聚糖。
[0058] 位于Fc中的W下结合结构域对抗体的生物学特性是重要的：
[0059] -与Fc化受体结合的结构域，参与抗体的药代动力学特性（体内半寿期）：
[0060] 不同数据表明位于C肥结构域和C册结构域交界处的某些残基参与结合Fc化受 体。
[0061] -与补体Clq蛋白结合的结构域，参与CDC反应（"补体依赖性细胞毒性：位于 C肥结构域内；
[0062] -FcR受体结合的结构域，参与吞隧或ADCC("抗体依赖性细胞毒性"）型反应：位 于C肥结构域内。
[0063] 在本发明的意义下，抗体的Fc片段可W是天然的，如上文定义，或可W另外W多 种方式被修饰，前提是它包含与FcR受体（对于IgG而言，Fc丫R受体）结合的功能性结构 域和优选地与受体Fc化结合的功能性结构域。运些修饰可W包括缺失Fc片段的某些部 分，前提是后者包含与受体FcR(对于IgG而言，受体Fc丫时结合的功能性结构域和优选地 与受体Fc化结合的功能性结构域。运些修饰还可W包括能够影响抗体生物学特性的各种 氨基酸置换，前提是后者包含与受体FcR结合的功能性结构域和优选地与受体Fc化结合的 功能性结构域。特别地，当抗体是IgG时，它可W包含意在增强与受体Fc丫RIII(CD16)结 合的突变，如W0 00/42072、aiields等人，- 2001、Lazar等人，- 2006、W0 2004/029207、 W0/200406335UW0 2004/074455中所述。也可W存在允许增强与受体Fc化结合和 因此增强体内半寿期的突变，例如化ields等人，- 2001、Dall'Acqua等人，- 2002、 Hinton等人，-2004、Dali'Acqua等人，-2006 (a)、W0 00/42072、W0 02/060919A2、W0 2010/045193、或WO2010/106180A2中所描述。可W存在或不存在其他突变，如允许减 少或增加与补体蛋白结合并因此减少或增加CDC反应的那些突变（参见W0 99/51642、W0 2004074455A2、Idusogie等人，- 2001，Dali'Acqua等人，- 2006(b)和Moore等人，-2010)〇
[0064] "单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"意指包含具有相同和独特抗原特异性的抗 体分子的组合物。该组合物中存在的抗体分子可W在它们的翻译后修饰，和尤其在其糖基 化结构或其等电点方面变动，但是全部由相同的重链序列和轻链序列编码并且因此在任何 翻译后修饰之前具有相同的蛋白质序列。然而，蛋白质序列中与翻译后修饰（如例如切割 重链C末端赖氨酸、天冬酷胺残基脱酷胺化和/或天冬氨酸残基异构化）相关的某些差异 可W在组合物中存在的各种抗体分子之间存在。
[0065] 在本发明范围内作为药物使用的组合物中存在的单克隆抗体可W有利地是嵌合 的，人源化的或人的。实际上，运有可能避免患者对所施用抗体产生免疫反应。
[0066] "嵌合"抗体意指一种抗体，所述抗体含有衍生自给定物种抗体的天然可变区（轻 链和重链），所述天然可变区与针对所述给定物种为异源的物种的抗体轻链和重链的恒定 区结合。有利地，如果作为本发明药物使用的单克隆抗体组合物包含嵌合单克隆抗体，则后 者包含人类恒定区。始于非人类抗体，嵌合抗体可W通过使用本领域技术人员熟知的遗传 重组技术制备。例如，可W通过针对重链和轻链而克隆包含启动子和编码非人类抗体可变 区的序列和编码人抗体恒定区的序列的重组DNA，产生嵌合抗体。就用于制备嵌合抗体的方 法，例如可W参考文献Verhoeyn等人，-1988。
[0067] "人源化"抗体意指一种抗体，所述抗体含有衍生自非人类来源的抗体的CDR区，抗 体分子的其他部分衍生自一种（或几种）人抗体。另外，可W修饰主链区段（称作FR)的 某些残基W保留结合亲和力（Jones等人，-1986 ;Verhoeyen等人，-1988 ;Riechmann等 人，- 1988)。本发明的人源化抗体可W通过本领域技术人员已知的技术制备，如"CDR移 植"、"表面重塑"、超人源化、"Humanstringcontent"、"FR文库"、"导向选择"、"FR改组" 和"人类工程化（Humaneering)"技术，如Almagro等人，-2008的综述中总结。
[006引"人"抗体意指其完整序列是人源的抗体，即已经通过重组编码抗体的人基因产生 其编码序列的抗体。实际上，现在可W产生当免疫时能够在不产生内源免疫球蛋白的情况 下产生完整成套人抗体的转基因动物（例如小鼠）（参见化kobovits等人，-1993 (a)和 化）；E5;rugge;rmann等人，-1993 ;和Duchosal等人，-1992,美国专利5, 591, 669, 5, 598, 3 69, 5, 545, 806, 5, 545, 807, 6, 150, 584)。人抗体也可W从隧菌体展示库获得化oogenboom等 人，-1991 ;Marks等人，-1991 ;Vau曲an等人，-1996)。
[0069]抗体可W具有几种同种型，运取决于其恒定区的性质：恒定区丫、a、y、e和5 分别地对应于IgG、IgA、IgM、I姐和I曲免疫球蛋白。有利地，在本发明范围内作为药物 使用的组合物中存在的单克隆抗体是IgG同种型。实际上，运种同种型显示在最大数目个 体（人）中产生ADCC("抗体依赖的细胞毒性"）活性的能力。丫恒定区包括几个亚型： 丫 1、丫 2、丫 3 (运=个类型的恒定区具有结合人补体的特殊性）和丫 4,因而产生亚型IgGl、 IgG2、IgG3和IgG4。有利地，在本发明范围内作为药物使用的组合物中存在的单克隆抗体 是同种型IgGl或IgG3,优选地是IgGl。
[0070] 可W通过本领域技术人员熟知的技术，由细胞克隆、非人类转基因动物或转基因 植物产生单克隆抗体的组合物。
[0071] 尤其，产生组合物的细胞克隆可W通过3项主要技术获得：
[0072] 1)通过产生目的抗体的B淋己细胞与永生化细胞系融合获得杂交瘤，
[0073] 2)通过化stein-Barr病毒巧BV)，使产生目的抗体的B淋己细胞永生化，
[0074] 3)分离编码目的抗体（通常从杂交瘤或永生化B淋己细胞）的序列，在一个或几 个载体中克隆编码抗体重链和轻链的表达序列，用表达载体转化细胞系并分离获得的不同 细胞克隆。抗体重链和轻链的表达载体包含表达编码抗体重链和轻链的序列所需要的元 件，并且尤其包含启动子、启动转录的密码子、终止序列和调节转录的合适序列。运些元件 根据用于表达的宿主变动并且由本领域技术人员在考虑其常识情况下容易地选择。载体尤 其可W是质粒或病毒。转化技术也是本领域技术人员熟知的。
[0075] 最常使用编码抗体重链和轻链的序列的一个或几个表达载体转化细胞系，尤其为 了获得嵌合抗体或人源化抗体。
[0076] 转化的细胞株系优选地是真核来源并且可W尤其选自昆虫、植物、酵母或哺乳动 物细胞。随后可W通过在合适条件下培育宿主细胞产生抗体组合物。产生抗体的合适细 胞系尤其包括选自W下的细胞系：SP2/0 ;YB2/0 ;IR983F;人骨髓瘤Namalwa ;PERC6 ;CH0 系、尤其C册-K- 1、C册-LeclO、C册-Lecl、C册-Lecl3、C册Pro-5、C册化打-或两个 等位编码基因即T8基因和/或GMD基因缺失的CHO系；Wil - 2 ;化rkat ;Vero ;MoIt - 4 ; COS - 7 ;293-肥K ;BHK ;K細6 ;NS0 ;SP2/0 - Agl4、P3X63Ag8. 653、鸭胚细胞系EB66饭 (Vivalis);和大鼠肝癌系H4-II-E值SM ACC3129)、H4-II-Es值SM ACC3130)(参见WO 2012/041768)。在一个优选实施方案中，抗体在W下细胞系之一中产生：YB2/0;两个等位 编码基因即T8基因和/或GMD基因缺失的C册系；胚胎鸭细胞系E.B㈱@ (Vivalis);和 大鼠肝癌系H4 -II-E值SMACC3129)、H4 -II-Es值SMACC3130)。在一个优选实施方案 中，抗体在YB2/0(ATCC邸L- 1662)中产生。
[0077] 备选地，抗体组合物可W在非人类转基因动物中产生。
[0078] 可W通过在受精卵中直接注射目的基因（运里，编码抗体重链和轻链的重排基 因）获得非人类转基因动物（Gordon等人，- 1980)。也可W通过W下方式获得非人类 转基因动物：在胚胎干细胞中引入目的基因（运里，编码抗体重链和轻链的重排基因）并 通过嵌合体聚集法或嵌合体注射法制备动物（参见ManipulatingtheMouseEmkryo,A LaboratoryManual,第 2 片反,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1994)；Gene Targeting,APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress(1993))。也 可W通过下述克隆技术获得非人类转基因动物，其中将已经引入目的基因（运里，编码抗 体重链和轻链的重排基因）的细胞核移植入去核的卵中（Ryan等人，-1997 ;Cibelli等 人，- 1998，W0 0026357A2)。可W通过上述方法制备产生目的抗体的非人类转基因动物。 抗体随后可W在转基因动物中积累并收获，尤其从该动物的乳或卵收获。关于在非人类转 基因动物的乳中产生抗体，制备方法尤其在W09004036AUW09517085A1、W0 0126455A1、 WO2004050847A2、WO2005033281A2、WO2007048077A2 中描述。从乳纯化目的蛋白的 方法也是已知的（参见W0 0126455A1、W0 2007106078A2)。目的非人类转基因动物尤其 包括小鼠、兔、大鼠、山羊、牛（尤其奶牛）和家禽（尤其鸡）。
[0079] 抗体组合物可W在转基因植物中产生。已经在转基因植物中产生许多抗体并且 获得表达目的抗体的转基因植物和回收抗体所需的技术是本领域技术人员熟知的（参见 Stoger等人，- 2002,Fisher等人，- 2003,Ma等人，- 2003,Schil化erg等人，- 2005)。 还可能影响植物中获得的糖基化W便获得接近于天然人抗体的糖基化（无木糖）并且进一 步轻微岩藻糖化，例如借助小干扰性RNA(Forthal等人，-2010)。
[0080] 在允许获得根据本发明用作药物的单克隆抗体组合物的该方法步骤b)中，通过 层析将步骤a)中获得的组合物分级分离，分离在步骤a)中获得的组合物中存在的抗体的 不同电荷同工型。
[0081] 如引言中解释，由细胞克隆、非人类转基因动物或转基因植物产生的任何单克隆 抗体组合物W存在相同单克隆抗体的某种数目的电荷同工型或变体为特征。运些不同电 荷同工型或变体的存在与存在导致抗体表面电荷特性改变的翻译后修饰相关，所述改变通 过修饰带电荷基团的数目直接引起，或通过引入结构性修饰间接地引起，所述的结构性修 饰本身调整带电荷残基的局部分布或改变它们的地a。每种电荷同工型或变体W其等电 点（pl，进一步称作等电氨电势（pHI))为特征，所述等电点对应于运种分子的总体电荷是 零时的抑（氨电势）或，换而言之，分子呈电中性（两性离子形式或混合型离子）时的抑。 在给定的抑，单克隆抗体的不同电荷同工型或变体将因此具有可变净电荷，pi小于携带负 电荷的抑的那些同工型或变体（分子趋向于放出其质子至碱性介质），pi等于中性抑的 那些同工型或变体，和pi大于携带正电荷的抑的那些同工型或变体（分子趋向于保留其 质子或从酸性介质捕获一些质子）。单克隆抗体的不同电荷同工型或变体W可变比例存 在，运取决于每种变体上存在的翻译后修饰的频率。单克隆抗体组合物通常包含主要变体 或同工型，伴随多种所谓的酸性或碱性变体或同工型，运取决于它们的pi是否小于或大于 主要同工型的pi。取决于抗体、其产生模式和它可能已经经历过的纯化步骤，酸性同工型、 主峰和碱性同工型的比例（从离子交换层析的层析图计算）通常围绕W下值变动：1〇%至 30%的酸性同工型、50%至75%的主峰和8%至20%的碱性同工型（参见Farnan等人，-2009,Rea等人，-2011，Rea等人，-2012,Khawli等人，-2010,Zhang等人，-2011、WO 2011/009623,和EP1308456)。
[0082] 因为就pi和给定抑时的净电荷而言它们存在差异，所W可W通过不同层析技术 分离给定抗体组合物中存在的抗体的电荷同工型。
[0083] 层析是一项基于运行的流动相和静止相（或固定相）之间行为差异而分离化学物 质（液态或气态均匀混合物）的技术。层析方法可W根据所用的相或根据分离中所用的现 象的性质划分。
[0084] 在本发明的一个实施方案中，通过离子交换层析实现步骤b)的分级分离。实际 上，运允许分离相同蛋白质的电荷同工型。在离子（阴离子或阳离子）交换层析中，将引起 不同组分分离的参数是它们的净电荷。
[0085] 首先将抗体组合物加载于离子交换树脂上。为此，使用带正电荷（阴离子交换层 析）或带负电荷（阳离子交换层析）的树脂（固定或静止相）。其电荷与树脂离子的电荷 相反的分子将留下/固定在树脂上。
[0086] 可W使用本领域技术人员已知和适于分离目的抗体组合物的任何类型的阳离子 或阴离子交换树脂（无论强或弱）。取决于其蛋白质序列，抗体组合物的平均等电点（Pl)通 常在5和9之间变动，最经常在7和9之间变动。对于大于8的pl，使用阳离子交换树脂。 相反，对于小于6的pl，使用阴离子交换树脂。对于在6和8之间所包含的pl，可W测试两 种类型的离子（阳离子或阴离子）交换树脂。因此，即便最经常使用阳离子交换层析（带 负电荷的树脂），接着用离子力梯度洗脱，在某些情况下仍可能使用阴离子交换层析（带正 电荷的树脂）。
[0087] 离子交换树脂通常由其上接枝有带正电荷基团（阴离子交换树脂）或带负电荷基 团（阳离子交换树脂）的交联聚合物或凝胶组成。交联聚合物或凝胶尤其可W选自葡聚糖 (例如Sephadex⑧）、琼脂糖（例如Sepharose⑧）、纤维素、甲基丙締酸醋聚合物（例 如Frato备她琴、乙締基聚合物（例如Frac化prep⑥）如聚（苯乙締二乙締基苯）（例 女曰Monobeads?;Source?;BioM油NP- 5 或NP- 10 ;S巧axAntibodix?NP1. 7、NP3、NP5 和 NPIO)〇
[0088] 凝胶可W有利地作为平均直径在10和200ym之间的小珠出现。
[0089] 对于阳离子交换树脂，将带负电荷基团接枝于交联聚合物上，如横丙基（S巧型、 甲基横酸醋（巧型或簇甲基（CM)型基团。
[0090] 对于阴离子交换树脂，将带正电荷基团接枝于交联聚合物上，如季锭型怕)、尤其 季氨乙基（QAE)、二乙基氨基乙基值EAE)、二甲基氨基乙基值MAE)、S甲基氨乙基灯MA巧或 二甲基氨基丙基（AN讶型基团。
[0091] 可W在本发明范围内使用的阳离子交换树脂包括树脂SourceTM15S或30S、 Mono-S(GELifeSciences销售）；ProPac⑥WCX(尤其ProPac⑧WCX_10 )、ProPac麽説策（尤其ProPac⑩SCX-10或sex-20)、ProSwiftwcx、 MAbPac⑧sex(尤其MAbPac?SCX-10 )值ionex销售）巧ioM油（尤其Bio MabNP- 5 或NP- 10，Agilent销售）、F*L-SCX(Agilent销售）；S巧axAntibodix?(尤其 S巧axAntibodix?NPl. 7、NP3、NP5 和NPIO)(Sepax销售）（参见Farnan等人，-2009， Khawli等人，-2010，Gan化i等人，-2011，Zhang等人，-2011，Rea等人，-2011 和McAtee等人，-2012)。另外可W在本发明范围内使用的阴离子交换树脂包括树脂 Source?15Q或 30Q、Mono?-Q(GELifeSciences销售）；ProPaC唆)WAX(尤其 ProPac⑩WAX-10)、ProPac?SAX(尤其ProPac⑧SAX-10)值ionex销售）。
[0092] 一旦抗体组合物加载于离子交换树脂上，不同的洗脱方法可W用于分离电荷同工 型。
[0093] 固定分子的洗脱可W尤其通过使用含有其电荷与树脂离子的电荷相反的离子的 洗脱缓冲液（流动相）实现，所述离子将与固定的分子竞争与树脂带有的电荷相互作用。 可能直接使用含有高离子浓度的缓冲液（为了一次性洗脱全部分子）或相反逐渐地增加离 子浓度（运种离子浓度则称作离子力梯度），运有可能根据不同分子与树脂的静电相互作 用力，使运些分子依次脱离。实践上，在后一种情况下，使用两种缓冲液，一种具有低离子浓 度和另一种具有高离子浓度。根据随时间变动的比率，两台驱动累吸入并混合运两种溶液 (强离子浓度溶液的比例逐渐增加）。将运种混合的产物用于柱中。在Gamlhi等人，-2011 中描述了W运项技术分