapproach(E. L.V.Harris及S.Angal编，IRLPress,OxfordUniversityPress)；及Handbookof ExperimentalImmunology,第I-IV卷（D.M.Weir及C.C.Blackwell编，1986,Blackwell ScientificPublications)〇
[0064] 在详细描述本发明之前，应了解本发明不限于特定DNA、多肽序列或方法参数，当 然同样可变化。亦应了解，本文所用之术语仅用于描述本发明之特定实施方案之目的，且不 欲限制。必须注意，如本说明书及随附申请专利范围中所用，除非内容中另外明确指示，否 则单数形式"一"及"该"包括复数提及物。因此，例如提及"抗原"包括两种或两种以上抗 原之混合物；提及"赋形剂"包括两种或两种以上赋形剂之混合物及其类似物。
[0065]A.定义
[0066] 除非另外定义，否则本文所用之所有技术及科技术语具有与熟习本发明在申请时 所属之技术者通常所理解之相同含义。术语之含义及范畴应明确；然而，在存在任何隐含 歧义之情况下，本文中所提供之定义优先于任何词典或非固有定义。另外，除非上下文另有 需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。本文中，除非另外说明，否则使用 "或"意谓"和/或"。此外，使用术语"包括"不具有限制性。本文提及之所有专利及公开案 均以引用方式并入本文中。
[0067]"针对疾病的保护"、"保护性免疫"、"功能性免疫"及类似短语意谓由投予一或多种 本发明之治疗性组合物或其组合产生之针对疾病或病况之反应，其导致比在暴露于疾病或 感染之未经免疫个体中所预期较少之有害效应。即，在经接种疫苗之个体中，感染之有害效 应的严重性降低。在经接种疫苗之个体中，可减少、减缓或可能完全预防感染。本文中，若 欲完全预防感染，则特定陈述。若未陈述完全预防，则该术语包括部分预防。
[0068] 本文中，"减小临床征象的发生率和/或严重性"或"减少临床症状"意谓（但不限 于）与野生型感染相比减少群组中受感染个体