分。
[0140] 可W通过上述方法获得并且意在作为药物使用的抗体组合物可W用于可用单克 隆抗体治疗的任何病变中，尤其当通过ADCC或通过CDC破坏祀细胞可用于治疗时。
[0141] 如今，已知ADCC是被动免疫疗法治疗的临床效率的重要机制，所述被动免疫疗 法治疗借助意在治疗癌症的抗体进行（Wallace等人，-1994 ;Velders等人，-1998 ; Cartron等人，- 2002;Ianello等人，- 2005;Weine;r等人，-2010)，W防止化esus阴 性孕妇中的同种异体免疫度6liard等人，- 2008)。另外，还已知ADCC反应在针对病毒 (Ahmad等人，-1996,Miao等人，-2009)、细菌（A化recht等人，-2007;Casadevall等 人，- 2002)和寄生虫狂eitlin等人，- 2000)的抗感染反应中发挥明显作用。另外，在自 身免疫疾病的情况下，新疗法旨在移除负责攻击的免疫细胞，如B或T淋己细胞，例如，ADCC 随后发挥高度明显的作用巧dwards等人，-2006 ;化an等人，-2010)。
[0142] 还已知CDC反应在各种病理学中并尤其在治疗癌症中重要。
[0143] 因此，在作为本发明药物使用的组合物中，该抗体有利地针对健康供体细胞上存 在的非遍在抗原、癌细胞抗原、病原体感染的细胞的抗原或免疫细胞的抗原。
[0144] 特别地，优选W下实施方案：
[0145]-该抗体是抗MiesusD抗体（尤其Roledumab、阿托木单抗（atorolimumab)或莫 罗木单抗（morolimum油）并且组合物意在预防化esus阴性个体中的同种异体免疫，
[0146]-该抗体针对癌细胞的抗原并且组合物意在治疗癌症，
[0147]-该抗体针对病原体感染的细胞的抗原并且组合物意在治疗由所述致病生物所致 的感染，
[014引-该抗体针对免疫细胞的抗原并且组合物意在治疗自身免疫疾病。
[0149] 在治疗癌症的情况下，抗体尤其可W针对W下抗原：CD20、Her2/neu、CD52、 EGFR、EPCAM、CCR4、CTLA- 4(CD152)、CD19、CD22、CD3、CD30、CD33、CD4、CD40、CD51 (整联 蛋白a-V)、CD80、CEA、FR-al地a、GD2、GD3、HLA-DR、IGF1R(CD221)、憐脂酷丝氨酸、 SLAMF7 (CD319)、TRAIL-Rl、TRAIL-R2。
[0150] 更具体地，下表1中指出因其治疗意义而著称的特定（抗原/癌症）对（具有运 种抗原特异性的抗体在至少一个国家获批用于治疗所提到的癌症或临床试验正在实施）。
[0151] 表1.有意义的特定（抗原/癌症）对
[0152]
[0153]
[0154]
[01巧]在治疗致病生物感染的情况下，抗体尤其可W针对W下抗原：艰难梭菌(Clostridiumdifficile)抗原、金黄色葡萄球菌（Staphylococ州Saureus)抗原（尤其 ClfA和脂憐壁酸）、巨细胞病毒抗原（尤其糖蛋白B)、大肠杆菌巧scherichiacoli)抗原 (尤其志贺样毒素，根据单位IIB)、呼吸道合胞体病毒抗原（尤其蛋白F)、乙型肝炎病毒抗 原、甲型流感病毒抗原（尤其血凝素）、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)血清型 IATSOil的抗原，狂犬病病毒抗原（尤其糖蛋白）、憐脂酷丝氨酸。
[0156] 更具体地，下表2中指出因其治疗意义而著称的特定（抗原/癌症）对（具有运 种抗原特异性的抗体在至少一个国家获批用于治疗所提到的感染性疾病或临床试验正在 进行）。
[0157] 表2特定（抗原/感染性疾病）目的对 [015引
[0159]
[0160] 在治疗自身免疫疾病的情况下，抗体尤其可W针对W下抗原：CD20、CD52、CD25、 CD2、CD22、CD3和CD4。更具体地，下表3中指出因其治疗意义而著称的特定（抗原/自身 免疫疾病）对（具有运种抗原特异性的抗体在至少一个国家获批用于治疗所提到的自身免 疫疾病或临床试验正在进行）。
[0161] 表3.特定（抗原/自身免疫疾病）目的对
[0162]
[0163] 意图用作本发明药物的抗体组合物尤其意图作为设及ADCC反应的治疗药，所述 ADCC反应包括如上文详述的诸多情况。因此有利的是还已经通过其他手段优化运些抗体 W借助Fc丫RIII受体尽可能强地在体内诱导ADCC反应。因此，在一个有利的实施方案 中，在作为本发明药物使用的组合物中，抗体包含增强其与Fc丫RIII受体结合和其借助 FcrRIII受体的效应子特性的Fc片段的修饰。
[0164]目前已经描述了借助Fc丫RIII受体优化ADCC活性的两种主要手段：
[0165]-在Fc片段的某些氨基酸残基处插入至少一个突变，尤其如W0 00/42072、 Shields等人，- 2001、Lazar等人，- 2006、W0 2004/029207、W0/200406335UW0 2004/074455 中描述。
[0166]-优化Fc片段中每条重链的Asn297残基连接的N-聚糖的性质。
[0167] 因此，在一个有利的实施方案中，用作本发明药物的组合物包含单克隆抗体，其 序列已经在Fc片段的至少一个氨基酸残基处修饰W增强与Fc丫RIII受体的结合，如wo 00/42072、aiields等人，- 2001、Lazar等人，- 2006、WO 2004/029207、W0/2004063351、 WO 2004/074455中所述。特别地，将Fc的W下位置处的突变描述为允许针对Fc丫RIII受 体的亲和力增加和借助运种受体诱导ADCC的能力增加：219、222、224、239、247、256、267、 270、283、280、286、290、294、295、296、298、300、320、326、330、332、333、334、335、339、360、 377、396。
[016引特别地，将W下取代描述为允许针对Fc丫RIII受体的亲和力增加和借助运种受 体诱导ADCC的能力增加：S219Y、K222N、肥2化、L234E、L234Y、L234V、L23抓、L235S、L235Y、 L235I、S239D、S239T、V240I、V240M、P247L、T256A、T256N、V264I、V264T、V266I、S267A、 D270E、D280A、D280K、D280H、D280N、D280T、D280Q、D280Y、V282M、E283Q、N286S、K290A、 K290Q、K290S、K290E、K290G、K290D、K290P、K290N、K290T、K290S、K290V、K290T、K290Y、 E294N、Q295K、Y296W、S298A、S298N、S298V、S298D、S298E、Y300I、Y300L、K320M、K320Q、 K320E、N325T、K326S、K326N、K326Q、K326D、K326E、A330K、A330L、A330Y、A330I、I332E、 I332D、E333A、E333Q、E333D、K334A、K3：MN、K3：MQ、K3：MS、K3：ME、K3：MD、K334M、K3：MY、 K3：MH、K3：MV、K3：ML、K3：MI、T335E、T335K、A339T、K360A、F372Y、I377F、V379M、P396H、 P396UD401V。
[0169]有意义的突变组合包括：E333A/K334A、T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/ K3：MA、S298A/E333A/K3：MA、S267A/D280A(WO 00/42072)、S239D/I332E、S239D/I332E/ A330L化azar等人，- 2006)、V264I/I332E、S298A/I332E、S23犯/I332E、S239Q/I332E、 S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、 S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/ A330L/I332E、S239E/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、 S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、 S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E(WO 2004/029207)。
[0170] 备选地或额外地，作为本发明药物使用的单克隆抗体组合物包含低岩藻糖含量。 "岩藻糖含量"意指在每种抗体每条重链的Fc片段的Asn297残基连接的N-聚糖内部岩 藻糖化形式的百分数。"低岩藻糖含量"意指小于或等于65%的岩藻糖含量。实际上，如今 已知抗体组合物的岩藻糖含量在运种组合物借助Fc丫RIII受体诱导强烈ADCC反应的能 力中发挥关键作用。有利地，岩藻糖含量小于或等于65%、优选地小于或等于60%、55 % 或50%、或甚至小于或等于45%、40%、35%、30%、25%或20%。然而，岩藻糖含量不必要 应当为零，并且它可W例如大于或等于5%、10%、15%或20%。岩藻糖含量可W例如位于 5%和65%之间、5%和60%之间、5%和55%之间、5%和50%之间、5%和45%之间、5%和 40%之间、5%和35%之间、5%和30%之间、5%和25%之间、5%和20%之间、10%和65% 之间、10%和60%之间、10%和55%之间、10%和50%之间、10%和45%之间、10%和40% 之间、10%和35%之间、10%和30%之间、10%和25%之间、10%和20%之间、15%和65% 之间、15%和60%之间、15%和55%之间、15%和50%之间、15%和45%之间、15%和40% 之间、15%和35%之间、15%和30%之间、15%和25%之间、15%和20%之间、20%和65% 之间、20%和60%之间、20%和55%之间、20%和50%之间、20%和45%之间、20%和40% 之间、20%和35%之间、20%和30%之间、20%和25%之间。
[0171] 抗体组合物还可W具有不同类型的糖基化（寡甘露糖型或双天线状复杂型N-聚 糖，在双天线状复杂型N-聚糖情况下具有可变比例的对分N-乙酷葡糖胺（GlcNAc)残基 或半乳糖残基），前提是它们具有低岩藻糖含量。因此，寡甘露糖型N-聚糖可W通过在不 同糖基化抑制剂、如a1，2 -甘露糖巧酶I抑制剂（如脱氧甘露伊霉素或"DMM")或a-葡糖巧酶抑制剂（如粟精胺或"Cs")存在下培养或另外通过在CH0Lecl系中产生抗体来 获得。在转基因山羊的乳中生产还导致获得主要N-聚糖为寡甘露糖型的抗体，W具有一 个或两个半乳糖的岩藻糖化双天线状复合物形成作为次要形式，无任何对分型Glc化C并 且无唾液酸化（GIF或G2巧（参见W0 2007048077A2)。可W在大部分哺乳动物细胞中、还可 W在已经修饰其糖基化装置的细菌、酵母或植物中获得双天线状复杂型N-聚糖。为了限 制岩藻糖含量，可W使用负责在与Fc片段结合的GlcNAc上添加岩藻糖的酶即T8 (1，6 -岩 藻糖基转移酶）的活性天然低的细胞系；如细胞系YB2/0、鸭胚细胞系EB66⑧或大鼠肝癌 细胞系H4-II-E值SMACC3129)，H4-II-Es值SMACC3130)。也可W使用导致低岩藻糖含 量的其他基因的突变和其不足表达或过量表达导致低岩藻糖含量的细胞系，如CH0Lecl3 细胞系（GDP-岩藻糖合成减少的C册细胞系的突变体）。还可能选择目的细胞系并降低 或消除（尤其通过使用干扰性RNA或通过突变或缺失表达目的蛋白的基因）参与N-聚糖 岩藻糖化途径的蛋白质表达（尤其即T8,参见Yamane-化nuki等人，-2004 ;另外GMD，一 种参与转运GDP-岩藻糖的基因，参见Kanda等人，- 2007)。另一个备选方案在于选择目的 细胞系并过量表达或多或少干扰N-聚糖岩藻糖化的蛋白质，像蛋白质GnTIII(0 (1,4) -N-乙酷葡糖胺转移酶III)。特别地，尤其通过W下方式获得具有略微岩藻糖化N-聚糖 的抗体：
[017引?在YB2/0(参见EP1176195 A1、W0 01/77181、Shinkawa等人，- 2003)、CH0Lecl3(参见aiields等人，- 2002)、EB66敎(Olivier等人，-2010)或大鼠肝癌系 H4-II-E值SMACC3129)、H4-II-Es值SMACC3130)(参见W0 2012/041768)中生产。
[017引?在针对即T8的小干扰性RNA (Mori等人，-2004, Suzuki等人，-2007，Cardarelli等人，- 2009，Cardarelli等人，-2010，Herbst等人，-2010)，或GMD(编码 高尔基体中GDP-岩藻糖转运蛋白的基因，参见Imai-Nishiya等人，- 2007)存在下在野 生型CH0细胞系中生产
[0174] ?在C册细胞系中生产，该细胞系中编码1，6 -岩藻糖基转移酶的基因即T8的两 个等位基因已经被缺失（Yamane-化nuki等人，-2004)或编码高尔基体中GDP-岩藻糖转 运蛋白的GMD基因的两个等位基因已经被缺失化anda等人，- 2007)，
[017引?在其中编码酶GnTIlUe (1，4)-N-乙酷葡糖胺转移酶III)的基因通过转基因 技术过量表达OJmana等人，- 1999)的CK)细胞系中生产。除了低岩藻糖化之外，获得的 N-聚糖W高含量对分型Glc化C为特征。
[0176] ?在通过使用小干扰性RNA强烈降低P1，2 -木糖和a1，3-岩藻糖残基含量的转 基因植物（本氏烟草）中生产（Forthal等人，-2010)。
[0177] 与双天线状复杂型N-聚糖相比，寡甘露糖型N-聚糖具有缩短的体内半寿期。因 此，有利地，如上文定义，组合物中存在的抗体在其Fc片段的N-糖基化位点上具有岩藻糖 含量低的双天线复杂型聚糖结构。
[0178]特别地，单克隆抗体组合物可W具有大于60%的G0+G1+G0F+G1F形式含量和如上 文定义的低岩藻糖含量。它还可W具有大于65%的GO+GI+GOF+GIF含量和如上文定义的低 岩藻糖含量。它还可W具有大于70%的G0+G1+G0F+G1F含量和如上文定义的低岩藻糖含 量。它还可W具有大于75%的G0+G1+G0F+G1F含量和如上文定义的低岩藻糖含量。它还 可W具有大于80%的G0+G1+G0F+G1F形式含量和如上文定义的低岩藻糖含量。它还可W 具有大于60 %、65 %、70 %、75 %或80 %的G0+G1+G0F+G1F形式含量和小于50 %的G0F+G1F 形式含量。形式GO、GUG0F和GIF如下文定义：
[0179]
[0180] 运类抗体组合物尤其可W通过在W下细胞系中生产获得：YB2/0、CH0Lecl3、在针 对即T8或GMD的小干扰性RNA存在下培养的野生型C册细胞系、其编码1，6 -岩藻糖基转 移酶的基因即T8的两个等位基因或其编码高尔基体中GDP-岩藻糖转运蛋白的GMD基因的 两个等位基因已经被缺失的CK)细胞系。
[0181] 意图作为本发明药物使用的抗体组合物尤其还意图作为设及CDC反应的治疗药。 因此相对于通过Fc丫RIII增加活性的修饰额外或备选地，还可能有利的是还已经通过其 他手段优化运些抗体W借助蛋白质Clq尽可能强地在体内诱导CDC反应。在一个有利的实 施方案中，在作为本发明药物使用的组合物中，抗体包含增强其与蛋白质Clq结合和其借 助补体的效应子特性的Fc片段的修饰。
[0182]运类突变尤其在W下文献中描述：W02004074455A2、Idusogie等人，-2001、 Dali'Acqua等人，-2006 化）和Moore等人，-2010。
[0183] 本发明还设及层析分级步骤的用途，目的在于通过表达Fc丫RIII(CD16)受体的 免疫系统效应细胞，增加针对给定抗体的单克隆抗体组合物诱导表达所述抗原的祀细胞的 抗体依赖性细胞毒性（ADCC)的能力。
[0184] 因而获得的组合物具有改善的通过表达Fc丫RIII(CD16)受体的免疫系统效应细 胞和尤其通过天然杀伤细胞（或NK细胞）诱导对表达目的抗原的祀细胞的ADCC的能力。 优选地，用富含主峰同工型的组合物获得和用分级分离前组合物获得的ADCC水平的比例 R(由W下式限定）：
[018引是至少1. 15 (对应于ADCC水平增加至少15% );有利地至少1. 16 ;至少1. 17 ;至 少1. 18 ;至少1. 19 ;更有利地至少1. 20 ;至少1. 25 ;至少1.