生，而这被消旋和光学活性二氢槲皮素两者显著地抑制（消 旋体：图4,光学活性：图5)。
[0364] 7)结论
[0365] 在WI-38细胞中，通过消旋和光学活性二氢槲皮素观察到二氢槲皮素对二甲双胍 诱导的乳酸产生的抑制效果。这表明二氢槲皮素在降低由二甲双胍给药导致的乳酸酸中毒 风险中的临床有效性。
[0366]【实施例11】在人胰腺癌细胞系AsPC-1中二氢槲皮素单药物对与癌症细胞增殖相 关的信号通路的抑制效果（体外）
[0367] 1)试验材料
[0368] 二氢槲皮素（(2R，3R)_二氢槲皮素和（2S，3S)_二氢槲皮素的外消旋体）购自 Bionet〇
[0369] 2)实验材料的制备
[0370] 将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备5和10mm〇l/L的二氢槲皮素 (最终浓度〇·5和lmmol/L)。
[0371] 3)细胞
[0372] 源自人胰腺癌的细胞系AsPC-1得自大日本制药株式会社（现在为大日本住友 制药株式会社，InVitro.1982;18:24-34)。将细胞在37°C，5%C02的条件下在10% FBS-RPMI1640培养基中培养。
[0373] 4)试验材料的添加和测量
[0374] 在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量 并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组（N= 3)如 下进行处理：
[0375] ⑴对照（载体对照）组：含1%乙醇的培养基
[0376](2)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0. 5mmol/L
[0377](3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素lmmol/L
[0378] 将传代培养的AsPC-1细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞 计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至1X1〇6个细胞/mL。将细胞以0. 5ml/孔接种 到12孔多孔培养板上，并在37°C，5%C02的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含 二氢槲皮素的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两 次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1 中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BPl(Thr37/Thr46) 蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对 磷酸-4E-BP1 (Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。
[0379] 5)统计分析
[0380] 结果显示为平均值（MEAN) 土标准偏差（SD)。
[0381] 为了评估二氢槲皮素对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的剂量依赖性，进行线性回 归分析。结果观察到了剂量依赖性。然后，在对照组和单药物处理组之间进行威廉姆 斯检验（Williams'test)(单侧）。结果，观察到不小于0. 5mmol/L的二氢槲皮素对相 对磷酸-4E-BP1蛋白含量的显著抑制作用。当在二氢槲皮素单药物处理组中的相对磷 酸-4E-BP1蛋白含量与对照组中的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量相比为显著的时，该药物被 判定为对该含量具有抑制作用。使用9. 3版SAS软件（日本SASInstitute公司）进行所 述分析。当P值小于〇. 05时认为差异是统计学上显著的。
[0382] 6)结果
[0383] 二氢槲皮素显示出对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的剂量依赖性抑制效果（图6)。
[0384] 7)结论
[0385] 在AsPC-1细胞中，观察到了二氢槲皮素单药物对增殖相关的信号通道的剂量依 赖性抑制效果。这表明二氢槲皮素在癌症化疗中的有效性。
[0386]【实施例12】通过在人胰腺癌细胞系AsPC-1中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对 癌干细胞的表面标记物表达的抑制效果（体外）
[0387] 1)试验材料
[0388] 二甲双胍购自和光纯药工业株式会社（WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。 二氢槲皮素（(2R，3R)_二氢槲皮素和（2S，3S)_二氢槲皮素的外消旋体）购自Bionet。吉 西他滨购自多伦多研究化学品公司（TorontoResearchChemicalsInc·)。
[0389] 2)实验材料的制备
[0390] 将二甲双胍溶解在蒸馏水中，并用10%FBS-RPMI1640培养基稀释来制备15mmol/ L的二甲双胍。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备0. 3mmol/L的二氢槲皮 素。将吉西他滨溶解在二甲基亚砜（DMS0)中，并用培养基稀释来制备100nm〇l/L的吉西他 滨。
[0391] 3)细胞
[0392] 源自人胰腺癌的细胞系AsPC-1得自大日本住友制药株式会社。将细胞在37°C， 5%C02的条件下在10%FBS-RPMI1640培养基中培养。
[0393] 4)试验材料的添加和测量
[0394] 各个组（N= 10)如下进行处理：
[0395] ⑴对照（载体对照）组：含1. 5 %蒸馏水、0· 3 %乙醇和0· 1 %DMS0的培养基
[0396](2)二甲双胍单处理组：二甲双胍15mmol/L
[0397] (3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.3mmol/L
[0398] (4)二甲双胍·二氢槲皮素组合处理组：二甲双胍15mmol/L+二氢槲皮素 0. 3mmol/L
[0399] (5)吉西他滨单处理组：吉西他滨100nmol/L
[0400] (6)二甲双胍?二氢槲皮素?吉西他滨组合处理组：二甲双胍15mmol/L+二氢槲 皮素0. 3mmol/L+吉西他滨100nmol/L
[0401] 将传代培养的AsPC-1细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细 胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2X104个细胞/mL。将细胞以3ml/孔接种 到6孔多孔培养板（IWAKI)上，并在37°C，5%C02的条件下培养过夜。第二天，将培养基 换为以给定浓度包含各个试验材料的培养基，并将细胞培养72小时。培养的最后，将细胞 用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。在用FACS(焚光激活细胞分选（fluorescence activatedcellsorting))缓冲液洗涤后，细胞用FITC标记的抗人0)44抗体和APC标记 的抗人⑶24抗体染色，并在4 °C处理30分钟。之后，细胞用FACS缓冲液洗涤，通过40微米 筛网过滤器，并用流式细胞仪（日本BectonDickinsonandCompany,Ltd.)测定⑶44和 ⑶24双阳性细胞的比例。
[0402] 5)统计分析
[0403] 结果显示为平均值（MEAN) 土标准偏差（SD)。
[0404] 为了评估二甲双胍和二氢槲皮素单处理组和组合使用组对⑶44和⑶24双阳性细 胞的比例的影响，进行未配对双因素方差分析来将对照组和各个材料单处理组和组合处理 组进行比较。为了评估吉西他滨单处理组对⑶44和⑶24双阳性细胞的比例的影响，进行史 蒂顿特t检验来比较对照组和吉西他滨单处理组。另外，为了评估吉西他滨、二甲双胍和二 氢槲皮素组合处理组相对于吉西他滨单处理组对⑶44和⑶24双阳性细胞的比例的影响， 进行史蒂顿特t检验来比较吉西他滨单处理组和吉西他滨、二甲双胍和二氢槲皮素组合处 理组。使用9. 3版SAS软件（日本SASInstitute公司）进行所述分析。当p值小于0· 05 时认为差异是统计学上显著的。
[0405] 6)结果
[0406] 与对照组相比，二氢槲皮素单处理组和二甲双胍和二氢槲皮素组合处理组显著降 低了AsPC-1细胞中的⑶44和⑶24双阳性细胞的比例。与对照组相比，吉西他滨单处理组 显著增加了AsPC-1细胞中的⑶44和⑶24双阳性细胞的比例。通过补充添加二甲双胍和 二氢槲皮素显著抑制了由单独添加吉西他滨导致的CD44和CD24双阳性细胞的比例增加。
[0407] 7)结论
[0408] 在胰腺癌细胞系AsPC-1上评估CD24和CD44双阳性细胞的比例（测定为在胰腺 癌中的癌干细胞）后，通过单独加入二氢槲皮素和组合加入二甲双胍和二氢槲皮素观察到 了显著降低。相反，观察到了由吉西他滨导致的所述双阳性细胞的比例的显著增加。另外， 通过组合加入二甲双胍和二氢槲皮素显著抑制了上述由单独添加吉西他滨导致的⑶44和 CD24双阳性细胞的增加。这些结果表明，取决于与吉西他滨治疗相关的癌干细胞富集的复 发风险的增加的临床问题可以通过组合使用吉西他滨和二氢槲皮素或者组合使用吉西他 滨、二甲双胍和二氢槲皮素来解决。
[0409] 工业实用性
[0410] 根据本发明，能够通过组合二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药 学上可接受的盐提供具有协同抗恶性肿瘤效果并减少副作用的药剂，其作为抗恶性肿瘤药 物是有效的。
[0411] 本申请基于在日本提交的第2013-110278号专利申请，该专利申请的内容在此整 体并入本文。
【主权项】
1. 一种药剂，其中组合了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可 接受的盐，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐包 含在单一制剂中，或者将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受 的盐分别配制成药物组合物并组合使用。2. 根据权利要求1所述的药剂，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素 或其药学上可接受的盐包含在单一制剂中。3. 根据权利要求1所述的药剂，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素 或其药学上可接受的盐分别配制成药物组合物并组合使用。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的药剂，其用于预防或治疗恶性肿瘤。5. 根据权利要求4所述的药剂，其中，所述恶性肿瘤为：儿童脑肿瘤，所述儿童脑肿瘤 选自星形胶质细胞瘤、恶性髓母细胞瘤、胚细胞瘤、颅咽管瘤和室管膜瘤；成人脑瘤，所述成 人脑瘤选自神经胶质瘤、胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经鞘瘤；头颈癌，所述头颈癌选自上 颂窦癌、咽癌、喉癌、口腔癌、唇癌、舌癌和腮腺癌；胸部癌症和肿瘤，所述胸部癌症和肿瘤选 自小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺瘤病和间皮瘤；胃肠癌和肿瘤，所述胃肠癌和肿瘤选自 食道癌、肝癌、原发性肝癌、胆囊癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胰腺 癌和胰腺内分泌肿瘤；泌尿器官癌和肿瘤，所述泌尿器官癌和肿瘤选自阴茎癌、肾盂?输尿 管癌、肾细胞癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾母细胞瘤和泌尿道上皮癌；妇科癌症和肿 瘤，所述妇科癌症和肿瘤选自外阴癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、绒毛膜癌、 阴道癌、乳腺癌、卵巢癌和卵巢生殖细胞肿瘤；成人和儿童软组织肉瘤；骨肿瘤，所述骨肿 瘤选自骨肉瘤和尤因瘤；内分泌组织的癌症和肿瘤，所述内分泌组织的癌症和肿瘤选自肾 上腺皮质癌和甲状腺癌；恶性淋巴瘤和白血病，所述恶性淋巴瘤和白血病选自恶性淋巴瘤、 非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、浆细胞肿瘤、急性髓样白血病、急性淋巴性白血 病、成人T细胞白血病淋巴瘤、慢性髓样白血病和慢性淋巴性白血病；和皮肤癌和肿瘤，所 述皮肤癌和肿瘤选自慢性骨髓增生性疾病、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌和蕈样 肉芽肿病。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的药剂，其用于治疗用除了二甲双胍或其药学上 可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂仅提供不充分疗效 的患者。7. 根据权利要求1至5中任一项所述的药剂，其中组合了一种或多种除了二甲双胍或 其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂。8. 根据权利要求6或7所述的药剂，其中，所述除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和 二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂为分子靶向药物、烷化剂、代谢拮 抗剂、植物生物碱、抗癌抗生素、激素剂或免疫治疗剂。9. 一种商品包装物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的药剂以及与其相关的 书面材料，所述书面材料描述了该药剂能够或应当用于预防或治疗恶性肿瘤。10. -种用于降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用的试剂，其包含二氢槲皮 素或其药学上可接受的盐作为活性成分。11. 一种二甲双胍或其药学上可接受的盐的抗恶性肿瘤作用的增强剂，其包含二氢槲 皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。12. -种用于降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用的试剂，其包含二氢槲皮 素或其药学上可接受的盐作为活性成分，与二甲双胍或其药学上可接受的盐一起组合使 用。13. -种包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分的抗恶性肿瘤作用的增 强剂，其与二甲双胍或其药学上可接受的盐一起组合使用。14. 二氢槲皮素或其药学上可接受的盐与二甲双胍或其药学上可接受的盐组合在制备 用于预防或治疗恶性肿瘤的药剂中的用途。15. -种预防或治疗恶性肿瘤的方法，其包括对有此需要的对象给药二甲双胍或其药 学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其中二甲双胍或其药学上可接受的 盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为单一制剂给药，或者作为同时或在不同时间点 给药的单独制剂给药。16. -种用于预防或治疗胰腺癌的药剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作 为活性成分。17. -种预防或治疗胰腺癌的方法，其包括对有此需要的对象给药二氢槲皮素或其药 学上可接受的盐。18. 二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为用于预防或治疗胰腺癌的药剂的用途。19. 二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗胰腺癌。20. 二氢槲皮素或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗胰腺癌的药剂中的用 途。21. -种胰腺癌干细胞抑制剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成 分。22. -种抑制胰腺癌干细胞的方法，其包括对有此需要的对象给药二氢槲皮素或其药 学上可接受的盐。23. 二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为胰腺癌干细胞抑制剂的用途。24. 二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其用于抑制胰腺癌干细胞。25. 二氢槲皮素或其药学上可接受的盐在制备胰腺癌干细胞抑制剂中的用途。26. -种药剂，其包含用于与二氢槲皮素或其药学上可接受的盐组合使用的二甲双胍 或其药学上可接受的盐。27. -种药剂，其包含用于与二甲双胍或其药学上可接受的盐组合使用的二氢槲皮素 或其药学上可接受的盐。
【专利摘要】本发明提供了一种能够降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用并用作抗恶性肿瘤剂的新型药剂，其中组合了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/155, A61K31/352
【公开号】CN105263484
【申请号】CN201480028924
【发明人】清野邦彦, 大西健司, 永滨康晴, 渡边隆司
【申请人】大塚制药株式会社
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年5月23日
【公告号】CA2912881A1, EP3003296A1, US20160101082, WO2014189152A1