叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法，可进一步 应用于食品、药品、化妆品等领域。
【背景技术】
[0002] 姜黄素（curcumin, Cur)是从姜黄根莖中提取的低分子量多酸类化合物，作为一 种常见的着色剂、香料和防腐剂被应用于食品和化学工业。姜黄素因其具有诸多生理活性， 如抗氧化、抗炎症、抗菌、抗病毒和抗癌症等生物活性，但是，姜黄素的水溶性差、热稳定性 差，在弱碱性和生理环境下不稳定，口服生物利用率极低，限制了其在食品和制药工业中的 应用。随着包埋技术的发展，微胶囊、胶束、复合物纳米粒子、微乳和脂质体（liposomes)等 被用来包埋姜黄素，旨在提高其生物利用率和扩大其应用范围。
[0003] 脂质体主要成分是磷脂和胆固醇，具有良好的生物相容性，可以运载亲水性的、亲 脂性的和两性的药物、营养素、功能性因子等。叶酸（folic acid，FA)即蝶酰谷氨酸，存在 于大多数蔬菜中，是人体必需的B族维生素，且叶酸受体在多种肿瘤细胞中过度表达，叶酸 作为癌细胞靶向分子被广泛研究。在N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基 碳乙二胺盐酸盐的催化作用下，壳聚糖（chitosan，CS)分子的氨基可以和叶酸发生酰化反 应产生叶酸-壳聚糖复合物，可通过静电相互作用修饰在脂质体表面。
[0004] 薄膜分散法是脂质体制备最经典的方法，该法更适合包埋脂溶性药物。动态高压 微射流设备可产生100~300MPa的静压力，使得物料发生强剪切粉碎、高速撞击、气蚀、振 荡和膨化等作用。薄膜分散结合动态高压微射流法可获取稳定均一的小粒径脂质体。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术不足提供一种为优化叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳 米脂质体的制备方法，以提高脂质体的稳定性，评价叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体 的储存稳定性和缓释性能，为叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的开发提供理论依据和 技术参考。
[0006] 本发明所述方法包括下列步骤：
[0007] (一）叶酸-壳聚糖复合物的合成：
[0008] (1)所用催化剂和各原料及其摩尔比为：N-羟基琥珀酰亚胺/1-(3-二甲氨基丙 基）-3_乙基碳乙二胺盐酸盐/叶酸/壳聚糖中氨基量=6:9:9:10,按上述摩尔比分别称 取N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙二胺盐酸盐和叶酸，将0. 150g/ mL浓度的叶酸溶于二甲基亚砜中，活化4h ;
[0009] (2)将浓度为0· 025g/mL的壳聚糖加入0· 3 %的冰醋酸溶液中，200r/min持续搅拌 至溶液清澈透明；
[0010] (3):将步骤⑴所得到的叶酸溶液缓慢加入到步骤⑵所得到的壳聚糖溶液中， 同时以200r/min持续搅拌反应16h ;
[0011] (4)用0· 1M氢氧化钠溶液将步骤（3)所得反应产物调至pH 9· 0,并转移至3. 5KDa 的透析袋中，于pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液即PBS中透析2天，再于蒸馏水中透析2天；
[0012] (5)将步骤（4)所得溶液冷冻干燥，得到黄色海绵状叶酸-壳聚糖复合物；
[0013] 全部操作均在避光环境下进行；
[0014] (二）薄膜分散一动态高压微射流法制备姜黄素纳米脂质体：
[0015] (1)脂质体原材料各组分及其重量百分比为：姜黄素0.05% -0.2%，大豆磷脂 1.4% -5. 6%，胆固醇 0.22 % -0.88%，吐温-800. 4 % -1.6%，其余的是 pH 6. 5 浓度为 0. 05M的磷酸盐缓冲溶液即PBS，为91. 7% -97. 9%;按上述重量百分比分别称取姜黄素、大 豆磷脂、胆固醇和吐温-80,在45°C水浴条件下，按lg大豆磷脂溶于15mL无水乙醇，使得各 组分完全溶解；
[0016] (2)将步骤（1)所得溶液于旋转蒸发仪上减压除去无水乙醇，形成均匀薄膜；
[0017] (3)加入pH 6. 5浓度为0· 05M的磷酸盐缓冲溶液（PBS)洗膜，形成黄色粗脂质体 悬浊液；
[0018] (4)用高压微射流均质机处理步骤（3)得到的脂质体悬浊液，压力为120MPa，处理 次数为2次，得到黄色透亮的姜黄素纳米脂质体溶液；
[0019] (三）叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的制备：
[0020] (1)叶酸-壳聚糖复合物与磷脂的重量比为1:16. 8 ;将步骤（一）得到的叶酸-壳 聚糖复合物按5mg/mL溶于1%的冰醋酸溶液中，200r/min持续搅拌至溶液清澈透明；
[0021] (2)按上述质量将步骤⑴所得溶液缓慢加入到步骤（二）所得姜黄素纳米脂质 体溶液中，300r/min持续搅拌反应2h，得到叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体。
[0022] 本发明的有益效果是：制备的叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体平均粒径 为103. 6±4. lnm，zeta电位为16. 35±3. 54mv，分散系数为0. 378±0. 01，载药量达到了 35. 7mg/g磷脂，在25°C储存稳定性良好，在pH 7. 4和pH 5. 5的环境下缓释性良好，且可通 过改变pH控制姜黄素的释放。
【附图说明】
[0023] 图1为叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的工艺路线示意图；
[0024] 图2 (a)为叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的粒径分布图；
[0025] 图2 (b)为叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的微观形貌图；
[0026] 图3为脂质体的缓释性能；
[0027] 图中：NLs-Cur和FA-CS-NLs-Cur分别表示姜黄素纳米脂质体和叶酸-壳聚糖修 饰姜黄素纳米脂质体。
【具体实施方式】
[0028] 原料：大豆磷脂（95 %，德国 lipoid GmbH)、胆固醇（Sigma. MKBF1936V)、吐 温-80(上海申宇医药）、姜黄素（98%，阿拉丁试剂上海有限公司）、壳聚糖（MW50000,脱酰 度90%，美国Sigma-Aldrich公司）、叶酸（阿拉丁试剂上海有限公司）、1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳乙二胺盐酸盐（阿拉丁试剂上海有限公司）、N-羟基琥珀酰亚胺（阿拉丁 试剂上海有限公司）。
[0029] 实施例1
[0030] (1)称取1.036g N-羟基琥珀酰亚胺、1.725g 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙 二胺盐酸盐和2. 648g叶酸，完全溶于溶于20mL二甲基亚砜中，放置活化4h。称取1. 46g壳 聚糖加入60mL 0. 3%的冰醋酸溶液中，200以11^11持续搅拌至完全溶解。将壳聚糖溶液缓慢 加入活化的叶酸溶液中，同时以200r/min持续搅拌反应16h。用0. 1M氢氧化钠溶液将所得 反应产物调至pH 9. 0,并转移至3. 5KDa的透析袋中，于pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液（PBS)中 透析2天，再于蒸馏水中透析2天，除去杂质。将透析后所得样品冷冻干燥，得到黄色海绵 状叶酸-壳聚糖复合物。
[0031] (2)称取0· 050g姜黄素、1. 400g大豆磷脂、0· 220g胆固醇、0· 400g吐温-80完全溶 解于28mL无水乙醇中，在45°C水浴条件下真空旋转除去乙醇，形成均匀薄膜。加入100mL pH 6. 5浓度为0.05M的磷酸盐缓冲溶液（PBS)洗膜，形成的均匀悬浊液即为粗脂质体。将 粗脂质体加入到DHPM中，于120MPa条件下微流化处理2次，即制备得到姜黄素纳米脂质 体。
[0032] (3)称取0. 050g步骤（1)所得叶酸-壳聚糖复合物溶于10mLl %的冰醋酸溶液中， 200r/min持续搅拌至溶液清澈透明，得到叶酸-壳聚糖复合物溶液。取60mL步骤（2)所得 姜黄素纳米脂质体缓慢滴加至10mL叶酸-壳聚糖复合物溶液中，300r/min持续搅拌反应 2h，得到叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体。制得的叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质 体为透明黄色溶液，载药量为35. 5mg/g磷脂，平均粒径为104. 9nm，zeta电位为16. 08mv， 分散系数为〇. 378 ;叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体在pH 7. 4环境下24h姜黄素释放 量为17. 3%，在pH 5. 5环境下24h姜黄素释放量为27. 5% ;25°C储存一个月，叶酸-壳聚 糖修饰姜黄素纳米脂质体的粒径、表面点位以及姜黄素含量无显著变化。
[0033] 实施例2
[0034] (1)称取0.259g N-羟基琥珀酰亚胺、0.431g 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳乙 二胺盐酸盐和〇. 662g叶酸，完全溶于溶于5mL二甲基亚砜中，放置活化4h。称取0. 3650g 壳聚糖加入15mL 0. 3%的冰醋酸溶液中，200以11^11持续搅拌至完全溶解。将壳聚糖溶液缓 慢加入活化的叶酸溶液中，同时以200r/min持续搅拌反应16h。用0. 1M氢氧化钠溶液将所 得反应产物调至pH 9. 0,并转移至3. 5KDa的透析袋中，于pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液（PBS) 中透析2天，再于蒸馏水中透析2天，除去杂质。将透析后所得样品冷冻干燥，得到黄色海 绵状叶酸-壳聚糖复合物。
[0035] (2)称取0· 025g姜黄素、0· 700g大豆磷脂、0· 110g胆固醇、0·