Gw3965作为parp1抑制剂的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，尤其涉及将3-[3-[[[2-氯-3-(三氟甲基)苯基]甲基](2,2-联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐作为PARP1抑制剂的应用。
【背景技术】
[0002]3_ [3_ [ [ [2_氯_3_ (二氣甲基)苯基]甲基](2，2_联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐，简写为GW3965，分子量为618.51，化学式为C33H31C1F3N03.HC1，CAS号为405911-17-3。
[0003]GW3965属于羟化胆固醇类似物，具有降低胆固醇的作用。在目前已有的研究中主要作为肝脏X受体(LXR)的激动剂，即激活LXR，例如激活基因LXRa (肝脏X受体α亚型)，因此上述药物均被广泛应用于LXR相关的研究中。
[0004]1型多聚ADP核糖合成酶，简写为PARP1，PARP1是一种广泛表达于真核细胞的核酶。当细胞内氧化应激引起DNA断裂损伤时，PARP1通过结合断裂DNA发生构象改变而活化。活化的PARP1以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为底物，以其酶促作用通过转移腺苷二磷酸核糖(ADP)饰目标蛋白和自身(即多聚ADP核糖化反应)，从而改变目标蛋白和自身的生物学活性。目前应用于科研中的PARP1抑制剂有数种，其中最为常见的有:3_氨基苯甲酰胺(简写为3AB)，N-(6-氧代-5，6- 二氢菲啶_2_基)_2_(N，N- 二甲基氨基)乙酰胺盐酸盐(简写为PJ34)。而应用于临床药物试验的研究的PARP1抑制剂有BMN-673、CEP-9722、Rucaparib、KU-0059436、IN0-1001等，在肿瘤治疗及主动脉夹层等疾病治疗中有明确疗效。已有的研究认为胆固醇升高与肿瘤的发病率明确相关，但目前尚无胆固醇相关药物对此方面的证据。
【发明内容】
[0005]本发明提供3_ [3_ [ [ [2_氯_3_ ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2_联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的新用途，即作为1型多聚ADP核糖合成酶抑制剂进行应用。
[0006]本发明提供的技术方案如下:
[0007]3-[3-[ [ [2-氯_3_ ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2_联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(简写为GW3965)作为1型多聚ADP核糖合成酶抑制剂，可以抑制1型多聚ADP核糖合成酶的活性。
[0008]—种抑制1型多聚ADP核糖合成酶活性的方法，在该方法中，选用3-[3-[ [ [2-氯-3- ( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐作为1型多聚ADP核糖合成酶抑制剂，通过无细胞1型多聚ADP核糖合成酶酶促反应和/或利用离体细胞实验分别检测GW3965对1型多聚ADP核糖合成酶的活性的抑制作用。
[0009]通过实验验证，当所述3_[3_[[[2_氯_3_( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2_联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的浓度为1 μ mol/L至5 μ mol/L时，其对1型多聚ADP核糖合成酶的活性的具有抑制作用。
[0010]本发明还提出，3-[3_[ [ [2-氯-3-( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐作为治疗与1型多聚ADP核糖合成酶相关疾病的药物进行广泛应用。
[0011]本发明还提出，3_[3_[ [ [2-氯-3-( 二氣甲基)苯基]甲基](2，2-联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐作为治疗与1型多聚ADP核糖合成酶相关的心血管疾病药物的应用。
[0012]本发明具有的有益效果:
[0013]本发明通过实验首次证实了 GW3965这种羟化胆固醇类似物不仅可以作为LXR激动剂而且同时对PARP1有抑制作用，上述发现尚未有任何文献报道。上述GW3965作为胆固醇类似物并无通常肿瘤药物或其他PARP1抑制剂的细胞毒作用，可以预期其安全性。可以作为治疗胆固醇相关疾病如肿瘤等疾病的药物而广泛应用。
【附图说明】
[0014]图1-图5为本发明实验检测结果图。
[0015]图1 和图 2，Η印G2 细胞分别给予 GW3965(ii，l，3，5ymol/L)，或烟酸(iv，l，5，10 μ mol/L)刺激24小时。
[0016]图1包括图1A至图1B，分别为PARP1活性检测试剂盒检测测定PARP1活性；3AB(10mmol/L)作为阳性对照，烟酸作为阴性对照。与对照组相比，##P < 0.01。图1A为不同浓度的GW3965对PARP1活性的影响；图1B为不同浓度的烟酸对PARP1活性的影响。
[0017]图2中添加了不同浓度的GW3965利用蛋白印迹实验检测HepG2细胞全蛋白抽提物中的多聚核糖化蛋白表达程度。
[0018]图3中蛋白印迹实验显示在分别给予GW3965(l，3，5ymol/L，24h)的Η印G2细胞的全蛋白抽提物中多聚核糖化蛋白及PARP1表达程度。
[0019]图4和图5中在无细胞蛋白体系中，将重组组蛋白Η1与PARP1，NAD+，DNA和GW3965(1，3，5 μπιοΙ/L)进行孵育。
[0020]图4中PARP1活性检测试剂盒检测测定PARP1活性。与PARP1/NAD+/DNA组相比##P<0.01。图4包括图4A和图4B ;其中图4A为不同浓度的GW3965对PARP1活性的影响；其中图4B为不同浓度的烟酸对PARP1活性的影响。
[0021]图5蛋白印迹实验检测无细胞蛋白体系中孵育体系蛋白的多聚核糖化水平。
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0023]本发明实施例所涉及的方法，若无特别说明，均为本领域常规的实验方法，本领域技术人员采用常规的技术手段可以实现本发明实施例所述的实验方法。
[0024]以下实施例分别应用离体细胞实验和无细胞PARP1酶促反应体系研究三种药物对PARP1酶活性的抑制作用。
[0025]参考相关的文献(HuangD, Yang C,ffang Y, Liao Y，&Huang K.PARP-1 suppressesadiponectin express1n through poly(ADP-ribosyl)at1n of PPAR gamma in cardiacfibroblasts.Card1vascular research，2009，81 (1):98-107.)，分别构建了体外无细胞PARP1酶促反应体系及活性测定试验体系，以进行GW3965对PARP1活性的作用效果检测。
[0026]实施例中，所述3- [3- [[ [2-氯-3-(三氟甲基)苯基]甲基](2，2-联苯基乙基)氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(简写为GW3965)购自sigma，型号G6295-5MG。
[0027]实施例1利用无细胞PARP1酶促反应体系检测
[0028]利用PARP1活性检测试剂盒构建无细胞PARP1酶促反应体系，所述反应体系能在体外环境中激活PARP1酶的活性。
[0029]实施例中使用的PARP1活性检测试剂盒购自Trevigen公司，产地美国，型号为4676-096-Ko
[0030]PARP1活性检测试剂盒包括缓冲液、PARP1重组蛋白、NAD+、单链断裂DNA、重组组蛋白 1 (Histone HI)。
[0031 ] 按照PARP1活性检测试剂盒进行配置无细胞PARP1酶促反应体系，具体操作步骤如下:在缓冲液中加入50ng PARP1重组蛋白(PARP1 protein)、终浓度为10mmol/L NAD\终浓度为20mg/mL单链断裂DNA后。组成缓冲液的各组分在反应体系中的终浓度分别为:Tris-HCl (pH 8.0)的终浓度为100mmol/L、MgCl2的终浓度为20mmol/L、二硫苏糖醇的终浓度为lmmol/L。配置完成后，于37°C恒温箱中共孵育25分钟。
[0032]在上述无细胞PARP1酶促反应体系中，选用重组组蛋白1 (Histone HI)作为目标蛋白(所述Histone HI为PARP1重组蛋白的目标蛋白，能被多聚ADP核糖化修饰)，选用3-氨基苯甲酰胺(3AB)作为PARP1抑制剂并同时作为阳性对照药物，选用烟酸(nicotinicacid)作为