养液。
[0031] 因此，该实施方案的优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于产生于混合的 盐的水溶液基本上由如本发明中所述的盐和水组成。
[0032] 根据本发明的方法适合于一般在BEVS中表达的非分泌的无包膜VLP。
[0033] 该方法因此尤其适合于BEVS衍生的细小病毒科（Parvoviridae)和圆环病毒科 (Circoviridae)(具有对于其目前在商业基础上制备VLP的几个成员的病毒科）的成员的 VLP〇
[0034]因此，本发明的该实施方案的另一个优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在 于无包膜病毒是细小病毒科或圆环病毒科的成员。
[0035] 在无包膜病毒基础上用于兽医学中的重要的细小病毒科和圆环病毒科疫苗的实 例是猪细小病毒（PPV)和猪圆环病毒2型（PCV2)，所述无包膜病毒可以以在基于杆状病毒 的昆虫细胞系统中制备的VPL形式成功施用。
[0036] 因此，本发明的该实施方案的更优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于无 包膜病毒是猪细小病毒（PPV)或猪圆环病毒2型（PCV2)。
[0037] 在BEVS中生产VLP原则上还导致杆状病毒的产生。此类杆状病毒是不需要的VLP 的副产物，并且因此它们必须被去除或至少灭活。
[0038] 目前甚至更惊讶地发现：如果盐的水溶液保持在30_55°C，优选35-50°C，更优选 40-45°C之间的温度下，则活杆状病毒的量显著减少。除此之外，当温度增加时，释放的抗原 量也显著增加。
[0039] 这种减少是非常有利的，因为在应用根据本发明的方法后，待灭活的病毒量相对 低，并且因此需要使用更少量的灭活化学品。
[0040] 仅作为实例；当盐的水溶液保持在30-40°C之间的温度下时，可以容易地获得在 1000至10. 000倍之间的病毒滴度下降。
[0041] 在其期间必须应用某一温度的时间取决于所选择的温度：在约40°C的温度下，在 1小时后获得病毒滴度中的10倍减少，而在约35°C的温度下，在5-6小时后获得此类减少。 一般地，将产生于混合的盐的水溶液保持在某一温度下18-24小时无论如何均为合适的。
[0042] 经常用于VLP表达的两个昆虫细胞样本是SF9或SF21细胞。本发明中所述的方 法可以非常成功地应用于这两种细胞。
[0043] 因此，本发明的该实施方案的另一个优选形式涉及根据本发明的方法，其中昆虫 细胞是SF9或SF21细胞。
[0044] 所述方法通常是一般应用于纯化杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP) 的方法的一部分，其包括多个步骤，其中为a)用编码VLP-蛋白质的重组杆状病毒感染昆虫 细胞，b)培养昆虫细胞，c)从昆虫细胞中释放VLP，和d)分离VLP的步骤。
[0045] 正是步骤c)(释放VLP的步骤）将高度获益于根据本发明的方法。
[0046] 因此，本发明的又另一个实施方案涉及用于纯化杆状病毒表达的无包膜病毒的病 毒样颗粒（VLP)的方法，其中该方法包括下述步骤： a) 用编码VLP-蛋白质的重组杆状病毒感染昆虫细胞， b) 培养昆虫细胞， c) 从昆虫细胞中释放VLP， d) 分离VLP， 其特征在于该方法无裂解或细胞破碎步骤，并且步骤c包括根据本发明的用于释放 VLP的方法。
[0047] 实施例. 实施例1 :PCV2 VLP的产生。
[0048] 在该实施例中，使用BEVS衍生的PCV2 VLP。该重组杆状病毒的构建较早在美国专 利US 2001/0064765中详细描述。病毒进一步被称为BacPCV-2-0RF-2病毒。
[0049] 为了获得最大量的表达产物，进行预实验以优化获得重组PCV-2 0RF-2 VLP的条 件。所有实验均使用在悬浮培养中的草地贪夜蛾（办(Sf21)细 胞在28°C下进行。处于来自原种（Master seed)的第4次传代水平的BacPCV-2-0RF-2病 毒用于感染。对于优化的生产，在感染时的细胞密度为1.4 x 106细胞/ml，感染复数(M0I) 为0. 01，并且培养在感染后继续6天。所得到的混合物命名为表达产物收获物。
[0050]根据 Laemmli (Laemmli，U. K. (1970) ?他tore 227,680-685)的方法，对低速 离心前和后的细胞培养液的样品实施变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用的4-12%梯度 凝胶由考马斯亮蓝进行染色。实施例中的所有凝胶也均是根据Laemmli的变性SDS-聚丙 烯酰胺凝胶。
[0051] 实施例2:从昆虫细胞中释放VLP。
[0052] 细胞根据实施例1进行收获。在图1中，标题为"收获物"的泳道显示细胞培养收 获物的蛋白质含量。该泳道显示培养液和细胞中存在的所有蛋白质，包括细胞蛋白质、杆状 病毒蛋白质和VLP相关蛋白质。
[0053] 在以200g将收获物离心后，将90%的无细胞上清液更换为相等体积的盐的水溶 液，使得在混合后的最终浓度为〇. 15、0. 20、0. 25和0. 30 mM NaCl。这些混合物在40°C下 保持18小时，并且剩余细胞随后通过以3000g离心旋转下来（spun down)。对上清液实施 凝胶电泳。
[0054] 如图1中可见的，在标题为"上清液"的泳道中，上清液包含实际上纯的PCV2 VLP 蛋白质（和痕量的非VLP蛋白质）。
[0055] 实施例3 :碱盐和磷酸盐缓冲液的比较。
[0056] 在该实验中，收获细胞培养液，将细胞以200 g沉淀，去除90%的上清液，并且将细 胞重悬浮于等体积的PB (250 mM磷酸盐缓冲液，pH 7. 4、PB + 0. 5 M NaCl、H20 (= WFI = 注射用水）和如本发明中所述的0. 5 M NaCl的水溶液中。
[0057] 温育在40°C下过夜完成。细胞随后通过以3000g离心进行去除。由图2可见，WFI 单独不释放VLP，而PB+NaCl、NaCl的水溶液和PB的确释放VLP。如由泳道WFI +NaCl (= 注射用水+ NaCl，= NaCl的水溶液）可见的，这获得最高量的纯VLP，以及非VLP相关蛋白 质的最低背景。
[0058] 所有样品的抗原质量（以抗原单位/ml - AU/ml表示)均通过ELISA相对于已知抗 原质量的参考标准品进行测定。随后，所有测试样品的回收率（以％计）相对于收获物样品 的回收率进行计算。作为替代方法，在凝胶上的PCV2特异性蛋白质条带的强度相对于收获 物样品的PCV2特异性蛋白质条带的强度进行计算。
[0059] 实施例4 :在高温下的碱盐和磷酸盐缓冲液的比较。
[0060] 在该实施例中，收获细胞培养液，将细胞以200 g沉淀，去除90%的上清液，并且 将细胞重悬浮于等体积的PB (250 mM磷酸盐，pH 7. 4、PB + 0. 5 M NaCl、0. 01 M PBS (8g NaCl/L、0. 2g KC1/L、1. 44g Na2HP04/L、0. 2g KH2P04/L，pH 7. 1)和如本发明中所述的 0? 5 M NaCl的水溶液中。
[0061] 进行几种稀释，以便比较细胞培养液的稀释水平的效应。在一个实验中，将在30 ml收获的细胞培养液中的细胞浓缩10倍，并且随后与盐的水溶液混合至50 ml的终末体 积。在第二个实验中，将在30 ml收获的细胞培养液中的细胞浓缩10倍，并且随后与盐的 水溶液混合至25 ml的终末体积。在第三个实验中，将在30 ml收获的细胞培养液中的细 胞浓缩10倍，并且随后与盐的水溶液混合至10 ml的终末体积。
[0062] 温育在40°C下过夜完成。细胞随后通过以3000 g离心进行去除。由图3中的凝 胶可见，PB、PB+NaCl、PBS和NaCl的水溶液（WFI + NaCl)均的确释放VLP。如由泳道WFI + NaCl (=注射用水+ NaCl，= NaCl的水溶液)可见的，这获得最高量的纯VLP，以及非VLP 相关蛋白质的最低背景。相同效应对于所有三个浓度均可见。
[0063] 另外，使用WFI + NaCl的实验也在45°C下完成。如由泳道"WFI + NaCl，45°C"可 见的，在该温度下的温育获得与在40°C下的WFI + NaCl处理可比较的图片：VLP蛋白质具 有可比较的少量的蛋白质杂质。
[0064] 实施例5 :细胞在盐于水中的环境（salt in water environment)中的行为。
[0065] 在该实验中，显微镜图片由在细胞培养液中的昆虫细胞和根据依照本