用于释放病毒样颗粒的方法
【专利说明】用于释放病毒样颗粒的方法
[0001] 本发明涉及用于从昆虫细胞中释放杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒 (VLP)的方法。
[0002] 目前，当对抗传染病时，医学严重依赖疫苗。此类疫苗可以是减毒活疫苗或灭活疫 苗，两者均具有其自身的优点和缺点。减毒活疫苗紧密模拟天然感染，并且因而它们触发的 免疫应答与由剧毒形式的病毒或微生物触发的免疫应答可比较。然而，它们可能引起一些 不希望的副作用，并且减毒水平是相当关键的。另一方面，灭活疫苗是安全的，但它们在几 种情况下不像它们的活的对应物一样有效。
[0003] 在病毒疫苗的情况下，第三类疫苗获得越来越多的关注：所谓的基于病毒样颗粒 (VLP)的疫苗。病毒样颗粒是在形态上紧密类似野生型病毒的颗粒。它们包含在野生型病 毒上发现的所有免疫原性组分，并且它们包含以其天然组构和构象的这些组分。然而，它们 不同于野生型病毒之处在于它们不能产生感染性子代病毒，因为它们缺乏病毒基因组。
[0004] 因此，它们是减毒活疫苗和灭活病毒疫苗两者的有吸引力的替代物。
[0005] VLP主要在细胞系统中体外产生。并且在许多情况下，它们在杆状病毒/昆虫细胞 表达系统中产生。这些系统具有它们能够产生相对大量VLP的优点。
[0006] 在杆状病毒表达载体系统（BEVS)中表达的蛋白质可以是分泌的或非分泌的蛋白 质。这暗示非分泌的VLP在它们可以进一步纯化前首先从昆虫细胞中释放。用于VLP释放 的标准方法包括冻融、超声处理、高切力机械方法、珠方法、"细胞炸弹"、使用低渗介质的渗 透压休克、去污剂的使用和酶促方法。
[0007] 然而，所有这些方法均不可避免地也导致细胞破碎或裂解，并且将细胞的整个内 含物：RNA、DNA、蛋白质、细胞器、细胞碎片以及(在基于杆状病毒的系统的情况下）活的杆状 病毒释放到周围介质内。明确的是大多数(如果不是全部)这些组分在VLP准备用于疫苗之 前必须被去除。所需纯化水平暗示包括许多质量检查的费力的多步过程。
[0008] 因此，存在对将非分泌的VLP释放到细胞培养液内的方法的明确需要，所述方法 避免同时释放细胞的全部核酸和蛋白质内含物。
[0009] 本发明的目的是提供用于释放VLP的方法，其降低或甚至避免上述问题。
[0010] 本发明中提供的方法特别适合于释放使用昆虫细胞在杆状病毒表达载体系统中 表达的无包膜病毒的非分泌的VLP。
[0011] 目前惊讶地发现一旦包含无包膜VLP的昆虫细胞与盐混合，则使得产生于混合的 盐的水溶液（salt in water solution)包含至少300m0smol/L的盐，所述盐的阳离子选自 碱金属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl、Br或I;细胞释放VLP，而不释放其全部 细胞内含物。该方法尤其适合于在悬浮无载体生长时的昆虫细胞。
[0012] 这确实是非常令人惊讶的现象：根据本发明的方法明显使得大多数细胞完整，如 例如图4中可见的。这种VLP释放背后的机制仍不明确。
[0013] 因此，本发明的第一个实施方案涉及用于从昆虫细胞中释放杆状病毒表达的无包 膜病毒的病毒样颗粒（VLP)的方法，其特征在于该方法无裂解或细胞破碎步骤，并且包括将 昆虫细胞与盐混合的步骤，其中产生于混合的盐的水溶液包含至少300m0smol/l的盐，所 述盐的阳离子选自碱金属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl、Br和I。
[0014] 为了该方法的目的，将昆虫细胞与盐混合，使得产生于混合的盐的水溶液包含至 少300m0sm 〇l/l的盐，所述盐的阳离子选自碱金属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自 Cl、Br和I，应理解为包括下述步骤：将细胞培养液(其周围流体中的昆虫细胞）与盐混合 至在混合后所得到的盐溶液包含至少300m0sm 〇l/l的盐的程度，所述盐的阳离子选自碱金 属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl、Br和I。
[0015] 不言而喻，混合可以以不同方式完成；例如通过将固体形式的盐加入细胞培养液 中，或通过将盐的水溶液与细胞培养液混合。
[0016] 如本发明中所述，其为混合结果的盐的水溶液可以例如包含至少150 mM NaCl/L (这获得摩尔渗透压浓度为至少300 mOsmol NaCl/L的盐的水溶液)。如果如本发明中所述 的盐溶液在MgCl2的基础上制备，则产生于混合的盐的水溶液将包含至少100 mM MgCl2/L (这获得摩尔渗透压浓度为至少300 mOsmol MgCl2/L的盐的水溶液)。
[0017] 下述实例仅充当举例说明；如果100 ml包含昆虫细胞和培养基的昆虫细胞培养 物与100 ml 300 mM NaCl/L溶液混合，则产生于这个动作的最终200 ml流体包含150 mM NaCl/L。盐溶液的最终体积当然与根据本发明的方法的有利效应无关。如果75 ml包含昆 虫细胞和培养基的昆虫细胞培养物与25 ml 1200 mM NaCl/L溶液混合，则产生于这个动作 的最终100 ml流体包含300 mM NaCl/L。
[0018] 在本发明的出乎意料的现象的凝胶上的显示在图1中给出。如由图1可见的，显示 在用根据本发明的方法处理后包含释放的VLP的细胞上清液的泳道非常干净（clean)(关 于细节参见实施例部分)。
[0019] 尽管，如上所述，盐溶液的最终体积对于像这样的方法无关，但实际上在对细胞培 养液实施根据本发明的混合步骤前引入浓缩步骤是有用的。浓缩步骤的主要原因在于用于 商业目的的VLP生产需要相对大的细胞培养体积。直接从这些大体积中收获VLP不是有效 的；从小体积中收获VLP需要少得多的处理。
[0020] 该步骤中的浓缩水平并不关键。细胞培养液浓缩成细胞培养液原始体积一半量的 体积（即至50%的原始体积)已获得容易收获的显著优点。进一步浓缩至40%、30%、25%、20%、 15%、10%或甚至5%以该优先次序是优选的。
[0021] 浓缩可以以均为本领域已知的许多方式完成。一种常用方法是例如以切向流透析 (tangential flow dialysis)形式的超滤。
[0022] 另一种常用方法是低速离心。低速离心随后去除一部分或全部细胞培养液导致浓 缩，且最终导致细胞沉淀，但细胞仍将是完整的且仍由少量培养液包围。此类细胞沉淀随后 可以容易地与盐的水溶液混合，以获得如本发明中所述的盐的水溶液。
[0023] 出于实际原因，非常合适的方法是简单贮存包含细胞的细胞培养液，并且让重力 将细胞拉到容器底部。在约1-18小时后，取决于收获体积和容器大小，到目前为止大多数 细胞存在于底部10%的细胞培养液中，使得无细胞的上部90%的细胞培养液可以被弃去。该 方法避免离心和/或超滤大体积的细胞培养液的任务。如此获得的在底部10%的细胞培养 液中的含VLP细胞，随后可以立即用于如本发明中所述将昆虫细胞与盐混合的步骤中。
[0024] 因此，该实施方案的优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于将昆虫细胞与 盐混合的步骤之前为其中浓缩昆虫细胞的浓缩步骤。
[0025] 原则上，选自碱金属和碱土金属的阳离子可以用于根据本发明的方法。然而，对 于选自Na +、Mg2+、Ca2+和K +的阳离子存在优选，因为它们是廉价的且对于医学用途是可接受 的。
[0026] 因此，本发明的该实施方案的另一种优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在 于阳离子选自Na +、Mg2+、Ca2+和K+。
[0027] 优选阴离子是Cl，因为具有Cl阴离子的盐是廉价的，并且它们对于医学用途是 高度可接受的。
[0028] 因此，该实施方案的更优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于盐选自NaCl、 KCl、CaCljPMgCl 2。
[0029] 包含携带VLP的昆虫细胞的细胞培养液另外包含培养细胞必需的许多组分。它还 包含细胞的废产物（waist products)。这些产物是不需要的副产物，其对于包含VLP的最 终疫苗可能是有害的。
[0030] 此类组分因此优选在对细胞应用根据本发明的方法之前，与包含VLP的昆虫细胞 分开。这可以容易地通过下述完成：使细胞沉淀，弃去上清液且将细胞重悬浮于如本发明中 所述的盐溶液中。如果这小心地完成，则到目前为止的大部分上清液可以被去除。在那种 情况下，产生于细胞和盐混合的盐的水溶液基本上由如本发明中所述的盐和水组成。基本 上在此处意指产生于混合的盐的水溶液包含小于10%的细胞培养液。优选地，产生于混合 的水溶液包含小于8%、小于6%、小于4%或甚至小于2%的细胞培