发明的方法 处理的细胞制成。细胞保持为未经处理的细胞培养液或实施根据本发明的方法，在这种情 况下，与盐的水溶液混合使得产生于混合的盐的水溶液包含0.3 M NaCl/L。
[0066] 图4显示了结果：左侧图片显示了未处理的昆虫细胞，而右侧图片显示了在混合 后包含0.3 M NaCl/L的盐的水溶液中的昆虫细胞。如立即可见的，右侧图片中的细胞事实 上仍是完整的，并且与左侧图片中的细胞相比较，由于其存在于包含0.3 mM NaCl/L的盐的 水溶液的高渗环境中，它们甚至在尺寸中略微更小。
[0067] 实施例6 :温育温度对杆状病毒滴度的影响。
[0068] 在该实施例中，通过低速离心收获30 ml细胞，去除90%的无细胞的培养液，并且 随后将剩余细胞沉淀重悬浮于25 ml盐的水溶液中至0. 5 M NaCl/L的终末浓度。
[0069] 对因此获得的上清液实施35°C、37°C和40°C的温度持续1、2、4、6或18小时(过 夜)。细胞随后通过以3000g离心进行去除。如由图5可见的，在35°C下过夜可以获得约 100倍的杆状病毒滴度减少。在40°C下，在1-2小时后已获得100倍的减少，而在6-18小 时后获得1000倍的减少。
[0070] 实施例7 :各种浓度的几种碱金属的比较。
[0071] 该实验比较通过不同盐的VLP释放。细胞如上所述进行收获，去除90%的无细胞 的细胞培养液体积。其后，加入各种盐的水溶液，由此盐的水溶液的体积始终等于浓缩的收 获物体积的那种，以便实现5倍的终末细胞浓度。测试用各种浓度的NaCl、KC1、MgCljP CaCl2执行。细胞随后通过以3000g离心进行去除。在混合后的浓度呈现于下表1中。
*该样品衍生自相同收获物，但在与剩余样品不同的日期用〇.3M NaCl进行处理。 表1。
[0072] 结果呈现于图6中。泳道2显示了如收获物(在样品五倍稀释后(例外：泳道12 : 未稀释的收获物样品）中存在的蛋白质。在凝胶上的收获物样品的回收率(表1)在表中指 示为100,如在凝胶上测定的相对回收呈现于表1的右侧第二栏中。抗原质量回收呈现于表 1的最右一栏中。由图6中的凝胶和表两者可见，所有处理均具有比泳道2中的制剂(收获 物）更高的回收率，并且所有处理均提供了干净的VLP制剂。（泳道9中相对低的回收率值 视为假象，因为如泳道9中测试的制剂的抗原质量测定显示如预期的高回收率)。图7显示 了在如凝胶上确定的VLP回收率和如通过基于标准ELISA测试的抗原质量测定确定的VLP 回收率之间存在良好关联。
[0073] 实施例8 :对产生猪细小病毒的SF9和SF21细胞应用该方法。
[0074] 该实验旨在显示该方法同样适合于其他无包膜的非分泌的VLP。在该实验中，选择 BEVS衍生的细小病毒科的VLP :猪细小病毒PPV)。另外，在该实验中，使用两个不同物种的 常用昆虫细胞：SF9细胞和SF21细胞。
[0075] 用表达猪细小病毒VLP的重组杆状病毒感染SF9和SF21细胞。（"收获物"，图8， 泳道2和7)。其后将细胞以200g沉淀，去除90%的上清液（图8,泳道4和9)，并且将细胞 重悬浮于等体积的PBS (图8,泳道3和8)或0. 3 M NaCl的水溶液中。在NaCl处理的样 品在40°C下过夜温育后，将样品以3000g离心，收集上清液（图8，泳道6和11)，并且将沉淀 重悬浮于等体积的PBS中（图8,泳道5和10)。
[0076] 图8显示了该方法当应用于在SF9和SF21细胞中产生的PPV-VLP时的结果。泳 道2 :收获物；泳道3 :收获物，重悬浮于PBS中的沉淀，泳道4 :收获物上清液；泳道5 :收获 物，0. 3 M NaCl 40 °C过夜，沉淀；泳道6 :收获物，0. 3 M NaCl 40 °C过夜，上清液；泳道7 :收 获物；泳道8 :收获物，重悬浮于PBS中的沉淀，泳道9 :收获物上清液；泳道10 :收获物，0. 3 M NaCl 40 °C过夜，沉淀；泳道11 :收获物，0. 3 M NaCl 40 °C过夜，上清液。
[0077] 当与泳道3相比较时，由泳道5可见，根据本发明的方法的处理实际上从昆虫细胞 释放所有VLP :如泳道5中所示，在处理后沉淀的细胞几乎不包含或不包含VLP。当与泳道 3相比较时，由泳道4可见，与对于PCV2 VLP可见的相反，产生CPV VLP的昆虫细胞已在上 清液中释放一部分VLP。关于这点的原因未知。然而，根据本发明的方法也可以非常适合地 应用于这些CPV VLP，因为如果不应用本发明的方法，则在收获后相当大量的CPV VLP保持 陷在（trapped in)细胞中。
[0078]附图图例： 图1 :该图显示了使用各种浓度的NaCl的水溶液，在40°C下对包含VLP的昆虫细胞应 用根据本发明的方法的效应。
[0079] 图2:该图显示了使用盐的水溶液中的各种盐，对包含VLP的昆虫细胞应用根据本 发明的方法的效应。
[0080] 图3 :该图显示了使用盐的水溶液中的各种盐，在高温下对包含VLP的昆虫细胞应 用根据本发明的方法的效应。
[0081] 图4:该图片显示了在其培养基中的昆虫细胞(左侧图片）和在用根据本发明的方 法处理后的昆虫细胞(右侧图片）之间的比较。
[0082] 图5:该图片显示了在高温下的延长温育对杆状病毒滴度的影响。
[0083] 图6:该图显示了使用NaCl、MgCl2、CaCljP KC1作为盐的水溶液中的碱盐，对包含 VLP的昆虫细胞应用根据本发明的方法的效应。
[0084] 图7:该图显示了如在凝胶上测定的和如通过抗原质量ELISA测定的，使用根据本 发明的方法获得的VLP量之间的关系。
[0085] 图8:该图显示了对两种不同的昆虫细胞系应用根据本发明的方法的效应，所述 两种不同的昆虫细胞系表达杆状病毒衍生的猪细小病毒VLP。
[0086] 泳道2、7:收获物。泳道3、8:收获物，重悬浮于PBS中的沉淀。泳道4、9:收获物 上清液。泳道5、10:收获物，0.3 M NaCl 0/N 40°C，沉淀。泳道6、11 :收获物，0.3 M NaCl 0/N 40°C，上清液。
【主权项】
1. 用于从昆虫细胞中释放杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP)的方法，其 特征在于所述方法无裂解或细胞破碎步骤，并且包括将所述昆虫细胞与盐混合的步骤，其 中产生于混合的所述盐的水溶液包含至少300m0sm 〇l/l的盐，所述盐的阳离子选自碱金属 和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl、Br和I。2. 根据权利要求1的方法，其特征在于将所述昆虫细胞与盐混合的步骤之前为其中浓 缩所述昆虫细胞的浓缩步骤。3. 根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述阳离子选自Na +、Mg' Ca2+和K +。4. 根据权利要求3的方法，其特征在于所述盐选自NaCl、KCl、CaCl 2和MgCl 2。5. 根据权利要求1的方法，其特征在于产生于混合的所述盐的水溶液基本上由根据权 利要求1-4中任一项的盐和水组成。6. 根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于所述无包膜病毒是细小病毒科或圆 环病毒科的成员。7. 根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述盐的水溶液保持在35-50°C之 间的温度下。8. 根据权利要求7的方法，其特征在于所述盐的水溶液保持在40-45°C之间的温度下。9. 根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于所述昆虫细胞是SF9或SF21细胞。10. 用于纯化杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP)的方法，所述方法包括 下述步骤： a) 用编码VLP-蛋白质的重组杆状病毒感染昆虫细胞， b) 培养所述昆虫细胞， c) 从所述昆虫细胞中释放所述VLP， d) 分离所述VLP， 其特征在于所述方法无裂解或细胞破碎步骤，并且步骤c包括根据权利要求1-9中任 一项的用于释放所述VLP的方法。
【专利摘要】本发明涉及用于从昆虫细胞中释放杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP）的方法。
【IPC分类】A61K39/12
【公开号】CN105073131
【申请号】CN201480008914
【发明人】V.法钦格, M.斯诺
【申请人】英特维特国际股份有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年2月14日
【公告号】CA2899682A1, EP2956167A1, US9193759, US20140234900, WO2014125053A1